Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence
Published 4/21/2014
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Medicine

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Summary

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

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Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

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Abstract

Cardiomiociti da cuori malati sono sottoposti a processi di rimodellamento complessi che coinvolgono cambiamenti nella struttura cellulare, accoppiamento eccitazione contrazione e correnti ioniche di membrana. Tali modifiche sono suscettibili di essere responsabile per l'aumento del rischio aritmogena e le alterazioni contrattili che portano alla disfunzione sistolica e diastolica nei pazienti cardiopatici. Tuttavia, la maggior informazioni sulle alterazioni della funzione miociti nelle malattie cardiache proviene da modelli animali.

Qui descriviamo e validare un protocollo per isolare miociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a interventi di chirurgia cardiaca. Il protocollo è descritto in dettaglio. Misure elettrofisiologiche e calcio intracellulare sono segnalati per dimostrare la fattibilità di un numero di misurazioni singola cellula in cardiomiociti ventricolari umane ottenute con questo metodo.

Il protocollo ha riferito chere possono essere utili per le future ricerche di base cellulare e molecolare delle alterazioni funzionali del cuore umano in presenza di differenti malattie cardiache. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare nuovi bersagli terapeutici a livello cellulare e per testare l'efficacia di nuovi composti in cardiomiociti umani, con valore traslazionale diretta.

Introduction

La dissezione delle proprietà elettrofisiologiche del miocardio è progredita notevolmente dopo lo sviluppo di tecniche per l'isolamento singolo dei miociti cardiaci. Recenti progressi nella comprensione dei cardiaco eccitazione contrazione Coupling (CE-Coupling), sono stati resi possibili dalla capacità di isolare vitali singoli cardiomiociti che conservano tutte le proprietà fisiologiche del tessuto intatto. Metodi di patch clamp sono abitualmente impiegati per studiare la funzione e la modulazione farmacologica di correnti ioniche sarcolemma cardiaco. Registrazioni di dinamica del calcio intracellulare con Ca 2 + coloranti sensibili sono regolarmente eseguite su miociti cardiaci singoli da una varietà di modelli sani e malati, fornendo dati vitali sulla fisiologia del CE-Coupling nonché sulle alterazioni patologiche intracellulare Ca 2 + omeostasi che porta a danni meccanici ed aumento degli oneri aritmogena nelle malattie cardiache. Informazione da questi studi è fondamentale per la comprensione degli effetti elettrofisiologici e meccanici di farmaci in ambito clinico. Tuttavia, ci sono specie specifiche differenze nelle correnti transmembrana e nelle proteine ​​CE-coupling che rappresentano caratteristiche specifiche di potenziale cardiaco e meccanica cardiaca. Così, mentre gli studi di miociti isolati da mammiferi non umani hanno chiarito le proprietà biofisiche e ruoli fisiologici di specifici canali ionici transmembrana e proteine ​​EC-Coupling, non necessariamente forniscono modelli provvisti di miociti cardiaci umani. Isolamento dei miociti vitali di miocardio umano è quindi essenziale per comprendere appieno la fisiopatologia delle malattie cardiache e validare nuovi approcci terapeutici.

Tessuto atriale umano è facilmente disponibile come appendici atriali sono spesso scartati durante le procedure chirurgiche. Studi quantitativi iniziali di adulti potenziali d'azione cardiaci umani e cu ionicarrents impiegate cellule atriali enzimatica isolate 1-4. Registrazioni di potenziali d'azione o correnti di isolate cellule ventricolari umane adulte sono stati successivamente segnalati 3,5-10. La maggior parte di questi studi hanno utilizzato cellule ottenute da cuori espiantati e utilizzati sia perfusione con collagenasi di un segmento di arteria coronaria o l'esposizione di una rilevante quantità di tessuto asportato alla collagenasi per ottenere cellule isolate. Questi studi hanno permesso una caratterizzazione dettagliata di un numero di correnti ioniche transmembrana di cardiomiociti ventricolari umani da cuori sani e da pazienti con insufficienza cardiaca terminale. Registrazioni di tipo L Ca 2 + corrente (I Ca-L) 5-7, corrente di potassio verso l'esterno transitoria (I) 8, corrente entrante potassio raddrizzatore (I κ1) 8, le varie componenti della corrente di potassio delayed rectifier (I κ ) 9 sono stati segnalati. Anticipi e raffinazione dila procedura di isolamento 10, ha consentito una chiara caratterizzazione della base ionica del potenziale aumento aritmogenico nello scompenso cardiaco terminale, che comprende l'azione potenziale prolungamento 11, ritardato dopo depolarizzazioni 12 e aumentato divertente attuali 13 che porta alla depolarizzazione diastolica e battiti prematuri.

