隔离与人类心室肌细胞的功能研究从新鲜手术样品

Medicine

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Summary

心脏疾病的细胞基础上的现有知识大多依赖于对动物模型的研究。在这里,我们描述和验证了一种新的方法从人心肌小型手术样品得到单一可行的心肌细胞。人心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。

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Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

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Abstract

从患病心脏的心肌细胞受到涉及改变细胞结构,激发收缩偶联和膜离子流复杂重塑过程。这些变化很可能是负责增加心律失常的风险和收缩变化导致的收缩和舒张功能不全的心脏病患者。然而,在心脏疾病心肌细胞功能的改变大部分信息都来自动物模型。

在这里,我们描述和验证协议从心室肌从接受心脏外科手术的病人手术小样本分离出可行的心肌细胞。的协议进行详​​细说明。电生理学和细胞内钙的测量报告来演示了一些在用这种方法获得的人左心室心肌细胞的单细胞测量的可​​行性。

该协议的报道,他再可用于功能性改变人的心脏在不同心脏疾病的存在的细胞和分子基础的未来的调查非常有用。另外,该方法可用于鉴定在细胞水平上新的治疗靶点,并测试新化合物的效力对人心肌细胞,用直接平移值。

Introduction

的心肌的电生理特性解剖技术的发展为单个心肌细胞分离后已取得进展显着。在心肌兴奋收缩偶联(EC-耦合)的认识的最新发展,也已成为可能,可行的隔离单个心肌细胞可在保留完整的组织的所有生理特性的能力。膜片钳方法被常规使用,研究心肌细胞膜离子电流的功能和药理学调制。细胞内钙动力学与离子敏感染料的录音也定期进行单心肌细胞从不同的健康和疾病模型,提供对EC-耦合的生理以及对病理改变细胞内Ca 2 +的重要数据动态平衡,导致机械损伤和心脏疾病的增加心律失常的负担。信息tion从这些研究对于了解药物在临床上的电和机械作用的关键。但是,也有物种的跨膜电流和在该占心脏动作电位和心脏力学的具体特征对EC-偶联蛋白特异性差异。因此,当细胞从非人类哺乳动物中分离的研究已阐明的生物物理属性和特定的跨膜离子通道和EC-偶联蛋白的生理功能,它们不一定提供人类心肌细胞的相关模型。因此,从人类心肌存活心肌细胞的隔离是必要的,充分了解心脏疾病的病理生理学和验证新的治疗方法。

人类心房组织是现成的作为心耳在手术过程中通常被丢弃。成人人心肌动作电位和离子立方米初步定量研究rrents采用酶解分离心房细胞1-4。动作电位或从孤立的成人心室肌细胞电流记录已随后报告3,5-10。大部分这些研究使用了从外植心脏获得和利用胶原酶或冠状动脉段或数量较大的切除的组织暴露于胶原酶,得到分离的细胞的灌注细胞。这些研究使一些来自健康人的心脏心室肌细胞,并从患者的终端心脏衰竭跨膜离子电流的详细特征。 L型的录音的Ca 2 +电流(I CA-L)5-7,瞬时外向钾电流(I )8,内向整流钾电流(Iκ1)8,延迟整流钾电流的不同组成部分(我κ )9已有报道。进步和精炼分离过程10,允许在终端心脏衰竭,包括动作电位延长11增加的潜在致心律失常的离子基础的明确表征,去极化12后延迟并增加有趣电流13到舒张期去极化和早搏。

