Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Cite this Article

Copy Citation

Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknoloji daha önce zorlu uygulamaları ele potansiyel göstermiştir; dahil, primer immün hücrelerin, hücre yeniden programlanması, karbon nanotüp ve kuantum nokta teslim teslimat. Bu vektör içermeyen mikroakışkan platformu hedef maddenin sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için, hücre zarının mekanik parçalama dayanır. Burada, montaj cihazı, hücre hazırlama ve sistem çalışması dahil olmak üzere, bu mikroakışkan cihazlar için kullanımının detaylı bir yöntem tarif eder. Bu teslim yaklaşım cihaz tipi ve daha önce bildirilmemiş uygulamalar için çalışma koşulları kısa bir optimizasyon gerektirir. Bu sistem, özel tamponlar veya kimyasal modifikasyon / çekimi adımlar gerektirmez olarak verilen talimatlar çoğu hücre tipi ve dağıtım malzemeleri genellenebilir bulunmaktadır. Bu çalışma aynı zamanda sağlamaks cihazın performansını artırmak ve tıkanma, düşük bir uygulama randımanı, ve hücre canlılığı ile ilgili potansiyel sorunları sorunsuz çekmek için nasıl öneriler.

Introduction

Hücre sitoplazmaya makromoleküllerin teslim tedavi ve araştırma uygulamalarında önemli bir adımdır. Protein teslim 3 klinik ve laboratuar hem de 4 ortamlarında hücre fonksiyonunu etkileyen gelecek vaat eden bir araçtır ise Nanopartikül aracılı teslim, örneğin, gen terapi 1,2 potansiyel göstermiştir. Bu tür küçük moleküllü ilaçlar, kuantum noktaları veya altın nano partiküller gibi diğer malzemeler, 5,6 kanser tedavileri ikinci izleme 9, hücre içi etiketleme 7,8 ve tek bir molekül kadar uygulamalarda ilgi çekicidir.

Hücre zarı makromoleküllere ölçüde geçirimsizdir. Birçok mevcut olan tekniklerin büyük membran bozulması ya da endositoksik iletilmesini kolaylaştırmak için 10,11 polimerik nano parçacıklar, lipozomlar 12 ya da kimyasal değişiklikler 13 kullanır. Bu yöntemlerde, teslimat verimlilik ve hücre canlılığı th yapısına genellikle bağlıdıre hedef molekül, ve hücre türü. Bu yöntemler, böyle bir nükleik asit gibi, yapısal olarak tek tip malzemeler, doğum sırasında etkili olabilir, ancak genellikle bu tür proteinlerin ve 14,15 nanomalzemelerin 7 daha fazla yapısal olarak farklı malzemeler, teslimat için kötü uygundur. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu güveniyor endozom bozulma mekanizması dolayısıyla kesecik yapılarda 16 sıkışıp çok malzemeyi bırakarak, genellikle verimsiz. Son olarak, sık sık kurulan hücre hatları ile kullanım için geliştirilen yöntemler primer hücrelerde iyi tercüme etmeyin.

, Elektroporasyon 17,18 ve 19 sonoporation membran gözeneklendirme yöntemleri, bazı uygulamalarda, cazip bir alternatif olmakla birlikte, düşük hücre canlılığı neden olduğu bilinmektedir ve hedef dağıtım malzemesinin şarj ile sınırlı olabilir.