Miociti cardiaci adulti sono normalmente isolati da piccoli animali da perfusione retrograda di tutto cuore con varie miscele enzimatiche, una tecnica che produce rendimenti elevati di Ca 2 + cellule-tolleranti 14. Isolamento di miociti cardiaci da frammenti di tessuto è intrinsecamente meno successo probabilmente a causa del limitato accesso di enzimi per singoli miociti rispetto a quella ottenuta mediante perfusione delle arterie coronarie. A causa della limitata disponibilità di cuori erogatori non utilizzati, l'unico modo pratico per ottenere cellule ventricolari umane normali su base regolare è da digestio enzimatican dei piccolissimi frammenti di tessuto spesso asportati durante le procedure chirurgiche elettive. L'unico modello di malattia umana che è stato ampiamente caratterizzato a livello cellulare è insufficienza cardiaca terminale, a causa della accessibilità ai cuori trapiantati. Tuttavia, insufficienza cardiaca terminale si verifica in una minoranza di pazienti e spesso comporta un percorso comune di grave rimodellamento delle cellule del miocardio, che è relativamente indipendente dalla causa sottostante 15. La capacità di valutare la funzione di singoli cardiomiociti di pazienti in una fase precedente non avendo della malattia è fondamentale per capire la fisiopatologia specifica delle diverse condizioni ereditarie o acquisite. La cardiomiopatia ipertrofica (HCM) è un esempio eloquente. HCM è un comune (1/500 persone) condizione cardiaca ereditaria caratterizzata da ipertrofia cardiaca, aumento alterazioni rischio e contrattili aritmogenici a causa di ostruzione del tratto di efflusso e disfunzione diastolica 16. Cardiomiociti da cuori HCM undergo un complesso di processi di rimodellamento che comportano cambiamenti nella struttura delle cellule (ipertrofia, allo sbando miofibrillare) e EC-Coupling 17. Tuttavia, la maggior informazioni di miociti erettile in HCM è venuto da modelli animali transgenici. Dal momento che solo una minoranza di pazienti HCM evolve verso l'insufficienza cardiaca terminale e necessita di trapianto cardiaco, il cuore HCM sono molto raramente disponibili per l'isolamento delle cellule con metodi standard. Tuttavia, almeno il 30% dei pazienti HCM sviluppano sintomi ostruttivi dovuti alla enorme flusso di sangue tratto ipertrofia settale alterazione deflusso durante la sistole (HCM) 18. Il più efficace opzione terapeutica disponibile per il sollievo di ostruzione in HCM è chirurgica del setto miectomia: durante questa procedura chirurgica, una porzione di dimensioni variabile del setto superiore viene rimosso approccio aortica trans. Questa porzione di setto ipertrofico è quindi disponibile per l'isolamento delle cellule dal tessuto fresco.

Un metodo per l'isolamento di ventricula umanar miociti dai singoli, piccoli transvenous campioni di biopsia endomiocardica è stato precedentemente sviluppato e pubblicato 19. Abbiamo implementato un metodo per isolare singoli miociti del setto da campioni di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca, inclusi i pazienti con HCM sottoposti miectomia settale e pazienti sottoposti a procedure di sostituzione della valvola. Oltre a una descrizione dettagliata del protocollo di isolamento, elettrofisiologico rappresentante e Ca 2 + fluorescenza misurazioni sono presentati, dimostrando la vitalità dei miociti ventricolari isolati umani e la fattibilità di patch clamp e Ca2 + intracellulare studi.

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Protocol

I protocolli sperimentali su tessuti umani sono stati approvati dal comitato etico di Careggi University-Hospital (2006/0024713; rinnoverà maggio 2009). Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto.

1. Soluzioni agricole per la preparazione

Le soluzioni sono descritte nella Tabella 1. Un diagramma di flusso semplificato della procedura di isolamento cellulare è situato nella Figura 1.

Soluzione CP DB KB TB PS EB1 EB2
Reattivo (mm) KH 2 PO 4 50
MgSO 4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosina 5
glucosio 140 10 20 10 10 10
mannitolo 100
taurina 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl 2 </ Td> 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
NaHCO 3 12 12 12
KHCO 3 10 10 10
Na-piruvato 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
acido succinico 5
EGTA 0.5
K 2-ATP 2
acido piruvico 5
creatina 5
KMES 115
Enzimi (U / ml) Collagenase tipo V 250 </ Td> 250
Protease Tipo XXIV 4
pH 7.4 KOH 7.3 NaOH 7.1 KOH 7.35 NaOH 7.2 KOH 7.3 NaOH 7.3 NaOH

. Tabella 1 Soluzioni utilizzati per la raccolta dei campioni, l'isolamento delle cellule e caratterizzazione funzionale di miociti CP = soluzione cardioplegica.; DB = buffer di dissociazione; KB = soluzione Kraft-Brühe; TB = tampone Tyrode; PS = soluzione di pipetta; EB1 = tampone enzimatico 1; EB2 = tampone enzima 2.