成年心肌细胞通常是从小型动物的整个心脏与各种酶的混合物,一种能够产生的Ca 2 +的容错电池14的高产量技术的逆行灌注隔离。从组织碎片心肌细胞的分离是可能是因为酶的有限访问单个肌细胞与由冠状动脉灌注取得了比较本来就不太成功。由于未使用捐助者的心非常有限的,唯一可行的方法,以获得正常的人心肌细胞定期是通过酶digestio不适用不择期外科手术的切除往往非常小的组织碎片。已经彻底的特点在细胞水平上的唯一人类疾病模型是终端心脏衰竭,因无障碍移植后的心脏。然而,终端心脏衰竭发生在少数患者并且经常涉及心肌细胞的严重重塑,这是相对独立的根本原因15的共同通路。以评估患者的单个心肌细胞的功能在疾病的早期非故障段的能力是至关重要的理解不同遗传或后天条件的特定病理生理学。肥厚型心肌病(HCM)是一个生动的例子。 HCM是一种常见的(1/500的个体)的特征在于心脏肥大可继承的心脏状况,由于流出道梗阻和舒张功能障碍16增加心律失常风险和收缩变化。从HCM心心肌ündergo参与细胞结构的变化(肥大,肌原纤维混乱)和EC-17耦合复杂的重塑过程。然而,在胡志明市心肌功能障碍多数信息都来自转基因动物模型。由于HCM患者,只有少数演变对终端心脏衰竭,需要心脏移植,HCM的心中都很少适用于细胞的分离与标准方法。然而,HCM患者中至少有30%的收缩(HCM)18发展过程中由于大量室间隔肥厚改变流出道血流梗阻症状。最有效的可用的治疗选择梗阻的HCM的救济是手术室间隔心肌切除术:这种手术过程中,上部隔一个大小可变的部分是由反式主动脉瓣的方法去除。肥大隔膜的这一部分,因此可用于从新鲜组织细胞的分离。

一种用于人类ventricula的分离方法r是单一的,小静脉心内膜心肌活检标本细胞先前已经制定和公布19。我们实现了一个方法,从接受心脏手术,包括HCM患者接受室间隔心肌切除术和心脏瓣膜置换手术的患者患者分离单个心肌细胞室间隔从心室心肌标本。除了 ​​隔离协议,有代表性的电生理学和Ca 2 +的荧光的详细描述测量呈现,显示了分离的人心肌细胞的生存能力和膜片钳和细胞内Ca 2 +的研究的可行性。

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Protocol

对人体组织的实验方案已获大学Careggi酒店,医院(2006/0024713; 2009年续签5月)的伦理委员会。每个患者的书面知情同意书。

1,解决方案和设备的准备

解决方案是在表1中说明。细胞分离方法的简化流程图,在图1中找到。

CP DB KB 结核病 PS EB1 EB2
试剂(MM) KH 2 PO 4 50
硫酸镁 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
腺苷 5
葡萄糖 140 10 20 10 10 10
甘露醇 100
牛磺酸 10 20 5 20 20
氯化钠 113 136 113 113
氯化钾 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
氯化镁 </ TD> 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
的Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
碳酸氢钠 12 12 12
KHCO 3 10 10 10
丙酮酸钠 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ TD>
琥珀酸 5
EGTA 0.5
K 2 +-ATP 2
丙酮酸 5
肌酸 5
KMES 115
酶(U / ml的) 胶原酶V型 250 </ TD> 250
蛋白酶XXIV型 4
pH值 7.4 KOH 7.3氢氧化钠 7.1 KOH 7.35氢氧化钠 7.2 KOH 7.3氢氧化钠 7.3氢氧化钠

。表1用于标本采集,细胞分离和细胞的功能特性 CP =心脏停搏液解决方案 ; DB =分离缓冲液; KB =卡夫-Bruhe的解决方案; TB =台氏缓冲液; PS =吸管的解决方案; EB1 =酶缓冲液1; EB2 =酶缓冲液2。

  1. 准备心脏停搏(CP)的解决方案。 CP溶液可以储存在4℃下长达1周。
  2. 制备的Ca 2 +的解离缓冲液(DB)。该溶液应在一天内使用。
  3. 制备牛皮纸Bruhe(KB)溶液。 KB溶液可以储存在4℃下长达1凌晨K表。
  4. 制备的Ca 2 +游离的Tyrode缓冲液(TB)。该溶液应在一天内使用。
  5. 使用针头式过滤器在使用前过滤所有的解决方案。
  6. 制备消化装置( 图2),由有机硅弹性体的两个相对的电刷,其中一旋转由电机一刮容器。消化设备定制。消化设备上的细节都在图8;该装置的图像是在图2 C2D。用70%乙醇和水冲洗组织腔。