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon, teslimat microfluidic yaklaşım, son zamanlarda vardır demonstrbir hücrenin yeniden programlanması 20 ve nano malzeme teslimat 21 bağlamında, mevcut tekniklere göre avantajları ×. Bu yöntem, çevreleyen tamponu içinde bulunan maddelerin sitosolik iletilmesini kolaylaştırmak için hücre zarı o mekanik parçalama dayanır. Sistem daha önce hücre tipleri zorlu (primer immün hücreler ve kök hücreleri) ve malzemeleri (örneğin antikorlar ve karbon nanotüpler) potansiyeli sağlayan göstermiştir. Burada, hedef makromoleküllerin hücre içi iletimi için bu cihazların kullanımı için genel prosedür tarif edilmektedir. Ancak, daha önce bildirilmemiş uygulamalar için, bizim daha önce bildirilen tasarım kuralları 20 ayrıntılı olarak bir, koşulların kısa bir optimizasyon yapması tavsiye edilir; prosedür çoğu hücre tipleri ve dağıtım malzemeleri genellenebilir. Bugüne kadar, sistem RNA, DNA, altın nano-tanecikleri, kuantum noktaları, karbon nanotüp, protein verilmesi için başarılı bir şekilde kullanılmıştırs ve dekstran polimerleri 20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Depolama

  1. % 70 etanol rezervuarları, sahipleri, O-halkaları ve microfluidic cihazlar saklayın. Toz veya dışındaki parçacıkların buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için bir kapağa sahip bir kap (örneğin kavanoz veya kabı) kullanın. Üçüncü olarak, bir kap (1), rezervuar ve O-halkaları, ikinci bir kap (2) içinde ve sahipleri aygıtları yerleştirin (3).

Not: depolama için% 70 etanol kullanılması sterilite korumaktır. Çözeltinin tek bileşenleri, etanol ve su (yani hiçbir denatüre ajanlar) ise, bütün sistem bileşenleri uyumlu olmalı ve zamanla düşer değildir.

  1. Kapların (2) etanol çözeltisi değiştirmek ve (3) deney boyunca çapraz kontaminasyonu önlemek ve tıkanmaya neden olabilecek istenmeyen parçacıkların varlığını en aza indirmek için her kullanımdan önce.

2. Deney Hazırlama

  1. Bir yer kaplar (2) ve (3) bir ultrason banyosunda foHer kullanımdan önce r 5-10 dk. Bu, daha önceki deneylerden herhangi bir kirletici partikülleri temizlenmesine yardımcı olur.
  2. % 70 etanol çözeltisi ile biyogüvenlik kabini temiz çalışma alanı.
  3. Biyogüvenlik kabini içine yerleştirmeden önce% 70 etanol çözeltisi ile tüm malzemeleri (3 kaplar ve cımbız) püskürtün.

3. Montaj

  1. Çalışma alanında 2-3, az tüylü mendil aşağı ayarlayın.
  2. Cımbız ile kaptan plastik rezervuar çıkarın ve iç yüzeylerinden etanol çözeltisi buharlaşmasını kolaylaştırmak için silme bezlerinin üzerinde ayarlayın. Yavaşça yüzeyi üzerinde rezervuarlar dokunun ya da etanol çözeltisi çıkarılmasını kolaylaştırmak için bunların içinden hava darbe.
  3. Rezervuar üzerindeki uygun yuvaya O-halkalarını takın.
  4. İlgili kaplardan tutucu ve cips çıkarın ve etanol (~ 1-2 dk) buharlaşmasına izin verin.
  5. Tutucuya istenilen çip yüzü yukarı (up yani giriş delikleri) yerleştirmek için cımbız kullanın. Tutucu kaldırınçip emin çip tutucuya yatık olmasına yapmak ve gerekirse cımbız ile ayarlamak için göz hizası için birlikte. ÖNEMLİ: Cihaz tutucusuna doğru girmiyorsa, bu takip eden adımları sırasında kıracak bir risk vardır.
  6. Sonra, yavaşça tutucuya rezervuarları yerleştirin ve klipleri ile düzenleyiniz. O-ringler, bu süreçte kendi yuvalarından dışarı düşmemesi dikkatli olun.
  7. Yerine oturana kadar hafifçe rezervuar bastırın. Rezervuarların her iki tarafın güvenli ve yonga doğru konumda olması için görünür olduğundan emin olun.

