L'isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence
Medicine

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Summary

Les connaissances actuelles sur la base cellulaire de maladies cardiaques repose principalement sur des études sur des modèles animaux. Nous décrivons ici et valider une nouvelle méthode pour obtenir des cardiomyocytes viables simples de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. Myocytes ventriculaires humains peuvent être utilisés pour des études électrophysiologiques et le dépistage des drogues.

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Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

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Abstract

Cardiomyocytes de coeurs malades sont soumis à des processus de remodelage complexes impliquant des changements dans la structure de la cellule, le couplage excitation contraction et les courants ioniques membranaires. Ces changements sont susceptibles d'être responsable de l'augmentation du risque arythmogène et les altérations contractiles conduisant à un dysfonctionnement systolique et diastolique chez les patients cardiaques. Cependant, la plupart des informations sur les modifications de la fonction des myocytes cardiaques dans les maladies est venu à partir de modèles animaux.

Nous décrivons ici et valider un protocole d'isoler les myocytes viables de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire de patients subissant des opérations de chirurgie cardiaque. Le protocole est décrit dans le détail. Les mesures de calcium intracellulaires et électrophysiologiques sont rapportés à démontrer la faisabilité d'un certain nombre de mesures de cellules simples dans des cardiomyocytes ventriculaires humains obtenus avec cette méthode.

Le protocole a signalére peuvent être utiles pour des enquêtes futures de la base cellulaire et moléculaire des altérations fonctionnelles du cœur humain en présence de différentes maladies cardiaques. En outre, cette méthode peut être utilisée pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques au niveau cellulaire et pour tester l'efficacité de nouveaux composés sur des cardiomyocytes humains, avec une valeur de translation direct.

Introduction

Dissection des propriétés électrophysiologiques du myocarde a progressé de façon marquée après la mise au point de techniques pour seule isolation des myocytes cardiaques. Les récents progrès dans la compréhension de la contraction cardiaque excitation Coupling (CE-Coupling) ont également été rendue possible par la capacité d'isoler des cardiomyocytes viables simples qui conservent toutes les propriétés physiologiques des tissus intacts. Procédés de patch-clamp sont couramment utilisées pour étudier la fonction et la modulation pharmacologique des courants ioniques sarcolemmiques cardiaque. Les enregistrements de la dynamique du calcium intracellulaire avec Ca 2 + colorants sensibles sont également effectués régulièrement sur ​​les myocytes cardiaques simples d'une variété de modèles sains et malades, fournir des données essentielles sur la physiologie de la CE-couplage ainsi que sur les modifications pathologiques de Ca 2 + homéostasie conduisant à une altération mécanique et l'augmentation du fardeau des maladies cardiaques arythmogène. Information de ces études est essentiel pour comprendre les effets électrophysiologiques et mécaniques des médicaments en milieu clinique. Cependant, il ya des différences entre les espèces spécifiques dans les courants transmembranaires et des protéines CE-couplage qui représentent caractéristiques de potentiel d'action cardiaque et la mécanique cardiaque. Ainsi, bien que les études sur des myocytes isolés à partir de mammifères non humains ont permis d'élucider les propriétés biophysiques et les rôles physiologiques des canaux spécifiques d'ions transmembranaires et des protéines EC-couplage, ils ne constituent pas nécessairement des modèles pertinents de myocytes cardiaques humaines. Isolation des myocytes viables du myocarde humain est donc essentiel de bien comprendre la physiopathologie des maladies cardiaques et de valider de nouvelles approches thérapeutiques.

Tissu auriculaire humain est facilement disponible comme des appendices auriculaires sont souvent jetés pendant les interventions chirurgicales. Études quantitatives initiales de potentiels d'action cardiaque humains adultes et cu ioniquerrents employés cellules auriculaires isolées enzymatiquement 1-4. Enregistrements de potentiels d'action ou des courants à partir de cellules humaines isolées ventriculaires adultes ont ensuite été rapportés 3,5-10. La plupart de ces études ont utilisé des cellules obtenues à partir de cœurs expiantes et utilisés perfusion de collagénase ou l'autre d'un segment de l'artère coronaire ou l'exposition de relativement grandes quantités de tissu excisé de la collagénase pour obtenir des cellules isolées. Ces études ont permis une caractérisation détaillée d'un certain nombre de courants ioniques transmembranaires de cardiomyocytes ventriculaires droits de coeurs sains et de patients atteints d'insuffisance cardiaque terminale. Les enregistrements de type L de Ca 2 + de courant (I Ca-L) 5-7, courant potassique transitoire sortant (I to) 8, le courant entrant de potassium redresseur (I κ1) 8, les différentes composantes du courant potassique redresseur retardé (I κ ) 9 ont été rapportés. Avances et raffinage dela procédure d'isolement 10, a permis une caractérisation précise de la base ionique du potentiel arythmogène augmenté dans l'insuffisance cardiaque terminale, comprenant une action potentielle prolongation 11, retardée après dépolarisations 12 et a augmenté actuel drôle 13 menant à la dépolarisation diastolique et extrasystoles.