  1. Preparare la soluzione cardioplegica (CP). Soluzione CP può essere conservato a 4 ° C per 1 settimana.
  2. Preparare Ca 2 + libero-tampone di dissociazione (DB). Questa soluzione deve essere utilizzata entro la giornata.
  3. Preparare la soluzione Kraft-Brühe (KB). KB soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 1 week.
  4. Preparare Ca 2 buffer di Tyrode libero + (TB). Questa soluzione deve essere utilizzata entro la giornata.
  5. Filtrare con usando filtri siringa prima dell'uso.
  6. Preparare il dispositivo di digestione (Figura 2), un contenitore raschiatura fatta di due spazzole affacciate di elastomero siliconico, una delle quali in rotazione da un motore elettrico. Il dispositivo di digestione è su misura. Dettagli sul dispositivo digestione sono in Figura 8; immagini del dispositivo sono nelle figure 2 C e 2D. Lavare la camera di tessuto con il 70% di etanolo e acqua.

2. Raccolta ed elaborazione dei Campioni Infarto

  1. Versare 40 ml di soluzione cardiplegic (CP) in un tubo da 50 ml e conservare in ghiaccio per trasporto campione dalla sala operatoria al laboratorio di isolamento cellulare.
  2. Raccogliere il campione del miocardio ventricolare dalla sala operatoria subito dopo l'asportazione, lavarlo con ghiaccio freddoSoluzione CP e memorizzarlo nel tubo. Utilizzare campioni endocardiche asportato dal setto ventricolare tra superiore durante l'intervento chirurgico a cuore aperto, la ponderazione> 100 mg.
  3. Trasferire rapidamente il campione alla zona di laboratorio; avviare l'elaborazione del campione entro 10 minuti da un campione escissione.
  4. Pur mantenendo il campione di tampone a freddo ghiaccio CP, rimuovere delicatamente lo strato fibrotico endocardial con le forbici sottili allo stereomicroscopio; poi, tagliare il tessuto miocardico a piccoli pezzi (2-3 mm di lunghezza). A seconda delle dimensioni del campione di tessuto, tagliare un importo complessivo di miocardio ventricolare tra 100 mg e 1 g per ogni isolamento.
  5. Al termine della macinazione tessuto, trasferire i pezzi del miocardio nel dispositivo di digestione, con ghiaccio pulito soluzione CP freddo. Evitare di riempire tutto il volume tra le due spazzole di silicio (3-4 ml) con pezzi del miocardio, utilizzando non più di 1 g di tessuto totale.

3. Lavaggio e Digestione del miocardio Chunks

  1. A poppaer i pezzi vengono trasferiti nella camera raschiando il dispositivo di digestione, modificare il buffer CP nella camera con il freddo Ca 2 + buffer di dissociazione-free (DB).
  2. Posizionare il dispositivo di digestione in un bagno termostatico, in modo che la camera di essere in contatto con l'acqua riscaldata nella vasca (Figura 1). Impostare la vasca di 37,5 ° C e accenderla, al fine di aumentare lentamente la temperatura della camera di tessuto. Accendere il motore del dispositivo di digestione, impostando la velocità di rotazione di 1 giro / secondo.
  3. Eseguire 3 cicli di lavaggio con DB, cambiando la soluzione nella camera pulita con DB ogni 8 min. Il DB è riscaldata (37 ° C) e ossigeno saturo prima di entrare in contatto con i pezzi del miocardio.
  4. Preparare tampone enzimatico 1 (EB1) con l'aggiunta di 250 U / ml di collagenasi di tipo V e 4 U / ml Protease Tipo XXIV alla soluzione DB. Preparare tampone enzima 2 (EB2) con l'aggiunta di 250 U / ml collagenasi di tipo V di soluzione DB. Warm up (37 ° C) e oxygenate EB1 ed EB2.
  5. Eseguire due cicli di 12 min di digestione nel dispositivo digestione rotante con 100% EB1 ossigenato (a 37 ° C). Ad ogni ciclo, utilizzare ~ 3 ml di EB1. Rimuovere la soluzione pipetta aspirazione e scartarla dopo ogni ciclo.
  6. Preparare 6 provette da 15 ml per la raccolta di cellule e ~ 80 ml di freddo (4 ° C) KB soluzione per eluire i buffer.
  7. Effettuare un primo ciclo digestione 15 min con 3 ml 100% EB2 ossigenata a 37 ° C. Dopo il ciclo di digestione, raccogliere la soluzione contenente i primi miociti dissociate in una provetta da 15 ml e diluire la sospensione cellulare con 12 ml di soluzione fredda KB. Conservare il piatto tubo a temperatura ambiente.
  8. Diluire la soluzione EB2 rimanente con una quantità uguale di DB per dimezzare la concentrazione di collagenasi V per i seguenti cicli di digestione.
  9. Eseguire altri cicli 5 12 min digestione con 3 EB2 ml a 37 ° C; dopo ciascuno di loro raccolta di miociti contenente tampone in un tubo da 15 ml ediluire con 12 ml di soluzione KB. Conservare le provette cella contenente 6 a temperatura ambiente per 30 min.