4. Hücre Hazırlanması

  1. Yapışık hücrelerle (birincil veya kurulmuş hat) için: 1-2 gün önce deney plaka hücreler deney gününde en fazla% 80 konfluent şekildedir.
  2. (PBS veya ilgili ortam içinde) süspansiyon içinde hücrelerin koyun ve 1.0 x 10 6 hücre / ml 7 cel 10 x 1.0 arasında bir çalışma konsantrasyonu için amaçls / ml. NOT: Biz nedeniyle hücre konsantrasyonu teslimat performansında önemli bir değişiklik gözlenmedi değil.
  3. Deney için istenen malzeme konsantrasyonunu elde etmek için ayrı bir tüp içinde hücreleri ve arzu edilen malzeme dağıtım karıştırın. ÖNEMLİ: tarif dağıtım yöntemi teslim kolaylaştırmak için difüzyon dayandığından, daha yüksek bir malzeme konsantrasyon yüksek teslim verecektir. Mümkünse, ilk denemeler için arzu edilen bir malzeme 1 uM çözüm kullanmak tavsiye edilir. Gerektiği gibi bu konsantrasyon daha sonra gelecek deneylerde aşağı titre edilebilir. Bu cihaz ile kullanılan düşük bildirilen konsantrasyonu 10 nM 21'dir.

5. Operasyon

  1. Pipet bir rezervuar (güncel tasarım maksimum 150 ul kapasitesine sahiptir) içine hücreleri ve teslimat malzeme karışımı. NOT: Çoğu cihaz tasarımları nedenle kanallardan akış yönü önemli değil tamamen geri dönüşümlüdür. Örnekler, iki ya da rezervuar halinde yüklenebilir. Dolu hazneye basınçlı boru takın ve uygun sızdırmazlık (parmak sıkı genellikle yeterlidir) sağlamak için somunu sıkın.
  2. Regülatör üzerinde istenilen seviyeye basıncını ayarlayın. Bu hücreler cihazı ile seyahat hızını kontrol eder. Düğmesine basılana kadar hücre akışı başlamaz unutmayın.

NOT: Bir önceki çalışmada, nitrojen ya da sıkıştırılmış hava taşıyıcı gaz olarak eşit derecede iyi çalıştık.

  1. Göz seviyesine cihazı kaldırın ve rezervuar içindeki sıvı kolayca görünür şekilde onu yönlendirin. NOT: Rezervuar boşaltılır önce sistemi kapatmak için sıvı sütunu takip edin.
  2. Rezervuar basınç ve hücre akışını başlatmak için düğmesine basın.
  3. Sıvı seviyesi rezervuarın altından yaklaşık 2 mm olduğunda, hızlı bir şekilde akışını durdurmak için 0 psi regülatör açın. ÖNEMLİ: Rezervuar boşaltılır önce bir akışını durdurmak için başarısız olursa, bir Collectio gelen örnek püskürtülmesiyle risklerin rezervuar. Ayrıca sıvı kolonu bir kayda değer bir hızda hareket etmiyor, ya da başlangıç ​​akış hızı (örneğin 3x yavaş) esasen göreli yavaşladı ise, monte edilen cihaz, muhtemelen tıkanmış ve takas gerektiğini unutmayın. Tıkanmış bir cihaz işletim yüksek hücre ölümüne yol açabilir.
  4. Uygun hazneden muamele edilmiş hücreleri toplamak ve arzu edilen toplama tüpü / levha yerleştirin. ÖNEMLİ: gözeneklendirilmiş hücreler yukarı 10 dakika 20 için malzeme alımı devam edecek gibi bu aşamada herhangi tamponlarda toplanan hücreleri sulandırmak etmeyin. Bu pencere geçtikten sonra, istenen medya / tampon içinde hücreleri seyreltin.
  5. Gerektiği gibi 5.7 - Daha fazla işlenmiş hücreleri toplamak ya da alternatif deney koşulları denemek için tekrarlayın 5.1 adımları. Cips geri dönüşümlü olduğunu hatırlayın, bu nedenle numuneler rezervuar ya monte edilebilir. Yapışmasına neden gerektiği şekilde fiş alışverişi emin olun. Tıkanmış cihazları atın.