Myocytes cardiaques adultes sont normalement isolés de petits animaux par perfusion rétrograde de l'ensemble du cœur avec différents mélanges d'enzymes, une technique qui produit des rendements élevés de Ca 2 + cellules tolérantes 14. Isolation des myocytes cardiaques à partir de fragments de tissu est intrinsèquement moins réussie probablement à cause de l'accès limité des enzymes de myocytes individuels par rapport à celui obtenu par perfusion des artères coronaires. En raison de la disponibilité très limitée de cœurs de donneurs non utilisés, le seul moyen pratique d'obtenir des cellules ventriculaires humains normaux sur une base régulière est par digestio enzymatiquen des fragments de tissus sont souvent très petites excisés au cours de procédures chirurgicales non urgentes. Le seul modèle de la maladie humaine qui a été caractérisé de façon approfondie au niveau de la cellule est l'insuffisance cardiaque terminale, en raison de l'accessibilité aux cœurs transplantés. Cependant, l'insuffisance cardiaque terminale se produit dans une minorité de patients et implique une voie commune de remodelage grave des cellules du myocarde, ce qui est relativement indépendante de la cause sous-jacente 15 souvent. La capacité d'évaluer la fonction des cardiomyocytes simples des patients à un stade précoce de la maladie non défaut est crucial de comprendre la physiopathologie spécifique des différentes maladies héréditaires ou acquises. Cardiomyopathie hypertrophique (CMH) est un exemple éloquent. HCM est une commune (1/500 personnes) de l'état cardiaque héréditaire caractérisée par une hypertrophie cardiaque, une augmentation des altérations de risque et contractiles arythmogènes due à une obstruction des voies et la dysfonction diastolique 16. Cardiomyocytes de coeurs HCM undergo un processus de remodelage complexes impliquant des changements dans la structure cellulaire (hypertrophie, désarroi myofibrillaire) et CE-couplage 17. Cependant, la plupart des informations de dysfonctionnement des myocytes dans HCM est venu de modèles animaux transgéniques. Depuis, seule une minorité de patients HCM évolue vers l'insuffisance cardiaque terminale et nécessite une transplantation cardiaque, coeurs HCM sont très rarement disponibles pour l'isolement de cellules avec des méthodes classiques. Cependant, au moins 30% des patients HCM développer des symptômes d'obstruction due à la circulation sanguine massif hypertrophie septale modification des sorties de voies au cours de la systole (HCM) 18. L'option thérapeutique disponible la plus efficace pour le soulagement de l'obstruction à Ho Chi Minh est chirurgical septale myectomie: au cours de cette intervention chirurgicale, une portion de taille variable de la cloison supérieure est enlevée par l'approche aortique trans. Cette partie du septum hypertrophié est donc disponible pour l'isolement de cellules à partir du tissu frais.

Procédé pour l'isolement de l'homme ventricular myocytes de simples, petites biopsies endomyocardiques transveineuses a déjà été élaboré et publié 19. Nous avons implémenté une méthode pour isoler les myocytes septum simples à partir d'échantillons de myocarde ventriculaire chez les patients subissant une chirurgie cardiaque, y compris les patients avec HCM subissant myectomie septale et patients subissant des procédures de remplacement de la valve. En plus d'une description détaillée du protocole d'isolement, électrophysiologiques et représentant Ca 2 + fluorescence mesures sont présentés, ce qui démontre la viabilité des myocytes ventriculaires isolés humains et la faisabilité de patch-clamp et de Ca 2 + intracellulaire études.

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Protocol

Les protocoles expérimentaux sur des tissus humains ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Careggi-Hôpital (2006/0024713; renouvelé mai 2009). Chaque patient a donné son consentement éclairé.

1. Solutions et Préparation du matériel

Les solutions sont décrites dans le tableau 1. Un organigramme simplifié de la procédure d'isolement des cellules est constaté sur la figure 1.

Solution CP DB KB TB PS EB1 EB2
Réactif (mM) KH 2 PO 4 50
MgSO4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adénosine 5
glucose 140 10 20 10 10 10
mannitol 100
taurine 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl2 </ Td> 1.2 5
KH 2 PO 4 0,6 30 0,6 0,6
Na 2 HPO 4 0,6 0,6 0,6
NaHCO 3 12 12 12
KHCO3 10 10 10
Na-pyruvate 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
l'acide succinique 5
EGTA 0,5
K 2-ATP 2
l'acide pyruvique 5
créatine 5
KMES 115
Enzymes (U / ml) Collagénase de type V 250 </ Td> 250
Protéase de type XXIV 4
pH 7.4 KOH 7.3 NaOH 7.1 KOH 7,35 NaOH 7.2 KOH 7.3 NaOH 7.3 NaOH

. Tableau 1 Les solutions utilisées pour la collecte de l'échantillon, l'isolement cellulaire et la caractérisation fonctionnelle des myocytes CP = solution de cardioplégie.; DB = tampon de dissociation; KB = solution Kraft-Brühe; TB = tampon Tyrode; PS = solution de pipette; EB1 = enzyme tampon 1; EB2 = enzyme tampon 2.