4. Resuspension cellulare e Ca 2 + riadattamento

  1. Aggiungere 1 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA) per 20 ml tampone Ca 2 +-Tyrode libero (TB). Filtrare la soluzione.
  2. Centrifugare le sei tubi conici miociti contenente 100 xg per 5 minuti per forzare miociti per risolvere. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in ciascun tubo con un ammontare variabile (1-3 ml, a seconda della resa) di BSA contenente TB a RT
  3. Aumentare gradualmente Ca 2 + concentrazione nella memoria di cella contenente aggiungendo piccole aliquote di 100 mmol / L CaCl 2 soluzione. Nella prima e nella seconda fase di Ca 2 + concentrazione viene aumentata fino a 50 mmol / L e 100 mmol / L, rispettivamente. I seguenti passaggi Ca 2 + addizione vengono eseguiti ogni 5 minuti e la concentrazione viene sollevato da 100 micromol / L ad ogni passo toa concentrazione finale di 0,9 mmol / L.
  4. Valutare la resa della procedura di isolamento. Trasferire 0,5 ml di soluzione contenente miociti sulla camera inferiore di vetro di un microscopio. Valutare 15 campi di microscopio a 10x obiettivo e calcolare la percentuale di miociti sani (ad esempio cellule a forma di bastoncello, con striature chiare e senza inclusioni significative, Figura 2). Il rendimento atteso è di circa il 20%.

5. Valutazione funzionale dei cardiomiociti isolati.

Il protocollo che segue è un esempio di valutazione funzionale dei cardiomiociti umani tra cui registrazioni simultanee di potenziali d'azione e intracellulare Ca 2 + flussi.

  1. Preparare la soluzione di pipetta (PS) per esperimenti di patch clamp in configurazione di patch perforato. La soluzione può essere conservata a -20 ° C per 3 mesi.
  2. Aggiungere 1,8 mmol / L CaCl 2 a Ca 2 + tampone Tyrode-free (TB). Use questa soluzione per superfusione dei cardiomiociti durante esperimenti di patch clamp / fluorescenza.
  3. Trasferire 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 10 micromol / L Fluoforte e 10 microlitri Powerload Concentrato. Incubare per 30 minuti a RT. Successivamente, impostare il tubo in posizione verticale e lasciare la cella accontentarsi di 5 min; risospendere le cellule in Ca 2 + contenente TB.
  4. Trasferire 0,25 ml di sospensione cellulare in un piccolo (0,5 ml), microscopio temperatura controllata montato camera di registrazione, superfuse per gravità con un sistema microperfusor riscaldato a una velocità di flusso di 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Con un estrattore micropipetta, preparare pipette di patch clamp con un diametro di punta di 3 a 5 micron e una resistenza da 3 a 4,5 m quando riempita con PS.
  6. Aggiungere amfotericina B a un lotto di PS (250 mcg / ml) e usarlo per riempire gli elettrodi.
  7. Selezionare una cella canna a forma di striature chiare, privo di inclusioni, form il sigillo giga e aspettare 5-10 minuti, fino a quando la resistenza accesso scende al di sotto di 20 mW.
  8. Suscitare potenziali d'azione in modalità pinza corrente utilizzando impulsi brevi (<3 msec) a diverse frequenze di stimolazione (0,2 Hz, 0.5 Hz e 1 Hz, 1 min ciascuna frequenza). Durante la fase di registrazione, accendere l'illuminazione in campo chiaro a 492 ± 3 nm e rilevare Fluoforte fluorescenza a 505-520 nm. Acquisire fluorescenza e membrana segnali di potenziali utilizzando Digidata 1440A e software pClamp 10.0. Ripetere la sequenza di registrazione più volte, se necessario; tuttavia, mantenere il tempo di registrazione totale inferiore a 15 minuti per ogni cella.