6. Sökme

  1. (1. bölümdeki ayrıntılı) uygun saklama kabının her parçayı yerleştirin.
  2. Bertaraf etmek için ayrı bir kap içinde kullanılan fiş yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, bu mikroakışkan dağıtım sisteminin bir şematik tanımlayıcı içerir. 2a-b Şekil floresan konjuge 3 kDa dekstran 20 varlığında farklı cihaz tasarımları ile HeLa hücrelerinin tedavisi tipik sonuçlar göstermektedir. Prosedür doğru takip edilirse, sistem performansı aygıt türü ve çalışma hızına duyarlı olacaktır. Bu nedenle, daha karmaşık deneylere başlamadan önce, belirli bir uygulama için bu koşulları optimize etmek gerekir. Şekilde gösterildiği çalışma koşulları aralığında, hücre canlılığı ancak, bir% 30 altında canlılığında neden olabilir optimal dağıtım parametreleri (örneğin, uygunsuz çipi türü) dikkat etmeliyiz,% 80 üstünde kalır. Böylece canlılığı ve dağıtım etkinliği daha önce rapor edilmemiş hücre tipi için eş zamanlı olarak optimize edilmelidir. Bir cihaz tasarım hedef hücre tipi için uygun değilse, kimse teslim yüksek c değişen sonuçlar göreceksinizell ölüm (örneğin% 10 canlılığı). Deney koşulları bildirin olsaydı, örneğin, hücre yüzeyine bağlı olan hedef madde, bir yüzey bağlanma sinyali sitoplazmik sinyal maske kadar doğru teslimat ölçmek mümkün olmayabilir.

Şekil 2c-d canlı hücre popülasyonu içinde verme etkinliğini ölçmek için tercih edilen bir yöntem açıklamaktadır. Şekil 2c'de kumanda durumunda hücreler, en azından uzun tedavi edilen durum olarak için dağıtım malzemesi maruz kalan tüm bağlayıcı yüzeye ve endositoksik etkisini yansıtmak için kastedilmektedir. Teslim hücre popülasyonunun, kontrol nüfusun sadece% 1-5 o bölge içinde kalan şekilde gölgesiz bölge olarak tanımlanır. Önceki iş bu yaklaşımda teslim endositoz 20 aracılık olmadığını kurmuştur unutmayın. Teslim örneğin gözlenen çift tepe dağıtım mutlaka sisteminin karakteristik değildir biz h gibiave, farklı deneysel koşullar için daha fazla ve daha az homojen dağılımı görülmektedir.

Şekil 1
Microfluidic cihazlar için tam bir sistem ve kendi arayüzü Şekil 1.. S chematic. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. HeLa hücreleri ile Örnek sonuç 20 a.) Teslim verimliliği ve kademeli mavi konjuge 3 kDa dekstran (0.2 mg / ml) varlığında, 3 değişik tasarımları ile muamele edilmiş HeLa hücreleri b) hücredeki mevcudiyetini göstermektedir. Bu deneylerde, hücre solution% 3 fetal bovin serum ve% 1 F68 pluronikleri içeren PBS içinde her bir mL'de 10 6 hücre konsantrasyonunda oldu. Canlılık ölü hücreleri ve dağıtım sonuç propidyum iyodür boyaması yolu ile ölçüldü canlı hücreler sadece için gösterilmiştir. Tüm veri noktaları üç çalıştırmak ve hata çubukları 2 SDS temsil edilmiştir. C) Hela hücreleri cihaz tedavi durum olarak zamanın en az aynı miktarda mavi konjuge 3kDa'lık dekstranı kaskad maruz kalan bir deneysel kontrol için temsili bir histogram. d) hücreler iletilmesini kolaylaştırmak için aygıt içinden geçirilmiş gelen durum. Histogramının gölgesiz bölgesinde olan canlı hücre nüfusun fraksiyonu 'teslim' nüfus olarak tanımlanır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anlatılan deney yöntemi (yonga tasarımı ve çalışma hızı dışında örneğin faktörler) bazı özellikleri sistem uygulanır hücre tipi ve dağıtım materyale bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Adreslerinin deneylerini tasarlarken dikkate en yaygın bazı faktörlerin aşağıdaki tartışma.