  1. Préparer cardioplégie (CP) solution. solution de CP peut être stocké à 4 ° C pendant 1 semaine.
  2. Préparer Ca 2 + libre-dissociation tampon (DB). Cette solution doit être utilisée dans la journée.
  3. Préparer Kraft-Brühe (KB) solution. KB solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 1 week.
  4. Préparer Ca 2 tampon de Tyrode sans + (TB). Cette solution doit être utilisée dans la journée.
  5. Filtrer toutes les solutions en utilisant des filtres à seringue avant utilisation.
  6. Préparer le dispositif de digestion (figure 2), un récipient de raclage constitué de deux brosses opposées de l'élastomère de silicone, dont l'une en rotation par un moteur électrique. Le dispositif de digestion est fait sur mesure. Détails sur le dispositif de digestion sont dans la figure 8; des images de l'appareil sont dans les figures 2 C et 2D. Laver la chambre de tissu avec 70% d'éthanol et d'eau.

2. Collecte et traitement des échantillons du myocarde

  1. Verser 40 ml d'cardiplegic (CP) solution dans un tube de 50 ml et de le stocker dans de la glace pour le transport de l'échantillon de la pièce opératoire au laboratoire de l'isolement cellulaire.
  2. Recueillir l'échantillon du myocarde ventriculaire de la salle opératoire immédiatement après l'excision, le laver avec le froid de la glacesolution de CP et de le stocker dans le tube. Utilisez spécimens endocardiaques excisés du septum inter ventriculaire supérieure pendant la chirurgie à cœur ouvert, la pondération> 100 mg.
  3. Transférer rapidement l'échantillon dans la zone de laboratoire; commencer le traitement des échantillons dans les 10 minutes à partir de l'échantillon excision.
  4. Tout en gardant l'échantillon dans un tampon glacé de CP, retirer délicatement la couche fibreuse endocardique l'aide de ciseaux fins sous un stéréomicroscope; après, couper le tissu myocardique en petits morceaux (2-3 mm de long). Selon tissu taille de l'échantillon, couper un montant total de myocarde ventriculaire entre 100 mg et 1 g pour chaque isolement.
  5. À la fin de hachage de tissus, de transférer les morceaux du myocarde dans le dispositif de la digestion, avec une solution de CP froid de la glace propre. Éviter de remplir l'ensemble du volume entre les deux brosses de silicium (3-4 ml) avec des morceaux du myocarde, en n'utilisant pas plus de 1 g de tissu ensemble.

3. Laver et la digestion de l'infarctus morceaux

  1. À l'arrièreer les morceaux sont transférés dans la chambre de raclage de l'appareil de digestion, changer le tampon de CP dans la chambre avec 2 Ca froid tampon de dissociation + libre (DB).
  2. Placer l'appareil de digestion dans un bain thermostatique, pour que la chambre à être en contact avec l'eau chaude dans le bain (figure 1). Réglez le bain à 37,5 ° C et allumez-le, afin d'augmenter lentement la température de la chambre de tissus. Mettre en marche le moteur du dispositif de digestion, régler la vitesse de rotation de 1 tour / seconde.
  3. Effectuer 3 cycles de lavage avec DB, en changeant la solution dans la chambre avec propre DB toutes les 8 min. La DB est réchauffé (37 ° C) et d'oxygène saturé avant entrer en contact avec les morceaux du myocarde.
  4. Préparer une enzyme tampon (EB1) par addition de 250 U / ml de collagénase de type V et de 4 U / ml de protéase de type XXIV solution à DB. Préparer enzyme tampon 2 (EB2) en ajoutant 250 U / ml de collagénase de type V de solution DB. Warm up (37 ° C) et oxygenate EB1 et EB2.
  5. Effectuer deux cycles de 12 min de digestion dans le dispositif de rotation digestion avec 100% EB1 oxygénée (à 37 ° C). A chaque cycle, utilisez ~ 3 ml de EB1. Retirer la solution par pipette d'aspiration et le jeter après chaque cycle.
  6. Préparer six tubes de 15 ml pour la collecte de cellules et ~ 80 ml de froid (4 ° C), KB solution pour éluer les tampons.
  7. Effectuez un premier cycle de digestion de 15 minutes avec 3 ml 100% EB2 oxygénée à 37 ° C. Après le cycle de digestion, de recueillir la solution contenant les premières myocytes dissociées dans un tube de 15 ml et diluer la suspension cellulaire avec 12 ml de solution froide KB. Rangez le plat du tube à température ambiante.
  8. Diluer la solution EB2 restant avec une quantité égale de DB afin de réduire de moitié la concentration de collagénase V pour les cycles de digestion suivantes.
  9. S'acquitter d'autres cycles 5 12 min de digestion avec 3 ml EB2 à 37 ° C; après chacun d'eux collecter des myocytes contenant du tampon dans un tube conique de 15 ml etdiluer avec 12 ml KB solution. Conserver les tubes de cellules contenant de 6 à la température ambiante pendant 30 min.