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Representative Results

Il metodo sopra descritto è stato impiegato per caratterizzare le alterazioni funzionali di cardiomiociti isolati dal setto interventricolare di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica (HCM) che hanno subito un'operazione miectomia, rispetto ai pazienti non in mancanza non ipertrofiche chirurgici 21. I risultati contenuti in questa sezione provengono da quel lavoro 21 e sono mostrati qui come un esempio di come questa tecnica può essere utilizzata per caratterizzare le alterazioni della funzione delle cellule del miocardio in condizioni di malattia cardiaca.

Un campione rappresentativo chirurgica da un paziente con CMI è mostrato in Figura 2A. Campioni chirurgici erano estremamente variabili in termini di dimensioni e spessore del striature fibroso dell'endocardio. La quantità di tessuto miocardico che abbiamo usato per ogni procedura di isolamento da campioni HCM era di circa 1g. Invece, la quantità di tessuto usato per i campioni di controllo era più piccola (100-500 mg.), A causa di Lower disponibilità tessuto. La resa era significativamente più alta quando i campioni di controllo sono stati trattati rispetto al CMI, probabilmente perché la quantità relativa di cellule miocardiche vitali all'interno del tessuto si riduce in HCM miocardio e fibrosi endomiocardica aumenta 22. Da queste osservazioni abbiamo concluso che la quantità di tessuto necessario per ottenere cellule vitali può essere variabile a seconda della presenza o assenza di malattia miocardica.

I campioni sono stati tagliati in piccoli pezzi, come mostrato nella Figura 2B. Successivamente, i pezzi sono stati trasferiti nella camera del dispositivo di digestione (Figura 2C) e utilizzate per l'isolamento di singole cellule come descritto sopra (Figura 2D). Microfotografie rappresentative di una sospensione cellulare ottenuta utilizzando la procedura di isolamento cellulare descritto da un campione setto interventricolare è mostrato nelle figure 3A e 3B; le immagini ingrandite delle singole ventricolare cardiomyocytes sono raffigurati nelle figure 3C-3F. Cardiomiociti da campioni HCM sono stati utilizzati per le registrazioni simultanee di potenziali d'azione e intracellulare di Ca 2 + variazioni come descritto nella sezione del protocollo. Tracce simultanee rappresentativi che mostrano potenziale di membrana (sopra) e intracellulare Ca 2 + (sotto) durante la stimolazione a 3 frequenze diverse sono mostrati in Figura 4: queste tracce sono state registrate da una singola cardiomiociti isolati da un campione CMI.

I risultati degli studi di patch clamp hanno dimostrato che la durata del potenziale d'azione (APD) registrato a varie frequenze di stimolazione è stata sensibilmente prolungata in cardiomiociti di pazienti con HCM (cardiomiociti HCM) rispetto ai controlli (Figura 5A e 5B). Per accertare il mantenimento di risposte fisiologiche in miociti isolati, abbiamo testato gli effetti di isoproterenolo, utilizzato al 10-7 M (Figura 5C): β-adrenerstimolazione gic ha prodotto l'accorciamento AP atteso nei miociti di controllo. Poiché prolungata APD porta ad un aumento del rischio di precoce dopo depolarizzazione (EAD) 23, il verificarsi di EAD, ha rilevato come depolarizzazione spontanea durante la fase di plateau della AP, è stata misurata. In cardiomiociti HCM, EAD erano significativamente più frequente rispetto ai controlli (Figura 5D). Traccia rappresentativa che mostra più EAD è mostrato in Figura 5E

Per verificare se più lunghi APD e ioni anomalie attuali possono influire meccanismi di accoppiamento eccitazione-contrazione in cardiomiociti HCM, le proprietà di intracellulari di Ca 2 + variazioni sono state valutate durante la stimolazione. L'ampiezza di Ca 2 + transitori evocati in condizioni di corrente-clamp erano simili in HCM rispetto al controllo cardiomiociti (Figura 6A). Al contrario, la cinetica di Ca 2 + transitori, sono significativamente aumentati in CMI (Figura6B). Inoltre, diastolica intracellulare di Ca 2 + concentrazione era nettamente superiore in HCM rispetto al controllo cardiomiociti (Figura 6C) e un aumento più evidente su di aumento della frequenza di stimolazione.

In particolare, cardiomiociti isolati con questo metodo da campioni ventricolari umani sono stati impiegati con successo anche per altre applicazioni, incluse voltage-clamp delle correnti transmembrana specifici (Figura 7A), intracellulare Ca 2 + e / o cellule accorciamento registrazioni durante stimolazione del campo elettrico (Figura 7B) e la valutazione della struttura fine del sarcolemma usando la microscopia confocale ed etichette fluorescenti di membrana (Figura 7C).

Figura 1 Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di isolamento delle cellule.

Figura 2
Figura 2. Trattamento dei campioni ventricolari per isolamento cellulare. (A) immagine rappresentativa che mostra un campione di miocardio ventricolare da un paziente con CMI sottoposti funzionamento miectomia settale. Calibrazione bar = 5 millimetri. (B) Bocconcini di tessuto ventricolare taglio da un ventricolari campione chirurgico, da utilizzare per l'isolamento delle cellule. Barra di calibrazione = 5 millimetri. (C) Immagini del dispositivo digestione. Il dispositivo comprende una camera di digestione con due spazzole silicio: la spazzola superiore è in grado di ruotare quando mosso da un motore (D) Immagine che mostra il dispositivo di digestione nel bagno termostatato durante la digestione enzimatica del tessuto ventricolare.. p>

Figura 3
Figura 3. Isolato cardiomiociti ventricolari umana. (AB) Il pannello mostra microfotografie dei due campi di microscopio (10x oggettivi) che mostra le sospensioni cardiomiociti rappresentativi. Di nota, circa il 30% delle cellule sono a forma di asta e mostra striature chiare. Barra di calibrazione = 100 micron. (CE) Immagini rappresentative della 3 cardiomiociti umani isolati da un esemplare di un paziente HCM (obiettivo 40x). Barra di calibrazione = 20pm. (F) Immagine che mostra un cardiomiociti ventricolari umani toccati dalla punta della pipetta di patch per le registrazioni. Barra di calibrazione = 20pm.

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Figura 4. Registrazione simultanea del potenziale di membrana e calcio intracellulare. Traccia rappresentativa mostrando potenziale di membrana (sopra) e intracellulare di calcio (sotto) registrato da un singolo miociti isolato da un campione CMI. Il myocyte viene stimolato attraverso la pipetta di patch a 0.2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz.

Figura 5
Figura 5. Alterazioni di potenziali d'azione in cardiomiociti ventricolari dai campioni HCM. (A) Rappresentante sovrapposto potenziali d'azione ha suscitato a 0.2 Hz, 0,5 Hz e 1 Hz da un miociti di controllo (a sinistra, tracce di grigio) e un miociti HCM (a destra, tracce nere ). (B) azione Durata media di potenziale al 90% ripolarizzazione (APD90%) in HCM (n = 81) ecardiomiociti di controllo (n = 29) ai tre frequenze di stimolazione testati. (C) Presenza di EAD in cardiomiociti di pazienti HCM e campioni di controllo. (D) Sovrapposto potenziali d'azione a 0.5Hz da un miociti controllo in assenza (traccia continua) e in presenza di 10 -7 M isoproterenolo. (E) traccia rappresentativa che mostra il potenziale di membrana di una cardiomiociti da un paziente HCM visualizzando diverse depolarizzazioni spontanee che si verificano durante la fase di plateau (presto dopo depolarizzazioni, EAD), segnato da frecce. Gli stimoli sono segnati da linee corte sotto traccia. ** = P <0.01 spaiato t-test. Tutti i pannelli nella figura vengono modificati con il permesso di Coppini et al. 2012 21.

Figura 6
Figura6. Alterazioni di transienti di calcio in cardiomiociti ventricolari dai campioni HCM. (A) Rappresentante sovrapposto transienti di calcio suscitato durante la stimolazione a 0.2 Hz tramite la pipetta di patch in un miociti di controllo (grigio) e una cella HCM (nero). In particolare, l'ampiezza di Ca 2 + transitori non differisce tra le due celle (B) cinetica di Ca 2 + transitori in CMI (n = 42) e di controllo (n = 24): cardiomiociti. Tempo da stimolo a picco transitorio (TP ), tempo da picco a 50% decadimento (T50%) e il tempo di picco a 90% decadimento del transiente (T90%) sono mostrate. (C) lunghe tracce rappresentativi mostrano intracellulare Ca 2 + durante la stimolazione a 3 diverse frequenze in HCM e miociti di controllo, mettendo in evidenza l'aumento della diastolica Ca 2 + ad alte frequenze di stimolazione in miociti HCM. (D) Nella media diastolica Ca 2 + in HCM (n = 42) e di controllo (n = 24) cardiomiociti in 3 diverse ra stimolazionetes. ** = P <0,01 test di t spaiato. Tutti i pannelli nella figura vengono modificati con il permesso di Coppini et al. 2012 21.

Figura 7
.. Figura 7 Ulteriori applicazioni sperimentali che utilizzano miociti ventricolari umani (A) a sinistra: rappresentante sovrappone tracce che mostrano L-type Ca 2 + corrente registrata ai sensi morsetto di tensione con tensioni diverse membrana con un protocollo specifico (v. 21 per i dettagli). A destra: media L-type Ca 2 + densità di corrente di picco da 18 cellule isolate dai campioni di HCM a membrana diverso. Tensioni. (B) intracellulare Ca 2 + tracciare registrato da un miociti ventricolari durante stimolazione del campo elettrico a 1 Hz. (C) confocale immagine di un cardiom ventricolareyocyte da un campione HCM colorato con un colorante fluorescente legato alla membrana (Di-3-ANEPPDHQ). Da segnalare, la densità di ttubules è bassa, suggerendo morfologica rimodellamento della membrana in HCM.