Floresan etiketli bileşikler için teslim sinyal geliştirmek için, bir eşiğe kaynaklarını ele gerekiyor. Yüzey bağlayıcı ve endositoz, örneğin, kültür ya da daha fazla işlem öncesi fazla malzemeyi uzaklaştırmak için doğum sonrası hücreler 5-10 dk yıkama ile ele alınabilir. Bir yıkama aşamasını vazgeçmek için seçilmesi, bu çözelti içinde çevreleyen hedef maddenin konsantrasyonunu düşürmek için istenen medyada 5-10x ile muamele edilmiş hücrelerin sulandırmak ve dolayısıyla endositoksik oranlarını düşürmek için en iyi olur. Bazı durumlarda, örneğin, protein temini için, tek bir gerekli aktif hücre YÜZEY engellemek için bulabilirce (örneğin, etiketsiz sığır serum albümini kullanılarak) Sevkiyat malzemenin spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için. Muamele edilmemiş durumda floresans yoğunluğu, akış sitometresi ile ölçülmüş olarak, endositoz kontrol birden fazla on yıl daha düşük ise, belirli bir uygulamada, daha sonra bağlayıcı / endositoz bir sorun olabilir yüzey. Arka plan sinyali ile ilgili sorunlar Sevkiyat malzemenin doğrudan floresan tespiti için sadece ilgili olduğuna dikkat endocytosed veya yüzeye bağlı malzeme genellikle etkin olduğu gibi, işlevsel tahlilleri (örneğin, hücre yeniden programlama), genellikle etkilenmez.

Muameleden sonra hücre canlılığını geliştirmek için, bir post-teslim işlem miktarını en aza indirmek gerekir. Bu bir aşırı santrifüj önlemek veya teslimat tamamlandıktan sonra bir kuluçka 5-10 dakika içinde istenen ortama adımları ve transfer hücreleri yıkayın önerilir. Yapışkan çizgileri, hücreler çoğu zaman tam yapıştırılır ve tedaviden sonra, 24 saat içinde bölünmesi. Tartışıldığı prev olarakiously 20, bu tekniğin kullanımından herhangi bir uzun vadeli yan etkiler görülmez.

Bu dağıtım sistemi kullanılan mikroakışkan cihazlar zaman tıkanmaya yatkındır. Bu aygıtta en dar özelliği olarak Clogs genellikle daralma da oluşturur. Tıkanma hasarlı hücreleri tarafından veya çevresel kirleticiler neden olabilir. Ikincinin etkisi aygıtları (örneğin bakımlı biyogüvenlik kabini) faaliyet için temiz, tozsuz bir ortam sağlanması ile minimize edilebilir. Elde edilen süspansiyon içinde hücre artıkları varlığını en aza indirmek için, hücre hatları için, teslimat için 1-2 gün önce hücreler pasajı önerilir. Cihazı çalıştırırken, bir rezervuar içindeki akışkanın hacimsel akış hızının dikkatli olmalıdır. Akış hızı başlangıç ​​hızının üçte altına düşerse, cihaz aşırı hücre ölümüne neden olabilir ve değiştirilmesi gerekir, ya da akış yönü tersine çevrilir. Potansiyel tıkanma sorunları da mitig edilebilir40 mikron hücre süzgecinden örgü ile hücre süspansiyonu geçerek ated. Bu işlem, bu şekilde çipin geniş, düşük akış hızı bölümlerde şekillendirme potansiyel tıkanıklıklarını engelleyen tek bir hücre süspansiyonu sağlar.