2,收集心肌标本和处理

  1. 倾将40ml cardiplegic(CP)的溶液在50毫升的试管,并将其存储在冰中从手术室内的细胞分离的实验室样品运输。
  2. 切除后立即收集从手术室内心室心肌标本,用冰冷的洗CP溶液,并将其存储在所述管。使用来自心脏直视手术中的上跨室间隔,权重> 100毫克内膜切除标本。
  3. 样品迅速转移到实验室区域;内切除标本10分钟开始检体处理。
  4. 在保持在冰冷的CP缓冲试样,小心地取出使用立体显微镜下精剪心内膜纤维化层;事后,切心肌组织小片(长2-3毫米)。取决于组织样品的大小,切割100毫克和1 g之间心肌的总量为每个隔离。
  5. 当组织切碎后,转移心肌块放入消解器,用干净的冰冷CP的解决方案。避免与心肌块填充两个硅刷子间的总容​​积(3-4毫升),使用不超过总组织1克。

3,洗涤和大块心肌消化

  1. 船尾洱块被转移到消化装置的刮腔,改变腔室中的CP的缓冲用冷的Ca 2 +的解离缓冲液(DB)。
  2. 将消解装置的恒温槽中,为了使该腔室以与被加热的水在浴( 图1)接触。将沐浴到37.5℃,打开它,才能慢慢提高组织室的温度。把消化装置的马达上,旋转速度设置为1转/秒。
  3. 进行3次洗涤用DB中,改变该室中的溶液用干净的数据块,每8分钟。数据库温热(37℃),并获得与心肌块接触之前氧饱和。
  4. 通过增加胶原酶V和4 U / ml的蛋白酶种类四条250 U / ml到数据库的解决方案准备酶缓冲液1(EB1)。加入250 U / ml的胶原酶V至DB解决方案准备酶缓冲液2(EB2)。热身(37°C)和oxygenatËEB1和EB2。
  5. 进行消化的2 12分钟的周期在旋转消解器以100%的含氧EB1(在37℃)。在每个周期中,使用〜3毫升EB1的。用移液管抽吸除去该溶液,每个循环后丢弃它。
  6. 制备6 15ml试管为细胞收集和〜80毫升洗脱缓冲液的冷(4℃)KB溶液中。
  7. 执行第一15分钟消化循环用3毫升100%氧化EB2在37℃下消化周期后,收集含在一个15毫升管的第一解离细胞的溶液,并稀释细胞悬浮液用12ml冷的KB溶液中。存储管扁在室温下。
  8. 稀释剩余EB2解决方案与DB等量的,以减半胶原酶Ⅴ的浓度以下的消化周期。
  9. 执行其他5 12分钟的消化周期,用3毫升EB2在37℃;之后,他们每个人收集含有缓冲在一个15毫升的锥形管心肌细胞和用12ml KB液稀释。存储6含细胞试管在室温下放置30分钟。

4,细胞再悬浮和Ca 2 +的再改造

  1. 加入1毫克/毫升的牛血清白蛋白(BSA)至20ml的Ca 2 +游离的Tyrode缓冲液(TB)。过滤该溶液。
  2. 离心六含心肌细胞锥形管,在100×g离心5分钟,迫使细胞定居。去除上清并将细胞重新悬浮在每个管与BSA的含在RT TB可变数量(1-3毫升,取决于产率)。
  3. 逐渐加入100毫摩尔/升的CaCl 2溶液的小等份增加Ca 2 +浓度的含细胞的缓冲区。在第一和第二步骤的Ca 2 +浓度升高至50μmol/ L和100μmol/ L的分别。以下的Ca 2 +另外的步骤中进行,每​​5分钟,浓度在每一步吨提高100μmol/ L的0.9毫摩尔/ L OA终浓度
  4. 评估该分离过程的产率。将0.5毫升含有心肌细胞溶液到显微镜的玻璃底室。评估15显微镜领域在10倍物镜放大倍数,计算健康细胞( 杆状细胞有明确的条纹和无显著夹杂物, 图2)的百分比。预期收益率是20%左右。

隔离型心肌5。功能评价。

下面的协议是人类心肌功能评估,包括动作电位和细胞内Ca 2 +通量的同时记录的一个例子。

  1. 准备电极内液(PS)在穿孔膜片配置膜片钳实验。该溶液可以贮存于-20℃下进行长达3个月。
  2. 加1.8毫摩尔/升的CaCl 2,以Ca 2 +的无的Tyrode缓冲液(TB)。 ü本身这个解决方案为心肌灌流过程中膜片钳/荧光实验。
  3. 传送1 ml的细胞悬浮液到1.5ml管中,加入10μmol/ L的Fluoforte和10μl型电力浓缩。孵育30分钟,在室温。此后,设置管垂直位置和离开细胞定居5分钟;悬浮细胞中的Ca 2 +含结核。
  4. 转让0.25 ml细胞悬液至小(0.5毫升)中,温度控制的显微镜安装记录室中,以0.3毫升/分钟的流速灌流通过重力与加热microperfusor系统(温度:37±0.5℃)。
  5. 使用微量牵拉,制备片钳吸量管为3至5微米的尖端直径为3〜4.5米时填充PS了阻力。
  6. 两性霉素B加至一个批次的PS(250微克/毫升),并用它来填充电极。
  7. 选择一个杆状细胞有明显的条纹,缺乏夹杂物,FORM的千兆密封和等待5到10分钟,直到下访问抵抗力下降20MΩ。
  8. 使用短脉冲(<3毫秒)刺激在不同频率(0.2赫兹,0.5赫兹和1赫兹,在每个频率1分钟)在电流钳模式引起动作电位。在录制阶段,打开明亮的视场照明在492±3 nm和检测Fluoforte荧光在505-520纳米。获得的荧光,并使用Digidata 1440A和pClamp 10.0软件膜电位信号。重复的记录序列多次,如果需要的;然而,保持低于15分钟对每个单元的总记录时间。

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Representative Results

上面描述的方法进行表征的心肌细胞从患者的肥厚型心肌病(HCM)谁接受切除术手术室间隔分离的功能异常,如与非故障非增生性手术的患者21进行比较。在包含在本节中的结果是来自于该工件21,在这里被示为如何使用此技术可用于表征在心脏疾病状况的心肌细胞功能的改变的例子。

从与HCM患者的代表性手术样品如图2A所示。手术样本的大小和心内膜纤维条纹的厚度方面都非常的变量。在我们使用的每个分离过程中从样品的HCM心肌组织的量为1g左右。相反,组织的用于控制样本量较小(100-500毫克)中,由于劳ř组织的可用性。产率为显著更高时对照样品处理相对于HCM,可能是因为在组织中存活的心肌细胞的相对量减少HCM中的心肌和心内膜心肌纤维化增加22。从这些观察,我们得出结论,根据心肌病的存在或不存在所需要的组织的量,获得的活细胞可以是可变的。

样品被切成小方块, 如图2B所示 。此后,块转移到消化设备( 图2C)的腔室和用于上面( 图2D)所描述的单细胞分离。使用从室间隔样本所描述的细胞分离方法得到的细胞悬浮液的代表性的显微照片示于图3A3B;单心室CA放大图像rdiomyocytes被描绘在图3C-3F。从HCM样品心肌细胞用于动作电位及在协议部分所述细胞内Ca 2 +的变化同步录音。代表同时痕迹表示刺激在3个不同的频率中膜电压(上图)和细胞内Ca 2 +(下图)示于图4:这些痕迹从一个心肌从HCM样品中分离的记录。