Figura 8
Figura 8. Dispositivo digestione. (AB) Componenti del dispositivo digestione. Un motore in rotazione a velocità variabile è collegato ad un primo braccio di plastica, che è collegato ad una seconda. Il secondo braccio di plastica è rimovibile e collegato alla spazzola superiore. Pennelli sono realizzati con elastomero siliconico. Uno stampo negativo PTFE, con 100 fori distanziati ~ 1,5 millimetri è stato utilizzato per lanciare le spazzole da silicone liquido. Lo spazio interno dello stampo è 1,9 centimetri di diametro e 6 mm di spessore, producendo spazzole della stessa dimensione. I fori situati su un lato dello stampo sono realizzati allo scopo di produrre 8 millimetri setole lunghe quando le spazzolesono espressi e rimosso dallo stampo. Dopo il silicone liquido è messo nello stampo, sono necessari almeno 48 h per il completo indurimento. Spazzole sono montate all'interno di un tubo di vetro (diametro interno = da 2 cm di spessore 2 mm) e la camera cilindrica formata dalle due spazzole e le pareti di vetro è sigillata ermeticamente da due O-ring in gomma. Spazzole devono essere spinti l'uno all'altro; quello inferiore è incollata su una base di plastica, mentre quello superiore è incollato al fine di plastica del braccio motore e quindi è in grado di ruotare. (C) Ingrandito vista sulla spazzola superiore. Da segnalare la spazzola deve essere incollato alla fine del braccio motore in modo che la rotazione (D) I componenti della camera sono mostrati nella loro posizione finale. Lo spazio tra le due spazzole (la camera reale) è ~ 2 cm di larghezza e alta 7-8 mm; questo spazio si adatta facilmente 3-4 ml di tampone, diverse per 1 g di tessuto miocardico.

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Discussion

Abbiamo descritto e validato un metodo per isolare miociti vitali da campioni chirurgici di miocardio ventricolare umano. Partendo da protocolli precedentemente descritti che erano stati utilizzati con successo per cellule isolate da campioni chirurgici atriali, la tecnica per consentire la separazione dei miociti vitali singoli da malato miocardio ventricolare è stato sviluppato e perfezionato. I primi rapporti hanno mostrato che l'isolamento dei singoli cardiomiociti da pezzi di atriale e ventricolare tessuto selettivamente deteriorati repolarizing correnti di potassio, con conseguente alterate le proprietà elettrofisiologiche e le risposte agli stimoli fisiologici 8,24, mentre la consegna di un enzima contenente tampone tramite perfusione coronarica non ha compromesso raddrizzatore ritardata correnti nelle cellule isolare 25. Purtroppo, l'isolamento di miociti ventricolari umani da campioni chirurgici di miocardio ventricolare non può essere eseguita mediante perfusione coronarica quanto l'integrità rami coronariciè perso, in contrasto con i cuori espiantati. Cardiomiociti isolati da pezzi del miocardio utilizzando il nostro metodo mostrano un chiaro adattamento della durata del potenziale d'azione in risposta ai cambiamenti di frequenza di stimolazione o di β stimolazione adrenergica. Affinché tali risposte si verifichi l'integrità dei canali del potassio raddrizzatore ritardo è necessaria 26-28, suggerendo l'integrità complessiva di questi canali non è compromessa dal nostro metodo di isolamento. Inoltre, cellule isolate con i nostri metodi non solo mostrano risposte elettrofisiologiche regolari (figure 3 e 4), ma anche la visualizzazione dei transienti di calcio della forma e la durata prevista (figure 3 e 5) e regolare organizzazione sarcomerica (Figura 2) e proprietà accorciamento (non illustrato), suggerendo che l'integrità strutturale complessiva di tali cellule è preservata da questa procedura di isolamento. L'avanzamento principale di questo metodo rispetto precedentetecniche è fornito dal dispositivo di digestione di nuova concezione, che offre leggera agitazione meccanica di pezzi di tessuto, permettendo la separazione cella singola, senza danni eccessivi. Inoltre, l'uso del dispositivo digestione permesso di impiegare una minore concentrazione di enzimi nel buffer di isolamento cellulare; in particolare stiamo usando una concentrazione molto più bassa della proteasi non selettivo rispetto ai metodi precedentemente riportati 24. Il dispositivo è su misura nel nostro laboratorio: agli schemi di costruzione sono presentati nella Figura 8.