4. Remise en suspension cellulaire et Ca 2 + de réadaptation

  1. Ajouter 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) à 20 ml de Ca 2 + Tyrode sans tampon (TB). Filtrer la solution.
  2. Centrifuger les six myocytes contenant des tubes coniques à 100 g pendant 5 min à la force pour régler les myocytes. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans chaque tube avec une quantité variable (1 à 3 ml, en fonction du rendement) de BSA contenant TB à TA.
  3. Augmenter progressivement la concentration en Ca2 + dans le tampon de cellule contenant par addition de petites portions aliquotes de 100 mmol / L de solution de CaCl 2. Dans les première et deuxième étapes concentration en Ca2 + est augmentée jusqu'à 50 pmol / L et de 100 pmol / L, respectivement. Les étapes Ca 2 + d'addition suivantes sont effectuées toutes les 5 min et la concentration est soulevé par 100 pmol / L à chaque étape to une concentration finale de 0,9 mmol / L.
  4. Évaluer le rendement de la procédure d'isolement. Transférer 0,5 ml d'une solution contenant des myocytes sur le fond de chambre de verre de microscope. Évaluer 15 champs microscopiques à un grossissement de 10x objectif et calculer le pourcentage de myocytes sains (par exemple, les cellules en forme de tige avec des stries claires et sans inclusions importantes, figure 2). Le rendement attendu est de l'ordre de 20%.

5. Evaluation fonctionnelle des cardiomyocytes isolés.

Le protocole suivant est un exemple de l'évaluation fonctionnelle des cardiomyocytes humains, y compris des enregistrements simultanés de potentiels d'action et Ca2 + intracellulaire flux.

  1. Préparer la solution de la pipette (PS) pour les expériences de patch clamp en configuration patch perforé. La solution peut être stockée à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
  2. Ajouter 1,8 mmol / L CaCl 2 à Ca2 tampon de Tyrode + libre (TB). Usoi cette solution pour surfusion des cardiomyocytes au cours des expériences de patch-clamp / fluorescence.
  3. Transfert de 1 ml de suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml et ajouter 10 umol / L et 10 ul Fluoforte Powerload concentré. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, réglez le tube en position verticale et quitter la cellule se contenter de 5 min; remettre les cellules en Ca 2 + contenant la tuberculose.
  4. Transférer 0,25 ml de la suspension cellulaire à un petit (0,5 ml), à température contrôlée au microscope monté chambre d'enregistrement, superfusées par gravité avec un système de microperfusor chauffée à un débit de 0,3 ml / min (température: 37 ± 0,5 ° C).
  5. L'utilisation d'un étirage de micropipettes, plaquées préparer les pipettes de serrage avec un diamètre de pointe de 3 à 5 um et une résistance de 3 à 4,5 M lorsqu'elle est remplie avec PS.
  6. Ajouter amphotéricine B à un lot de PS (250 pg / ml) et l'utiliser pour remplir les électrodes.
  7. Sélectionner une tige en forme de cellule avec des stries claires, dépourvues d'inclusions, form le sceau de giga et attendre 5 à 10 min, jusqu'à ce que la résistance d'accès est inférieur à 20 MQ.
  8. Induire des potentiels d'action dans le mode de blocage de courant en utilisant des impulsions courtes (<3 ms) à différentes fréquences de stimulation (0,2 Hz, 0,5 Hz et 1 Hz, 1 min à chaque fréquence). Au cours de la phase d'enregistrement, allumer l'éclairage du champ lumineux à 492 ± 3 nm et détecter Fluoforte fluorescence à 505 à 520 nm. Acquérir la fluorescence et de la membrane en utilisant des signaux potentiels Digidata 1440A et le logiciel pClamp 10,0. Répétez la séquence d'enregistrement plusieurs fois si nécessaire; Cependant, gardez la durée totale d'enregistrement en dessous de 15 min pour chaque cellule.

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Representative Results

La méthode décrite ci-dessus a été utilisé pour caractériser les anomalies fonctionnelles des cardiomyocytes isolés du septum interventriculaire des patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique (CMH) qui ont subi une opération de myectomie, par rapport aux patients défaut hypertrophiques non non chirurgicaux 21. Les résultats présentés dans cette section sont dérivées à partir de ce travail 21 et sont représentés ici comme un exemple de comment cette technique peut être utilisée pour caractériser les altérations de la fonction des cellules du myocarde dans des conditions de maladies cardiaques.

Un échantillon représentatif chirurgical d'un patient souffrant de HCM est représenté sur la figure 2A. Échantillons chirurgicaux étaient extrêmement variables en termes de taille et de l'épaisseur de la stries fibreux endocavitaire. La quantité de tissu myocardique que nous avons utilisé pour chaque procédure d'isolement à partir d'échantillons HCM était d'environ 1 g. Au lieu de cela, la quantité de tissu utilisé pour les échantillons témoins était plus faible (100 à 500 mg.), En raison de lower de la disponibilité de tissu. Le rendement est nettement plus élevé lorsque les échantillons de contrôle ont été traitées par rapport à HCM, probablement parce que la quantité relative de cellules myocardiques viables au sein du tissu est réduite dans le myocarde HCM et la fibrose endomyocardique est augmentée de 22. A partir de ces observations, nous avons conclu que la quantité nécessaire de tissu pour obtenir des cellules viables peut être variable en fonction de l'absence ou la présence d'une maladie myocardique.

Des échantillons ont été coupés en petits morceaux, comme indiqué sur la figure 2B. Ensuite, les morceaux ont été transférés dans la chambre du dispositif de digestion (Figure 2C) et utilisés pour l'isolement de cellules uniques comme décrit ci-dessus (Figure 2D). Microphotographies représentatives d'une suspension de cellules obtenue à l'aide de la procédure d'isolement des cellules à partir d'un échantillon est décrit septum interventriculaire est montré sur les figures 3A et 3B; images agrandies de simple ventriculaire cardiomyocytes sont représentées dans les figures 3C-3F. Cardiomyocytes HCM à partir d'échantillons ont été utilisés pour des enregistrements simultanés de potentiels d'action et de Ca 2 + intracellulaire variations telles que décrites dans la section de protocole. Traces simultanés représentatifs montrant tension de membrane (ci-dessus) et de Ca 2 + intracellulaire (ci-dessous) lors de la stimulation à trois fréquences différentes sont représentées sur la figure 4: ces traces ont été enregistrées à partir d'un seul des cardiomyocytes isolés à partir d'un échantillon de HCM.

Les résultats des études de patch-clamp ont montré que la durée du potentiel d'action (APD) enregistrés à différentes fréquences de stimulation est nettement prolongée dans des cardiomyocytes provenant de patients souffrant de HCM (les cardiomyocytes HCM) par rapport aux témoins (figure 5A et 5B). Pour vérifier le maintien de réponses physiologiques dans les myocytes isolés, nous avons testé les effets de l'isoprotérénol, utilisé à 10-7 M (Figure 5C): β-adrenergic stimulation produit le raccourcissement de l'AP prévu dans les myocytes de contrôle. Depuis prolongée APD conduit à un risque accru de début après dépolarisations (EADS) 23, l'apparition d'EADS, détecté dépolarisations spontanées au cours de la phase de plateau de l'AP, a été mesurée. Dans les cardiomyocytes HCM, EADS étaient significativement plus fréquentes par rapport aux témoins (figure 5D). Trace représentative montrant de multiples EADS est représentée sur la figure 5E

Pour tester si longues anomalies actuelles APD et d'ions peuvent affecter les mécanismes de couplage excitation-contraction dans les cardiomyocytes HCM, les propriétés de Ca 2 + intracellulaire variations ont été évalués pendant la stimulation. L'amplitude de Ca 2 + dans des conditions transitoires évoquées courant-clamp ont été similaires dans HCM rapport à contrôler les cardiomyocytes (Figure 6A). A l'inverse, la cinétique de Ca2 + transitoire, étaient significativement plus longue dans HCM (Figure6B). En outre, la concentration de Ca 2 + intracellulaire diastolique était nettement plus élevée dans HCM rapport à contrôler les cardiomyocytes (figure 6C) et une augmentation plus en évidence lors d'une augmentation de la fréquence de stimulation.

Notamment, les cardiomyocytes isolés par cette méthode à partir d'échantillons ventriculaires humains ont également été utilisés avec succès pour d'autres applications, y compris des enregistrements de potentiel imposé des courants transmembranaires spécifiques (Figure 7A), Ca 2 + intracellulaire et / ou une cellule de raccourcir les enregistrements lors de la stimulation électrique de champ (Figure 7B) et l'évaluation de la structure fine du sarcolemme utilisant la microscopie confocale et étiquettes fluorescentes membranaires (figure 7C).

Figure 1 Figure 1. Organigramme de la procédure d'isolement des cellules.