膜片钳研究的结果表明,记录在刺激的不同频率的动作电位持续时间(APD)显着延长,从患者的病(HCM心肌细胞)的心肌细胞与对照组相比( 图5A5B)。为了确定在离体心肌细胞的生理反应的维修,我们测试异丙肾上腺素的作用,在使用10 - 700万图5C):β-adrenerGIC刺激生产控制肌细胞AP预期缩短。由于长时间的APD导致的风险增加去极化(EADS)23后早期的EADS的发生,在该AP的平顶阶段检测到的自发去极化,测定。在胡志明市的心肌细胞,违约风险暴露与对照组相比( 图5D)显著更加频繁。代表跟踪显示多个违约风险暴露如图5E

为了测试更长的APD和离子电流的异常是否会影响兴奋-收缩偶联机制HCM中的心肌细胞,细胞内的Ca 2 +变化的属性刺激过程中进行了评估。相比,控制心肌细胞( 图6A)的Ca 2 +瞬变引起的电流钳的条件的幅度是相似的HCM中。反之,Ca 2 +的瞬态动力学,均显著不再HCM( 6B)。此外,细胞内舒张Ca 2 +浓度是显着更高的HCM相比,控制心肌细胞( 图6C)和增加刺激频率时增加更加显着。

值得注意的是,心肌细胞分离自人类心室样品此方法也已成功地用于其它应用,包括特定的跨膜电流( 图7A)的电压钳记录,细胞内Ca 2 +和/或细胞在电场刺激缩短记录( 图图7B),并使用共聚焦显微镜和膜结合的荧光标记物( 图7C)肌膜的精细结构的评估。

图1 图的细胞分离方法1。流程图。

图2
图2。处理室样品细胞分离的(A)代表图像显示从与HCM病人谁接受室间隔心肌切除术手术心肌的样本。来自心室的外科标本心室组织切校准棒=5毫米(B)的块,以用于细胞分离。校准棒=消化装置5mm的(C)图像。该装置包括一个消化室与两个硅刷子:上级刷子能够在由电动机驱动旋转(D)的图像显示心室组织的酶消化过程在恒温浴消化装置。 P>

图3
图3。隔离人类心室心肌细胞。(AB)面板显示两个显微镜领域(10x物镜)的显示代表心肌细胞悬浮液的显微照片。值得注意的是,大约30%的细胞是杆形,并显示明显的条纹。校准条= 100微米。(CE)的从HCM患者(40×物镜)的标本中分离3人心肌代表性的图像。校准棒=20μm的。(F)图像显示的补丁吸管用于录音的尖端触及人类心室肌细胞。校准条= 20微米。

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图4。膜电位和细胞内钙的同步记录。代表跟踪显示膜电位(上图)和细胞内钙(下)记录从一个单一的肌细胞从HCM样品中分离。心肌细胞是通过补丁吸管在0.2赫兹,0.5赫兹和1赫兹刺激。

图5
图5中的样本HCM心室肌细胞动作电位变化的研究。(一)代表叠加动作电位引起在0.2赫兹,0.5赫兹和控制心肌细胞(左,灰色轨迹)和HCM心肌细胞1赫兹(右,黑色的痕迹)(B)的平均动作电位90%复极化(APD90%)在胡志明市的持续时间(N = 81)和欧洲宇航防务集团控制心肌细胞(N = 29)在测试的三个起搏频率。(C)发生在从HCM患者和对照样品心肌细胞。(D)叠加动作电位在从控制0.5Hz的心肌细胞在无(连续曲线)和在10 -7 M异丙肾上腺素存在下(E)代表迹表示从HCM患者显示在平台期(早期后去极化,EADS)存在的几个自发去极化,以箭头标出一个心肌细胞的膜电位。刺激的标志是跟踪下方短线。 * = P <0.01非配对t检验。图中的所有面板都修改与科皮尼等人的许可。2012 21。

