Оптимизация и использование

Biology
 

Summary

Переходные производство белка в Nicotiana растений на основе вакуумной пропитки с Agrobacteria проведения запуска векторов (Табак вирус основе мозаики) является быстрым и экономический подход для получения вакцинных антигенов и терапевтических белков. Мы упростили процедуру и улучшение накопление целевой счет оптимизации условий культивирования бактерий, отбора видов хозяев, и со-внедрения РНК глушителей ограничителей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Переходный производство белка Agrobacterium-опосредованной у растений является перспективным подходом для получения вакцинными антигенами и терапевтических белков в течение короткого периода времени. Тем не менее, эта технология только начинает применяться к крупномасштабных производственных столько технологических препятствий для расширения в настоящее время преодолены. Здесь мы демонстрируем простое и воспроизводимый метод для производства в промышленных масштабах переходный белка на основе вакуумной инфильтрации Nicotiana растений с Agrobacteria проведения запуска векторов. Оптимизация выращивания Agrobacterium в АБ среды позволяет прямое разбавление бактериальной культуры в Milli-Q воды, что упрощает процесс инфильтрации. Среди трех тестируемых видов Nicotiana, N. excelsiana (Н. benthamiana × N. Excelsior) была выбрана в качестве наиболее перспективного хозяина из-за легкости проникновения, высокий уровень продукции белка-репортера, и около двух-естарый выше производство биомассы в контролируемых условиях окружающей среды. Индукция Agrobacterium укрывательство pBID4-GFP (вируса табачной мозаики на основе) с использованием химических веществ, таких как ацетосирингона и моносахаридов не влияло на уровень производства белка. Проникнув завод под 50 до 100 мбар в течение 30 или 60 секунд в результате около 95% проникновения растительных тканях листа. Проникновение с Agrobacterium лабораторного штамма GV3101 показали высокий производство белка по сравнению с Agrobacteria лабораторных штаммов LBA4404 и C58C1 и дикого типа Agrobacteria напрягает AT6, AT10, at77 и A4. Совместная экспрессия вирусного РНК глушителей супрессоров, p23 или p19, в N. benthamiana привело к более ранней накопления и увеличения производства (15-25%) от белка-мишени (гемагглютинина вируса гриппа).

Introduction

Растения в настоящее время признается в качестве безопасной, надежной, масштабируемой и недорогой платформы для производства гетерологичных рекомбинантных биофармацевтических препаратов и промышленных белки 1-3 и имеют важные преимущества перед микробных и животных систем экспрессии клеток 4. Растения способны выразить правильно сложенные белки с пост-трансляционных модификаций, включая собранные мультимерных антител 5-7. Несколько растительного происхождения рекомбинантные фармацевтические белки проходит клинические испытания 8. К ним относятся пациент-специфических рекомбинантных вакцин идиотипа (ScFv) для лечения неходжкинской лимфомы в 9, гемагглютинин основе пандемического и сезонного кандидатов вакцины против гриппа 10,11 (Каммингс и др.., Который был представлен вакцины), анти-Streptococcus поверхностный антиген I / II антитела для лечения кариеса зубов 12 и человеческого инсулина при лечении диабета 13. Кроме того, человеческий выздоровеетmbinant глюкоцереброзидаза для фермента терапии у пациентов с болезнью Гоше был одобрен в Израиле и США и предоставляется в рамках Программы доступа Расширенной за пределами США 14,15.

Гетерологичных белков могут быть получены в стабильно трансформированных (трансгенных или транспластомных) или временно трансформированных растений. Переходный производство белка предлагает несколько преимуществ по сравнению с производством в трансгенных растений, в том числе короткого периода времени, чтобы достичь экспрессию и накопление 16, и может быть достигнуто путем введения бактериальных двоичные векторы или рекомбинантный растительные вирусные векторы в растительные ткани 4. Самые передовые переходный система выражение основано на использовании "Launch векторов", которые сочетают компоненты растительных вирусов и бинарных плазмид, и поставляемых агроинфильтрации 17,18. Агроинфильтрации вектора ракеты на основе вируса мозаики табака (ВТМ) успешно применяется в лабораториимасштабировать для производства вакцинных антигенов против патогенов, таких как вирус папилломы человека 19, Yersinia Pestis 20, вирусы гриппа A 21,22, Bacillus сибирской язвы 23, и вирус оспы 24 в N. benthamiana уходит. Агробактериальная кратковременная экспрессия также перспективным методом одновременного производства нескольких белков 2,25-27. Например, растительные переходные системы экспрессии были использованы для получения опухоль-специфичные рекомбинантных антител, 28,29 гликозилированного рекомбинантного антитела против рецептора эпидермального фактора роста 30, а также моноклональное антитело, специфичное для сибирской язвы протективный антиген 31,32. Со-инфильтрация Nicotiana benthamiana растений с гена-мишени и подавитель результатов молчание генов в повышенной экспрессии белка-мишени 33,34.