Figure 2
Figure 2. Traitement des échantillons ventriculaires pour l'isolement de cellules (A). Montrant l'image représentative d'un échantillon de myocarde ventriculaire chez un patient qui a subi avec HCM opération de myectomie septal. Calibration bar = 5mm. (B) Des morceaux de coupe de tissu ventriculaire à partir d'un prélèvement chirurgical ventriculaires, être utilisées pour l'isolement cellulaire. barre d'étalonnage = 5mm. (C) Les images de l'appareil de digestion. Le dispositif comprend une chambre de digestion avec deux brosses de silicium: la brosse supérieure est capable de tourner lorsqu'il est déplacé par un moteur (D) l'image montrant le dispositif de digestion dans le bain thermostaté pendant la digestion enzymatique de tissu ventriculaire.. p>

Figure 3
Figure 3. Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humaine. (AB) Le panneau montre des microphotographies de deux champs de microscope (10x objectif) montrant suspensions de cardiomyocytes représentatives. Il convient de noter qu'environ 30% des cellules sont en forme de tige et montrent des stries claires. barre d'étalonnage = 100 um. (CE) Images représentatives de 3 cardiomyocytes humains isolés à partir d'un échantillon d'un patient, HCM (40x objectif). barre d'étalonnage = 20 um. (F) l'image montrant un homme cardiomyocytes ventriculaires touchées par la pointe de la pipette de patch pour les enregistrements. barre d'étalonnage = 20 um.

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Figure 4. D'enregistrement simultané du potentiel de membrane et de calcium intracellulaire. Trace représentative montrant le potentiel de membrane (ci-dessus) et de calcium intracellulaire (ci-dessous) enregistré à partir d'un seul myocyte isolé à partir d'un échantillon de HCM. Le myocytes est stimulée par la pipette de patch à 0,2 Hz, 0,5 Hz et 1 Hz.

Figure 5
Figure 5. Modifications de potentiels d'action dans les cardiomyocytes ventriculaires à partir d'échantillons HCM. (A) représentant superpose potentiels d'action suscité à 0,2 Hz, 0,5 Hz et 1 Hz à partir d'un myocytes de contrôle (gauche, traces de gris) et un myocytes HCM (à droite, traces noires ). (B) l'action moyenne la durée du potentiel à 90% de repolarisation (DPA 90%) à Ho Chi Minh (n = 81) etcardiomyocytes de contrôle (n = 29) sur les trois fréquences de stimulation testés. (C) Présence de EADs dans les cardiomyocytes provenant de patients HCM et des échantillons de contrôle (D). potentiels d'action superposés à 0,5 Hz à partir d'un myocyte de commande en l'absence (tracé continu) et en présence de 10 -7 M isoprotérénol. (E) trace représentative montrant le potentiel de membrane d'une cardiomyocytes provenant d'un patient HCM affichant plusieurs dépolarisations spontanées qui se produisent au cours de la phase de plateau (peu de temps après, des dépolarisations de DEE), marquées par des flèches. Stimuli sont marquées par des lignes courtes en dessous de la trace. ** = P <0,01 test t non apparié. Tous les panneaux de la figure sont modifiés avec la permission de Coppini et al. 2012 21.

Figure 6
Figure6. Modifications des transitoires de calcium dans les cardiomyocytes ventriculaires à partir d'échantillons HCM. (A) représentant superpose transitoires de calcium provoquées lors de la stimulation à 0,2 Hz via la pipette de patch dans un myocytes de contrôle (de gris) et une cellule HCM (noir). Notamment, l'amplitude du Ca 2 + transitoires ne diffère pas entre les deux cellules (B) cinétique de Ca 2 + transitoires à Ho Chi Minh (n = 42) et le contrôle (n = 24): les cardiomyocytes. Temps de relance à pic transitoire (TP ), le temps d'un pic à 50% décroissance (T50%) et le temps d'un pic à 90% de décroissance transitoire (T90%) sont présentées. (C) de longues traces représentatives montrant intracellulaire de Ca 2 + lors de la stimulation à 3 fréquences différentes dans HCM et myocytes de contrôle, soulignant l'augmentation diastolique Ca 2 + à des fréquences de stimulation élevées dans le myocytes HCM. (D) Moyenne diastolique Ca 2 + dans HCM (n = 42) et de contrôle (n = 24) des cardiomyocytes à 3 stimulation ra différentetes. ** = P <0,01 test t non apparié. Tous les panneaux de la figure sont modifiés avec la permission de Coppini et al. 2012 21.

Figure 7
.. Figure 7 autres applications expérimentales en utilisant des myocytes ventriculaires droits (A) A gauche: représentant superpose traces montrant de type L Ca 2 + courant enregistré sous tension pince à différentes tensions de la membrane avec un protocole spécifique (voir 21 pour plus de détails). Droite: de type L moyenne Ca 2 + densité de courant de crête de 18 cellules isolées à partir d'échantillons HCM à membrane différente. Tensions. (B) intracellulaire de Ca 2 + retracer enregistrée à partir d'un myocyte ventriculaire lors de la stimulation électrique de champ à 1 Hz. (C) Image confocale d'un cardiom ventriculaireyocyte partir d'un échantillon HCM colorées avec un colorant fluorescent lié à la membrane (Di-3-ANEPPDHQ). Il faut noter que la densité de ttubules est faible, ce qui suggère morphologique dans le remodelage de la membrane HCM.

Figure 8
Figure 8. L'appareil de digestion. (AB) Composants de l'appareil de digestion. Un moteur de rotation à vitesse variable est reliée à un premier bras en matière plastique, qui est reliée à une deuxième. Le second bras en plastique est amovible et reliée à la brosse supérieure. Brosses sont fabriquées avec un élastomère de silicone. Un moule négatif PTFE, avec 100 trous espacés d'environ 1,5 mm a été utilisé pour jeter les brosses de silicone liquide. L'espace intérieur du moule a un diamètre de 1,9 cm et est de 6 mm d'épaisseur, fabrication de brosses de la même taille. Les trous situés sur un côté du moule sont réalisées en vue de produire de longs poils 8 mm lorsque les brossessont coulés et retiré du moule. Après que le silicone liquide est placé dans le moule, au moins 48 h sont nécessaires pour un durcissement complet. Les brosses sont montés à l'intérieur d'un tube de verre (diamètre intérieur = 2 cm, épaisseur 2 mm) et la chambre cylindrique formée par les deux brosses et les parois en verre est hermétiquement fermée par deux joints toriques en caoutchouc. Brosses doivent être poussés l'un vers l'autre; celle du bas est collée sur une base en plastique, tandis que celui du haut est collée à l'extrémité du bras en plastique du moteur et est donc capable de pivoter. (C) une vue sur la brosse supérieure agrandie. Il faut noter que la brosse doit être collé à l'extrémité du bras du moteur afin de le faire tourner (D) Les composants de la chambre sont montrés dans leur position finale. L'espace entre les deux brosses (la chambre réelle) est ~ 2 cm de large et 7-8 mm de haut; cet espace se glisse facilement 4.3 ml de tampon autres que jusqu'à 1 g de tissu du myocarde.

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Discussion

Nous avons décrit et validé une méthode pour isoler les myocytes viables à partir d'échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. A partir de protocoles décrits précédemment qui avaient été utilisées avec succès pour des cellules isolées à partir d'échantillons chirurgicaux auriculaire, la technique pour permettre la séparation des myocytes viables simples du malade myocarde ventriculaire a été développé et affiné. Les premiers rapports ont montré que l'isolement des cardiomyocytes simples à partir de morceaux de tissu auriculaire et ventriculaire douteux sélective repolarisant courants de potassium, ce qui entraîne des propriétés électrophysiologiques modifiées et les réponses à des stimuli physiologiques 8,24, alors que la livraison de l'enzyme contenant un tampon via la perfusion coronaire n'a pas altéré redresseur retardé isoler des courants dans les cellules 25. Malheureusement, l'isolement des myocytes ventriculaires humaines à partir de spécimens chirurgicaux de myocarde ventriculaire ne peut être effectuée par perfusion coronaire depuis l'intégrité des branches coronairesest perdu, en contradiction avec les coeurs explantées. Cardiomyocytes isolés à partir de morceaux du myocarde en utilisant notre méthode présentent une adaptation précise de durée potentielle d'action en réponse aux changements de la fréquence de stimulation ou de β stimulation adrénergique. Pour que ces réponses se produire, l'intégrité des canaux de potassium redresseur retard est nécessaire 26-28, suggérant l'intégrité globale de ces canaux n'est pas altérée par notre méthode d'isolement. En outre, les cellules isolées avec nos méthodes ne montrent pas seulement les réponses électrophysiologiques réguliers (figures 3 et 4), mais aussi afficher transitoires calciques de la forme et la durée prévues (figures 3 et 5) et de l'organisation sarcomérique régulière (figure 2) et des propriétés de raccourcissement (non représenté), ce qui suggère que l'intégrité de la structure globale de ces cellules est conservée par ce procédé d'isolation. Le principal progrès de cette méthode sur précédentetechniques sont fournies par le dispositif de digestion de conception nouvelle, qui délivre une agitation mécanique douce de morceaux de tissu, ce qui permet la séparation de la cellule unique sans dommages excessifs. En outre, l'utilisation du dispositif de digestion nous a permis d'utiliser une plus faible concentration d'enzymes dans le tampon d'isolement des cellules; en particulier, nous utilisons une concentration beaucoup plus faible de la protéase non sélectif en comparaison avec les méthodes précédemment rapportés 24. Le dispositif est fabriqué sur mesure dans notre laboratoire: les schémas de construction sont présentés dans la figure 8.