图6
数字6,从样本HCM心室肌细胞钙瞬变的改变(A)代表通过叠加补丁吸管在控制心肌细胞(灰色)和HCM电池(黑色)刺激过程中的钙瞬变引起在0.2赫兹。值得注意的是, 钙瞬变幅度在两个小区之间没有什么不同的Ca 2 +的瞬变在胡志明市(B)动力学(42例)和对照组(n = 24),心肌细胞:时间从刺激到峰值瞬态(TP ),显示时间从高峰到50%衰减(T50%)和时间从高峰到瞬间的90%衰减(T90%)(C)代表长的痕迹显示细胞内Ca 2 +的刺激在HCM 3个不同的频率和时控制肌细胞,突出增加舒张期Ca 2 +的高起搏率在HCM心肌细胞(D)的平均舒张期的Ca 2 +在胡志明市(42例)和对照组(n = 24),心肌细胞在3种不同起搏RA工商业污水附加费。 ** = P <0.01配对t检验。图中的所有面板都修改与科皮尼等人的许可。2012 21。

图7
。图7实验的其他应用程序中使用人类心室肌细胞(A)左:代表叠加的痕迹,呈现L型离子电流在不同的膜电压与特定协议下的电压钳记录(参见第21节)。右:平均L-型离子电流峰值从18细胞中分离从HCM样品在不同的膜密度。电压(B)细胞内Ca 2 +的跟踪从心室肌细胞内电刺激频率为1 Hz记录。心室cardiom(三)共焦图像yocyte从HCM样品染色,用荧光膜结合的染料(二 - 3 - ANEPPDHQ)。值得注意的是,ttubules的密度低,这表明膜的形态重构的HCM。

图8
图8。消化装置。消化装置(AB)的组件。的可变速度旋转的电动机连接到一个第一塑料臂,其被连接到第二个。第二塑料臂是可​​移动的,并且连接到上电刷。电刷由具有有机硅弹性体。的PTFE负模具,100孔间距〜1.5毫米被用于从液态硅胶投的刷子。在模具的内部空间中具有直径为1.9厘米和6毫米厚,制造相同大小的刷子。位于模具的一侧上的孔,以便产生8mm长鬃制成时电刷从模具中浇铸并除去。后的液体硅被放入模具中,都需要完全固化至少48小时。电刷装在玻璃管内(内径= 2厘米;厚度2mm)和由两个电刷和玻璃壁所形成的圆筒形腔室是密封的两个橡胶O形环。刷子需要被推动一个到另一个;底部1是粘在塑料底座,而上部1是粘到电机臂的塑料端部,从而是能够旋转(C)放大视图上电刷的。值得注意的是,刷子需要被粘到电机臂的端部,以使它转动(D)的所述腔室的成分示于它们的最终位置。两刷子(实际室)之间的空间约为2厘米,宽7-8毫米高;这个空间可轻松安装3-4毫升缓冲液,比可达1克心肌组织的其他。

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Discussion

我们已经描述和验证的方法从人心肌的手术标本分离出可行的心肌细胞。从前面描述的协议已被成功地用于分离的细胞从心房手术样品,该技术允许从患病心室肌单个活细胞分离的开发和微调开始。早期的报道表明,从心房和心室组织块选择性受损复极钾电流,导致改变的电生理特性和响应于生理刺激8,24,单个心肌细胞的分离,而输送通过冠状动脉灌注含有缓冲液的酶没有损害延迟整流电流的分离细胞25。不幸的是,从心肌的手术标本人类心室肌细胞的分离不能由冠状动脉灌注以来冠状动脉分支的完整性进行丢失,有违植心。心肌利用我们的方法心肌块孤立的显示清晰的适应动作电位时程响应起搏频率的变化或β肾上腺素刺激。为了使这种反应发生,延迟整流钾离子通道的完整性是必需的26-28,这表明这些通道的整体完整性由我们的隔离方法也不会受到损害。此外,细胞分离与我们的方法不仅表明常规 ​​电生理反应( 图3图4),但也显示出期望的形状和持续时间的钙瞬变( 图3图5),并定期肌组织( 图2)和缩短的属性(未示出),这表明这些细胞的整体结构完整性是通过这个分离步骤保存。这种方法优于先前的主要进展技术是通过新设计的消解器,它提供了组织块的温和的机械搅拌,使没有过度损伤的单细胞分离设置。此外,使用该消化装置允许我们采用在细胞分离缓冲液的酶的浓度较低;特别是我们在以往报告的方法24使用比较非选择性蛋白酶的浓度低得多。该设备在我们的实验室定制:建筑原理图如图8呈现。