Il design e la struttura semplice lo rende molto facile da replicare per un esito positivo di questo protocollo. La leggenda alla figura 8 descrive anche le procedure necessarie per la produzione di spazzole in silicone e la costruzione della camera di raschiatura. A causa dei vantaggi del dispositivo digestione, un numero relativamente elevato di cellule vitali può essere ottenuta da una quantità relativamente bassa di tessuto ventricolare (a partire da 100 mg).Un metodo precedentemente pubblicato 19 ha dimostrato di fornire un calcio miociti tolleranti da piccole biopsie (anche <20 mg). Tuttavia, la resa dei miociti riferito era molto bassa e gli autori non mostra se le cellule isolate con il metodo che erano fattibili per la caratterizzazione del ciclo del calcio intracellulare e la funzione contrattile. Questa tecnica è potenzialmente applicabile a molti pazienti chirurgici, poiché piccole porzioni del setto interventricolare sono spesso asportati durante le procedure di sostituzione della valvola (ad es. Sostituzione della valvola aortica). Tuttavia, il punto cruciale per ottenere un isolamento di successo è un rapido avvio della procedura dopo la raccolta del campione dalla sala operatoria. Pertanto, è necessario per il laboratorio della cella sia in prossimità della clinica di chirurgia cardiaca, affinché questa tecnica per essere fecondo. Inoltre, una corretta attività enzimatica è anche estremamente importante per un isolamento efficace. Poiché l'attività della proteasi non selettiva of ogni lotto collagenasi è solitamente non completamente testato, ogni lotto è probabilmente diverso comportamento in isolamento cellulare. E 'quindi essenziale per ottimizzare la concentrazione finale di collagenasi per ottenere i migliori risultati. Si consiglia osservando sospensione di cellule sotto il microscopio ad ogni ciclo, in modo da essere sicuri che le cellule vitali iniziano ad apparire al ciclo 3 comparsa precoce delle cellule suggerisce eccessiva attività enzimatica e spinge verso la riduzione della concentrazione dell'enzima.; comparsa di cellule dopo ciclo 3 suggerisce attività enzimatica insufficiente. Nella nostra esperienza, questo è l'indicatore più efficace della concentrazione dell'enzima corretta.

Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per ottenere singoli cardiomiociti dal setto inter-ventricolare di pazienti con HCM efflusso del ventricolo sinistro ostruzione fase chirurgica del setto miectomia, nonché da non mancanza pazienti chirurgici non ipertrofiche 21. Risultati da quella cartamostrano che miociti isolati con questo metodo possono essere impiegati per una completa valutazione elettrofisiologica con tecniche di patch clamp e contemporaneamente valutare le anomalie EC-accoppiamento, registrando dinamiche di calcio intracellulare con coloranti fluorescenti. La procedura di registrazione qui descritto ha permesso di raccogliere diversi parametri fisiologici cellulari con una singola registrazione da ciascuna cella, producendo così una grande quantità di dati con un numero limitato di cellule e campioni. Grazie a questi vantaggi, questo metodo è stato usato con successo per caratterizzare le specifiche alterazioni funzionali dei cardiomiociti ventricolari da pazienti HCM, rispetto ai pazienti non ipertrofiche 21. Anomalie di correnti ioniche e durata del potenziale d'azione, nonché anomalie cinetiche od intracellulare di Ca 2 + bicicletta sono stati chiaramente identificati con questa tecnica, con elevata riproducibilità. Inoltre, abbiamo dimostrato che il trattamento con un inibitore selettivo di ritardo Na + vs. placebo in pazienti con HCM 29, che è attualmente in corso.

Umano disponibilità esemplare cardiaco è relativamente modesto, anche in centri specializzati, e questo può limitare una vasta applicabilità di questa tecnica. Tuttavia, la qualità delle informazioni che possono essere ottenute direttamente da campioni di pazienti in relazione con la malattia cambiamenti nella funzione dei cardiomiociti è paragonabile a quella ottenibile da modelli animali di HCM e altre malattie cardiache. Date le notevoli differenze tra lafisiologia dei miociti cardiaci umani e murini, i dati di valutazione funzionale dei miociti umani può essere estremamente utile. Come conclusione, riteniamo che le future applicazioni di questa tecnica possono contribuire significativamente alla conoscenza delle malattie cardiache, poiché il nostro protocollo prevede la possibilità di eseguire una serie completa di valutazioni funzionali direttamente sulle cellule da campioni di pazienti, con valore immediato traslazionale.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dall'UE (STREP Progetto 241.577 "GRANDE CUORE," 7 ° Programma quadro europeo, CP), Menarini internazionale Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) e Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

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References

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