La conception simple et de la structure, il est très facile à reproduire pour le succès de ce protocole. La légende de la figure 8 décrit également les procédures requises pour produire les pinceaux en silicone et la construction de la chambre de grattage. En raison des avantages du dispositif de digestion, un nombre relativement élevé de cellules viables peut être obtenue à partir d'une quantité relativement faible de tissu ventriculaire (aussi peu que 100 mg).Une méthode déjà publié 19 a été montré pour fournir un calcium myocytes tolérants de petites biopsies (même <20 mg). Toutefois, le rendement des myocytes rapporté était très faible et les auteurs n'ont pas montré que des cellules isolées avec cette méthode sont réalisables pour la caractérisation du cyclisme de calcium intracellulaire et la fonction contractile. Cette technique est potentiellement applicable à de nombreux patients en chirurgie, étant donné que de petites portions de la cloison interventriculaire sont fréquemment excisés au cours de la procédure de remplacement de la soupape (par ex. Remplacement de valve aortique). Cependant, le point crucial pour obtenir un isolement réussi est une initiation rapide de la procédure après le prélèvement de la salle d'opération. Par conséquent, il est nécessaire pour le laboratoire de la cellule pour être à proximité immédiate de la clinique de chirurgie cardiaque, pour que cette technique soit fructueuse. En outre, une activité enzymatique appropriée est également extrêmement important pour un isolement réussi. Etant donné que l'activité de la protéase non sélectif of chaque lot de collagénase est généralement pas entièrement testé, chaque lot est susceptible de se comporter différemment lors de l'isolement cellulaire. Il est donc essentiel pour ajuster la concentration finale de la collagénase pour atteindre les meilleurs résultats. Nous conseillons observons suspension de cellules sous le microscope à chaque cycle, afin d'être sûr que les cellules viables commencent à apparaître au cycle de 3 apparition précoce des cellules suggère l'activité enzymatique excessive et invite à la réduction de la concentration de l'enzyme.; apparition de cellules après le cycle 3 suggère activité enzymatique insuffisante. Dans notre expérience, c'est l'indicateur le plus efficace de la concentration de l'enzyme correcte.

Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour obtenir des cardiomyocytes simples du septum inter-ventriculaire des patients HCM une obstruction des voies d'éjection du ventricule gauche en cours de chirurgie septale myectomie, ainsi que de non-défaut patients chirurgicaux non hypertrophiques 21. Les résultats de ce papiermontrent que les myocytes isolés par cette méthode peuvent être utilisés pour l'évaluation électrophysiologique complète avec des techniques de patch-clamp tout en évaluant les anomalies EC-couplage, par l'enregistrement de la dynamique du calcium intracellulaire avec des colorants fluorescents. La procédure d'enregistrement décrit ici a permis de recueillir plusieurs paramètres physiologiques de la cellule avec un seul enregistrement de chaque cellule, produisant ainsi une grande quantité de données avec un nombre limité de cellules et d'échantillons. Merci à ces avantages, cette méthode a été utilisée avec succès pour caractériser les anomalies fonctionnelles spécifiques de cardiomyocytes ventriculaires chez des patients HCM, par rapport aux patients non hypertrophiques 21. Les anomalies de courants ioniques et durée potentielle d'action, ainsi que des anomalies cinétiques od intracellulaire de Ca 2 + vélo ont été clairement identifiés en utilisant cette technique, avec une grande reproductibilité. En outre, nous avons montré que le traitement avec un inhibiteur sélectif de la fin de Na + vs. placebo chez des patients atteints de CMH 29, qui est actuellement en cours.

Human disponibilité de l'échantillon cardiaque est relativement modeste, même dans des centres spécialisés, ce qui peut limiter une large applicabilité de cette technique. Néanmoins, la qualité de l'information qui peut être obtenue directement à partir d'échantillons de patients sur les maladies liées à des changements dans la fonction de cardiomyocyte est comparable à celle pouvant être obtenue à partir de modèles animaux de la MCH et d'autres maladies cardiaques. Compte tenu des différences importantes entre lesphysiologie des myocytes cardiaques humaines et murines, les données de l'évaluation fonctionnelle de myocytes humains peut être extrêmement précieux. En conclusion, nous pensons que les futures applications de cette technique peuvent contribuer de manière significative à la connaissance des maladies cardiaques, depuis notre protocole prévoit la possibilité d'effectuer une série complète d'évaluations fonctionnelles directement sur les cellules des échantillons de patients, avec une valeur immédiate de translation.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Union européenne (STREP projet 241577 "GRAND COEUR" 7e programme-cadre européen de CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Téléthon GGP07133 (CP) et Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

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References

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