简单的设计和结构使得它很容易复制这个协议的一个成功的结果。 图8的传说还介绍了需要生产硅胶刷子和建设刮室的程序。由于消化设备的优点,可以从相对低的心室组织(低至100毫克)的量而获得相对高的活菌数。先前公布的19方法被证明是从小活检(甚至<20毫克)提供耐钙心肌细胞。不过,报道心肌细胞产率非常低,作者并没有显示出细胞中分离出与该方法是否可行的细胞内钙循环和收缩功能特性。这种技术有可能应用于许多外科病人,由于室间隔的一小部分在瓣膜置换程序( 例如 ,主动脉瓣置换术),经常切除。然而,最关键的一点,以获得成功分离是程序从手术室样品采集后,迅速启动。因此,它是必需的细胞实验室是在靠近心脏外科诊所,为了让这项技术是富有成效的。此外,适当的酶的活性也是极为重要的一个成功隔离。由于非选择性蛋白酶活性Øf,各批次胶原酶通常是不完全测试,每批有可能在细胞分离性能差异。因此,必须进行微调的胶原酶的最终浓度,以达到最佳的效果。我们建议观察细胞悬浮液的显微镜在每一循环下,为了确保活细胞开始出现在周期3的早期外观的细胞表明过高的酶的活性,并提示了为减少酶的浓度;外观周期3后细胞表明酶活力不足。在我们的经验,这是正确的酶浓度的最有效的指标。

我们已经成功地使用这种方法来从HCM患者左室流出道梗阻接受手术室间隔肌切除术,以及来自非失败不可肥大手术患者21的跨室间隔获得的单个心肌细胞。结果从该纸表明,肌细胞分离用这种方法可以为完整的电生理评估可以采用与膜片钳技术,同时评估欧盟耦合异常,通过记录与荧光染料细胞内钙离子动态。这里描述的记录过程使我们能够收集几个生理参数的细胞与来自各小区的单个记录,从而产生大量的数据,与细胞和样品的数量有限。由于这些优点,该方法已成功地用于表征从HCM患者心室心肌细胞的特定功能异常,如与非增生性患者21进行比较。离子电流和动作电位时程,以及动力学异常的异常OD细胞内Ca 2 +的循环被明确使用这种技术,具有很高的重复性。此外,我们已经表明,治疗晚期离子的选择性抑制剂与发展。安慰剂组患者的病29,这是目前正在进行中。

人体心脏标本的可用性也比较适中,即使是在专门的中心,而这可能会限制这种技术的广泛适用性。尽管如此,可以从对心肌功能的疾病相关的变化患者样本可以直接获得的信息质量相媲美,实现HCM和其他心脏疾病的动物模型。鉴于之间的广泛差异人类和小鼠心肌细胞的生理机能,从人类心肌细胞功能评估的数据可以是非常有价值的。作为结论,我们认为,这项技术的未来应用能显著促进心脏疾病的知识,因为我们的协议提供了可能性,从患者样本直接对细胞进行了一套完整的功能评估,并立即平移值。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgements

这项工作是由欧盟(STREP项目241577“大心脏”,第七届欧洲框架计划,CP),梅纳里尼国际业务卢森堡(AM),马拉松式节目GGP07133(CP)和Gilead Sciences公司(AM)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

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References

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