Farklı teslimat malzemeler için deney tasarlarken, bir hedef malzemenin büyüklüğü ve konsantrasyon için hesap gerekir. Bu teknoloji, parçalanmış hücre zarından malzemenin pasif difüzyon dayanır olarak, molar konsantrasyon gradyanı ile teslim malzemenin hidrodinamik çapı kütle transfer oranını belirleyecektir - membran aksamalar malzemeyi alacak kadar büyük varsayarak. Bu, daha küçük parçalar karşı göreli büyük bir hedef malzemelerin yüksek molar konsantrasyonlarda (örneğin, 1 uM) kullanılması bu nedenle tavsiye edilir. Bu teknik, kuantum dot teslimat 21 durumunda, 10 nM kadar düşük konsantrasyonlarda etkili teslimat göstermiştir. Ayrıca, bu teknik not malzeme boyut ve yayılma bağlamında dışında hedef dağıtım maddenin doğası ile sınırlı olduğu düşünülmektedir (yani düşük difüzyon malzemesi, daha düşük verimleri ve aksamalar boyutundan daha büyük malzeme muhtemelen sitoplazma giremez olacaktır).

Hücre tekrar programlanması ve kuantum nokta teslimat Çalışmalar Elektroporasyondan hücre sıkma yaklaşım göreceli güçlü gösterdik. Bu iki yöntemin de membran bozulma mekanizmaların mevcut anlayış göre, hücre sıkıştırıcı proteinleri, küçük moleküller, ve nano 20,21 gerektiren uygulamalarda olduğu gibi önemli bir avantaja sahip olduğu görülebilir. (Yüksek derecede yukarıda belirtilen malzemelere göre ücret), nükleik asitleri içeren uygulamalarda iki yöntem arasındaki kontrast belirsizdir.

Bu teslimat mikroakışkan yaklaşım, hücre zarının mekanik parçalama dayanırhücreye malzemenin pasif difüzyon kolaylaştırmak ve hücre tipleri 20 bir dizi geçerli olduğu gösterilmiştir. Sistem, hemen hemen herhangi bir hücre türü için hemen hemen herhangi bir malzemenin sitosolik teslimat için başlıca uygun halindedir. Biz sistemin avantajları en geleneksel (örneğin bağışıklık ve kök hücreleri) birincil hücreler transfect zor ve geleneksel zorlu malzemeleri (örneğin proteinler, kuantum noktalar, karbon nanotüpler ve RNA) içeren vakalarda belirgindir inanıyorum. Bağışıklık ve kök hücre uygulamalarında yukarıda belirtilen potansiyel bu hücre tipleri ele Geleneksel dağıtım yöntemlerinin eksiklikleri tarafından vurgulanmıştır. Ancak, sistem bu uygulamaların çekirdeğe teslim ihtiyaç olarak plasmid vektörleri ile gen teslim kolaylaştırmak için daha fazla gelişme gerektirir. Özetle, biz teslim mikroakışkan deformasyon yaklaşımı potansiyel hücre içi teslimat için birçok mevcut zorlukları inanıyorum. Systekimyasal vektörleri veya elektrik alanlardan m adlı bağımsızlık çalışmaları bir dizi sağlam uygulama sağlar. Burada verilen talimatlar bağımsız böyle bir sistemi işletmek için herhangi ilgilenen araştırmacılar etkinleştirmek ve araştırma amaçları için adapte olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar Armon Sharei, Robert Langer ve Klavs F. Jensen Bu makalede kullanılan mikroakışkan cihazlar üretiyor SQZ Biyoteknoloji Şirketi hissedarlar.

Acknowledgements

Biz deney tasarımı ve veri analizi yararlı tartışma T. Shatova teşekkür ederim. G. Paradis yardım ve uzmanlık, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'nde Koch Enstitüsü çekirdek akım sitometri ve Microsystems Teknoloji Laboratuvarı personelinin personel müteĢekkiriz. Bu çalışma Sağlık Hibeler RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek (Çekirdek) tarafından P30-CA14051 ve MPP-09Call-Langer-60 Grants edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27, (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats