Dissektion der
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Published 3/04/2014
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Biology

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie premigratory Schädel Neuralleiste (NC) von Xenopus laevis neurulas sezieren. Diese Explantate können sich auf Fibronektin und in vitro kultiviert beschichtet werden, oder zurück in die Wirts Embryonen gepfropft wird. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der NC-Epithel-Mesenchym-Übergang an, Migration und Differenzierung.

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Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

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Abstract

Die Neuralleiste (NC) ist eine transiente dorsalen Neuralrohr Zellpopulation, die ein Epithel-Mesenchym-Übergang zu (EMT) am Ende Neurulation erfährt wandert ausgiebig gegen verschiedene Organe und unterscheidet in viele Arten von Derivaten (Neuronen, Glia, Knorpel und Knochen, pigmentierte und endokrine Zellen). In diesem Protokoll beschreiben wir, wie Sie die premigratory Schädel NC von Xenopus laevis Embryonen zu sezieren, um die NC-Entwicklung in vivo und in vitro zu untersuchen. Der Frosch-Modell bietet viele Vorteile, die frühe Entwicklung zu studieren, reichlich Chargen verfügbar sind, Embryonen entwickeln sich schnell, in vivo Gewinn und Verlust der Funktion Strategien ermöglichen Manipulation der Genexpression vor NC-Dissektion in den Geber-und / oder Host-Embryonen. Die NC-Explantate auf Fibronectin ausplattiert und in vitro-Studien verwendet werden. Sie kann für mehrere Tage in einem serumfreien definierten Medium kultiviert werden. Wir beschreiben auch, wie NC-Explantate zurück pfropfenin Wirts Embryonen für Studium NC Migration und Differenzierung in vivo.

Introduction

Die Neuralleiste (NC) ist eine transiente embryonalen Zellpopulation, die aus dem Neuralrohr Ende Neurulation in Wirbeltierembryonen entsteht. Die Signal-und genetischen Ereignissen, die NC-Spezifikation steuern so früh wie Gastrulation. Die NC ist an der Grenze zwischen der neuralen und nicht-neuralen Ektoderm durch Signale von umliegenden Gewebe Rücken angegeben. Am Ende der Neurulation, NC-Zellen durchlaufen eine Epithel-Mesenchym-Übergang zu (EMT) und Migration weitgehend im Embryo folgenden stereo Routen durch die Reaktion auf Umgebungsführungs Signale. Sobald sie ihr Ziel erreicht haben, unterscheiden sie sich in einer Vielzahl von Derivaten, z. B. Nervenzellen, Gliazellen, Knochen, Knorpel und pigmentierten Zellen 1-5. Durch ihren Beitrag zu vielen Zelltypen und embryonalen Geweben, Mängel bei jedem Schritt der NC-Zellen Entwicklung, von der Induktion bis zur endgültigen Differenzierung, können angeborene Syndrome genannt neurocristopathies 6 verursachen. Experimental Manipulation der Entwicklungs NC in verschiedenen Stadien - Spezifikation, EMT, Migration und Differenzierung - wird unser Verständnis der neurocristopathies verbessern und die Gestaltung der potenziellen therapeutischen Strategien.

Die Xenopus laevis Embryo ist ein Modell der Wahl, um NC-Entwicklung zu untersuchen. Eine große Anzahl von Embryonen sind leicht zu erhalten, und externe Befruchtung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Entwicklung. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell manipulieren X. laevis embryonalen Entwicklung. Gene gain-of-function-und Zuschlags sind leicht zu Mikroinjektion einzelnen Zellen des frühen blastulas durchzuführen. Embryonale Gewebe können für die in vitro Reassoziation 7-11 oder Back-Pfropfen Assays 12,13 geschnitten werden.

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man sezieren premigratory Schädel NC in X. laevis spät neurulas, vor der Migration. Diese Explantate auf Fibronektin-coate kultiviert werdend Platten zu Migration und Differenzierung in vitro-Studie bei Versuchsbedingungen gesteuert. NC-Explantate können auch in normalen oder manipuliert Host Embryonen gepfropft, um ihre Migration und Differenzierung in vivo zu untersuchen.

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Protocol

Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verfeinerung entsprechen.

1. Vorbereitung der Fibronektin-beschichteten Schalen 14

  1. Pipette 500 ml von 10 mg / ml Kulturqualität Fibronektin in 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) verdünnt in ein Standard-Kunststoff-Petrischale (Ø 40 x 11 mm). Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Hinweis: Wenn Sie Glasschalen oder Glasdeckgläser für die anschließende Bildverarbeitung, mit einem 100 mg / ml Fibronektin-Lösung.
  2. Dreimal mit 1x PBS spülen.
  3. Ersetzen PBS mit 500 ml 1x PBS/0.1% Rinderserumalbumin (BSA). Inkubieren bei 37 ° C für 30 min.
  4. Dreimal mit 1x PBS spülen.
  5. Füllen Sie mit 1x PBS und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung (in der Regel für 24 bis 48 h).

2. Dissection der NC-Explantate

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  • Vorbereitung 3/4 Normale Amphibie Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 × PBS, 50 mg / ml GENTAMYCIN 10,15). Nicht mehr als 1 Woche halten nicht zum Sezieren, Lagerung bei 4 ° C Ältere NAM können zur Herstellung Agarose-beschichteten Präparation Schalen (unten) verwendet werden.
  • Vorbereitung 60 mm Petrischalen für die Präparation mit 10 ml einer 2% Agarose in 3/4 NAM beschichtet.
  • Sammeln Dissektionswerkzeuge: Kunststoff Pasteur Pipetten, auf Stifthalter (siehe Tabelle für Referenzmaterialien), ein "Augenbraue Messer" (mit Augenbraue Haare in Paraffin an der Spitze einer Glaspasteurpipette 16 eingebettet ist), zwei feine montierten feinsten Insektenstift Dissektion Pinzette, Pipette und Tipps P1000, ein Fernglas Stereoskop mit Vergrößerung 8-40x bis 50, eine helle Lichtquelle mit optischen Fasern Guides. Alle Werkzeuge sezieren sollte sauber gehalten werden, nach jedem Versuch, spülen sie zweimal mit destilliertem Wasser, einmal with 100% Ethanol und trocknen lassen. Lager weg von Staub.
  • Füllen Sie die Schale mit frischen Präparation NAM fast an die Spitze.
  • Erhalten X. laevis Embryonen nach Standardverfahren 10 und älter werden, bis sie Neurulastadium 16 zu erreichen (nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungs Tabelle 17).
  • Zeigen Stufe 16 Embryonen in die Dissektion Gericht mit der Plastik-Pasteurpipette.
  • Führen Sie alle folgenden Schritte im Rahmen des binokularen Umfang. Entfernen der Dottermembran mit zwei Zangenpaaren. Achten Sie darauf, den dorsalen Teil der Embryonen schädigen.
  • Warten Sie, bis die Embryonen Stufe 17 erreicht, um die Präparation beginnen. Stufe 17 ist angebracht, da der Neuralleiste ist deutlich vom Neuralrohr gesetzt, im Gegensatz zu früheren Phasen. Nach der Stufe 17, beginnt NC Migration und Vermischung mit dem umgebenden Mesenchym.
  • Graben Sie ein kleines Loch in der Agarose mit einer Pinzette, eine Nische für den Embryonen, um aufrecht zu erhaltensie während der Präparation. Legen Sie ein Embryo dorsalen Seite nach oben. Hinweis: Knetmasse kann verwendet werden, um die Embryonen statt graben ein Loch in die Agarose zu halten.
  • Einen Einschnitt in der seitlichen Teil des vorderen neuronalen fach mit der Augenbraue Messer und Insektenstift. Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief in den Embryo zu gehen: Ziel ist es, durch 2-3 Zellschichten (zu erreichen nie so tief wie die Archenteron!) Geschnitten. Während der gesamten Dissektion Prozess, niemals zulassen, die seziert Gewebe in Kontakt mit der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, da X. eingeben laevis embryonalen Gewebe durch die Oberflächenspannung lysiert.
  • Machen Sie eine zweite parallele Schnitt in der mehr dorsalen Teil des neuronalen fach mit den gleichen Instrumenten.
  • Wenn nötig, schalten Sie das Gericht um 90 °. Stellen Sie eine dritte senkrecht Schnitt mit der Augenbraue Messer und Insektenstift, an der hinteren Seite der ersten zwei Einschnitte. Die NC ist eine dicke Masse von Zellen unter dem pigmentierten Außenschicht des Ektoderms, Seitenzum Neuralrohr.
  • Verwenden Sie die Spitze der Augenbraue Messer, um das pigmentierte Ektodermschicht von der zugrunde liegenden NC lösen, ab dem dritten Einschnitt Rand.
  • Verwenden Sie die Seite der Augenbraue Messer, um die ab dem dritten Einschnitt NC Gewebe zu lösen. Die NC-Gewebe ist eher gräulich, während die zugrunde liegenden Kopf Mesoderm ist weiß. Sorgfältig trennen die NC aus dem Mesoderm.
  • Nehmen Sie den NC Gewebe vorne aus der Augenblase, und auf dieser Ebene geschnitten, um die Explantation zu befreien. Als Kontrolle für die ersten Experimente, die Überprüfung snail2 Ausdruck (eine kanonische NC-Marker) in einigen Explantate durch in situ-Hybridisierung wird empfohlen.
  • 3. Plating Explantate auf Fibronektin

    1. Füllen Sie das Fibronektin-beschichtete Schale mit modifizierten Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, 5 mM Na2CO 3, K-Gluconat 4,5 mM, Na-Gluconat 32 mM MgSO 4 1 mM CaCl 2 1 mM, BSA 0,1%, pH-Wert einstellen auf 8,3 mit 1 M Bicin
    2. Übertragen Sie die Explantate in den Fibronektin-beschichtete Schale mit einem P1000 Pipette. Lassen Sie niemals die Explantate auf die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche zu berühren. Zunächst Pipette etwas Flüssigkeit in die Spitze, dann die Explantate, dann einige wieder flüssig. Nehmen Sie keine Luft nicht zulassen in die Spitze während der Übertragung der Explantate in den Fibronektin-beschichtete Schale. Sobald die Spitze innerhalb der Flüssigkeit des Fibronektin-beschichtete Schale, lassen Sie die Explantate langsam nach unten gehen durch die Schwerkraft, oder drücken Sie ganz sanft. Vermeiden Auswerfen der Explantate zu schnell.
    3. Zeigen 10-30 Explantate in die Schüssel mit der Augenbraue Messer. Vermeiden Sie die Seiten der Schüssel, die nicht ausreichend für die anschließende Bild sind.
    4. Versuchen Sie nicht, die Antenne zu bewegen, bis die Explantate wurden auf der Fibronektin angebracht (es dauert ca. 15-30 min). Wenn nötig, verschieben Sie die Schüssel sehr sorgfältig.
    5. Die Schale in einem Kühlbrutschrank (zwischen 15-20 ° C, Temperatur-Diagramm siehe 17). Bei 15 ° C platziert, Zellen are in der Regel effizient Migration und Streu nach 6 h Inkubation (dieser Zeitpunkt kann zwischen den Experimenten variieren).

    4. Pfropfen Explantate in Host-Embryonen

    1. Schneiden Sie ein feines Deckglas in sehr kleine Stücke mit groben Pinzette. Die Größe der Stücke sollten etwa 1,5 mm 2 betragen. Tauchen Sie die Stücke in eine Petrischale mit 3/4 NAM oder PBS mit einer Pinzette.
    2. Vorbereitung der Host-Embryo: sezieren die Gastgeber in NC 3/4 NAM wie in 3) mit besonderer Sorgfalt nicht beschrieben, um den Host Embryo schädigen beim Entfernen der Dotterhaut und Zerlegung der NC. Die Gewebespannung neigt dazu, die Größe der Ablation zu erhöhen: Lassen Sie die Host-Embryo teilweise heilen, während der Zerlegung des Spenders Embryo.
    3. In einem anderen Agarose-beschichtete Schale oder in einem anderen Teil der gleichen Schüssel, sezieren die NC Explantation vom Spender Embryo in Protokoll 3 beschrieben. Übertragen Sie die NC-Transplantat in die Schale mit den Host mit Sorgfalt, wie inProtokoll Nr. 3.
    4. Sofort legen die NC Explantat auf den Host-Bereich mit einer Pinzette abgetragen. Die Explantation sollte teilweise zu befestigen. Legen Sie ein Deckglas auf den Embryo gepfropft, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten. Wählen Sie ein Stück Glas größer als der Embryo nicht zu beschädigen. Der Embryo wird ein wenig abgeflacht sein.
    5. Warten Sie mindestens 15-20 Minuten, dann entfernen Sie vorsichtig das Deckglas. Lassen Sie den Embryo wieder für weitere 10 min pipettieren und sorgfältig in ein sauberes Geschirr mit 3/4 gefüllt NAM, mit der Plastik-Pasteurpipette.

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    Representative Results

    Wenn auf Fibronektin zogen, legen die Neuralleiste Explantate schnell (15-30 min) und der Explantation breitet sich flach innerhalb von 2 h (Abb. 1A). Nach 3-6 Stunden Zellen beginnen sich zu zerstreuen. Nach 24 h bei 15 ° C, haben viele Zellen begonnen, von dem Explantat (Fig. 1B und 1C) zu migrieren. Eigelb macht Zellen sehr unter Phasenkontrast (Abbildung 1B) hell ist. Handy Vorsprünge (filopodes und lamellipodes) eindeutig nach Phalloidin-Färbung des Aktin-Zytoskeletts (Abbildung 1C) sichtbar.

    Für die orthotope Transplantation Experiment wurden die Spender Embryonen mit GFP-mRNA, um die transplantierten Zellen in das unbeschriftete Wirtsembryo injiziert folgen. Die Schädel NC wurde auf einer Seite des Host abgetragen; 30-60 min nach der Operation das Implantat verheilt ist, anstelle der abgetragenen Host Schädel NC (1D, 2 Stunden nach der Transplantation). Ein paar Stunden später, die GFP-positiven Zellen gewandert sindaus der Explantation und folgte den stereotypen Zugwege von NC-Zellen in Richtung Bauch craniofacial Standorten (1E). In Kaulquappen haben NC-abgeleiteten kraniofazialen Strukturen (1G) entwickelt. Wenn Schädel NC abgetragen wurde, wurden diese Strukturen fehlen, was zu einer verkürzten Gesicht mit Augen neben dem Zementdrüse (1H, rot Pfeile). In gepfropft Kaulquappen, haben die Spender NC-Zellen auf die cranio-Gesichtsstrukturen beigetragen, was zu einem normalen Gesicht Morphologie (1F und 1I, grüne Pfeile).

    Figur 1
    1. In vitro und in vivo Verhalten des explantierten Schädel NC. AC)   Premigratory NC wurde seziertaus einem Stufe 17 neurula Embryo und auf eine Fibronektin-beschichtete Schale. A) 2 h nach der Beschichtung überzogen, hat das Explantat befestigt und zu verbreiten. B) 24 Stunden nach der Plattierung Zellen effizient auf der Fibronektin migriert. C) Lamellipodien und Filopodien . sind klar in der Migration NC-Zellen mit Phalloidin (grün) markiert DI) Neurulastadium gesehen 17 GFP + beschriftet premigratory NC wurde aus einer GFP-injizierten Embryo entnommen und in eine Wirts Embryo, aus der Schädel NC wurde auf Stufe 17 abgetragen Back-gepfropft - 18. D) Zwei Stunden nach Transplantation, das Explantat geheilt ist. EF) Grafted NC Zellen aktiv aus migriert und bevölkert die Kieferstrom als bei Kaulquappenstadium 31 und 41. Verstoß) Die Steuerstufe 41 Kaulquappe gezeigt. H) Abtragen die NC führte zu einem dramatischen Scheitern von Gesicht und Augenentwicklung (H: beachten Sie, dass der Zement Gland entwickelt sich benachbart dem Auge aufgrund des Fehlens von NC-Zellen Auffüllen der Backenflächen, rote Pfeile. . Vergleich auf Kaulquappe in G kontrollieren) F, I) Im Gegensatz dazu die veredelten Zellen NC Auge und Gesichtsschädelstrukturen Entwicklung (F, I, grüne Pfeile) restauriert AC, Maßstabsbalken = 100 mm;. DI, Maßstabsbalken = 1 mm . D, dorsale Ansicht. EI, Seitenansichten. Diese Zahl hat sich von Milet et al geändert. 12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

    Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Technik, um premigratory Schädel NC in X. laevis Embryonen Explantation. Die für die Experimente verwendeten Embryonen müssen robust sein und auch zu heilen. Verwerfen Charge von ungesunden Embryonen. Darüber hinaus wachsen Embryonen bei verschiedenen Temperaturen (von 12 bis 18-20 ° C), um Neuralleiste in Stufe 17 und nicht später herauszuschneiden. Nach der Stufe 17 kann Neuralleiste, die mit Kopf Mesoderm gemischt werden und kann nicht vollständig entfernt werden. Xenopus Gewebe zu heilen schnell und verlieren ihre Haftung zu anderen Geweben. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und Ort der Neuralleiste Explantate in den Wirt, sobald es aus dem Spender herausgeschnitten.

    Bezüglich der in-vitro-Experimenten kann Fibronektin Kulturschalen mit Bakterien oder Pilzen nach ein paar Tagen verunreinigt. Verwenden Antibiotikum und reinigen oder sterilem Material und Lösungen so oft wie möglich.

    Dieses Verfahren wird f optimiertoder Schädel Neuralleiste. Tatsächlich wird diese Zellpopulation gut definiert und in der Stufe 17 Xenopus-Embryonen lokalisiert. Leider ist dieses Modell nicht geeignet, solche Experimente am Stamm NC durchzuführen. Vogel-Embryonen sind besser geeignet für diejenigen, die sich für die Manipulation solcher Stamm NC Zellpopulation sind.

    Die in diesem Protokoll beschrieben Explantate verwendet werden, um verschiedene Aspekte der NC-Verhalten zu untersuchen, sowohl in vivo als auch in vitro. Das NC-Programm molekularen Entwicklungs ist weitgehend in Wirbeltieren 19 erhalten. Frosch-Entwicklung ist ein leistungsfähiges Modell für Wirbel NC EMT, Migration und Differenzierung zu studieren. X. laevis embryonalen Zellen enthalten genügend Eigelb ihr Überleben in vitro für mehrere Tage ohne Zugabe eines externen Nährstoff ermöglichen. Somit können in vitro-Studien der Effekte von verschiedenen Wachstumsfaktoren oder chemischen Verbindungen zu testen, in einer einfachen und vollständig kontrollierte Kulturmedium. Solche Experimente wurdenkonzipiert, EMT und Migration, einschließlich der Untersuchung der Auswirkungen von Chemo-oder Lockstoffe chemo-Repellents, der Aktivierung oder Sperrung Signalwege usw. 14,20-24 Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um verbesserte gerichtet NC Differenzierungsprotokolle entwerfen analysieren. Im Rahmen der Entwicklung von Protokollen für die regenerative Medizin, erhalten diverse NC-abgeleiteten Zelltypen in vitro konnte in Wirkstoff-Screening für das Verständnis und die Behandlung verwendet werden neurocristopathies 25,26.

    NC-Entwicklung wird durch ein komplexes Wechselspiel zwischen Zell autonomen Regelungen und Signale von den umgebenden Geweben orchestriert. Experimentelle Manipulationen der Genexpression, entweder in der Spender NC oder in der Host-Embryo, lassen diskriminierende Zelle autonom von noncell autonomen Aspekte der NC-Entwicklung. Die Kombination von gain-of-function-und Knock-down-Ansätze zu diesem Protokoll für die in-vitro-Kultur und in vivo-Transplantation erfolgreich nutzen wordend 14,21,23,27-36.

    Diese Technik lässt sich an anderen Geweben in Wirts Embryonen pfropfen und testen für ihre Migrations-und Differenzierungspotenziale werden. Zum Beispiel haben wir die pluripotenten Blastocoel Dach Ektoderm (die "animal cap") verwendet werden, um für eine minimale Transkriptions Schalter für NC-Entwicklung suchen. Wir haben die Wirkung von zwei Transkriptionsfaktoren, pax3 und ZIC1, NC Engagement und die nachfolgende Entwicklung untersucht. Tierkappen mit pax3 und ZIC1 gain-of-function wurden auf Fibronektin in vitro verchromt oder in Wirts Embryonen backgrafted. Wir fanden, dass Pax3/Zic1-induced Zellen wandern und zu differenzieren, wie Bona-fide-NC-Zellen in vitro und in Wirts 12 Embryonen.

    Zahlreiche molekularen Mechanismen, die NC EMT und Migrationsfragen sind auch in metastatischen Verbreitung in der Krebs 37 beteiligt. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache, billige und effizienent-Tool für Entwicklungsbiologen und anderen Wissenschaftlern, um die grundlegenden Mechanismen dieser wichtigen Zellverhalten zu erforschen.

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Acknowledgements

    Die Autoren danken Adeline Dolly für die Bilder der Explantation auf Fibronektin, Eric Theveneau für hilfreiche Diskussionen und der Tierhaltung des Institut Curie. CM ist ein Postdoc der Region Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche) und Agence Nationale de la Recherche. Diese Arbeit wurde von der Université Paris Sud (Attractivite 2011), dem Centre National de la Recherche Scientifique (Aktion thematique Incitative et sur-Programm), Verband pour la Recherche contre le Cancer Zuschuss SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, und Agence Nationale de la finanziert Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programm Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

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