Агроинфильтрации является распространенным методом для равномерно IntroduCing бактерии, несущие ген интереса в тканях растений 35-37. Вакуумная инфильтрация Agrobacterium для временной экспрессии генов в неповрежденной листьях растений является быстрым, масштабируемой и полезный метод для производства чужеродных белков без необходимости генерировать трансгенные растения 38-41. Во время вакуумной агроинфильтрации, растения перевернул с ног на голову и надземные части погруженным в Agrobacterium подвески. Тогда вакуум применяется вызывая газы эвакуироваться из листьев межклеточных пространствах через устьица. Быстрое повторное нагнетание После выхода из вакуумных приводит к инфузии Agrobacterium суспензии в лист. После вакуумной инфильтрации Agrobacteria, растения культивируют и целевой выражение контролируется. Самые высокие уровни целевой выражения обычно наблюдаются 2-3 дней после инфильтрации (точек на дюйм) с двоичным вектором и 4-7 руб с вектором запуска, после чего уровень экспрессии обычно уменьSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens является наиболее широко используемым средством для доставки гена интереса в растение для производства белка. Агроинфильтрации работает исключительно хорошо в N. benthamiana но относительно слабо и в большинстве других растений, в том числе арабидопсис 46.

В этом исследовании, мы разработали простой, эффективный и экономичный способ переходных продукции белка в 5-6 недельной давности N. benthamiana помощью A. tumefaciens инфильтрации. Основным недостатком промышленного масштабирования методики агроинфильтрации является центрифугирование добываемых бактерий и ресуспендирования бактериальных гранул в среде, содержащей 4'-гидрокси-3 ', 5'-диметоксиацетофенон (ацетосирингона), моносахариды, и 2 - (N-морфолино) -этансульфоновой кислоты (MES) буфер для индукции генов Вир. Мы были в состоянии преодолеть эти проблемы за счет оптимизации Agrobacterium N. benthamiana и Н. эксцельсиор, а также в гибридных N. excelsiana.

Protocol

1. Растениеводство

Для последующего агроинфильтрации мы оценивали два дикого типа видов Nicotiana (Н. benthamiana и Н. Excelsior) и гибридные (Н. excelsiana) вырос на гидропонике на минеральной ваты в закрытых помещениях.

  1. Замочите ROCKWOOL плиты в растворе завод удобрений.
  2. Сейте семена дикого типа N. benthamiana, Н. Excelsior и Н. excelsiana (гибрид Н. benthamiana × N. Excelsior) на питательные вещества замачивают Rockwool поверхность.
  3. Выращивать растения из семян в контролируемых условиях (24 ° С и 40-65% относительной влажности) и долго-дневный фотопериода (14 ч света и 10 ч темноты, с освещением 130-150 мкЕ м -2 с -1) для 4-5 недель для N. benthamiana и Н. excelsiana, и 5-6 недель для N. Excelsior.

2. Конструирование векторов для Agroinfiltratион

  1. Вставьте ген синтетический репортер (зеленый флуоресцентный белок [GFP]), полнометражные гемагглютинина (HA) от A/California/04/2009 штамма вируса гриппа (HAC1) и модернизирована лихеназы фермента (LicKM) 18 отдельно в вектор Запуск pBID4 18 (ВТМ основе вектор), чтобы получить pBID4-GFP, pBID4-HAC1 и pBID4-LicKM соответственно 18,32,41,47.
  2. Представьте 10-50 нг pBID4 балансовую GFP или HAC1 в электрокомпетентных клетках А. tumefaciens штамм GV3101 и LicKM в электрокомпетентных клетках А. tumefaciens штаммов GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 и A4 с ген MicroPulser электропоратора.
  3. Используйте преобразованный Agrobacteria для инфильтрации экспериментов если не указано иное.

3. Вакуумные инфильтрация Agrobacterium в Nicotiana растений

  1. Расти А. tumefaciens штаммов в течение ночи (O / N) в LB среде, Yeb медий или AB среде, дополненной 50 мг / л канамицина при 28 ° С при встряхивании при 200-250 оборотов в минуту.
  2. Развести Agrobacteria в Milli-Q воды до оптической плотности при 600 нм (600) от 0,5 или центрифуга Agrobacterium клеток, выращенных в LB или Yeb или AB в 4000 × г в течение 10 мин при 4 ° С, повторно приостанавливать в индукционной среде (1x MS соли, 10 мМ MES, 200 мкМ ацетосирингона, 2% сахарозы [MMA]) до 600 0,5, и перемешивают при комнатной температуре в течение 1-3 ч, если не указано иное.
  3. Проникнуть растений в вакуумной камере путем погружения Nicotiana растений воздушные ткани в Agrobacterium суспензии и нанесения 50-400 мбар вакууме в течение 30 или 60 секунд. Применяется Оптимальный инфильтрация обычно на 50-100 мбар в течение 60 секунд.
  4. После вакуум нарушается, удалить растений из вакуумной камеры, промыть в воде, и расти в течение 5-7 дней при тех же условиях роста, используемых для роста предварительно инфильтрации.
  5. Чтобы проверить эффективностьхимических веществ, индуцирующих ген вир Agrobacterium, различные концентрации ацетосирингона (0, 100, 200 или 400 мкм) были добавлены к суспендированного в буфере инфильтрации Agrobacteria (1x MS, 10 мМ MES, 2% глюкозы). Для эффекта моносахарида по индукции гена ВИР различным процентным содержанием глюкозы (0, 1, 2 или 4%) были добавлены к Agrobacteria суспендировали в буфере инфильтрации (1x MS, 10 мМ MES, 200 мкМ ацетосирингона). N. benthamiana растения проникли как упоминалось выше в шагах 3.3 и 3.4).
  6. Agrobacterium лабораторных штаммов GV3101, C58C1 и LBA4404 и штаммов дикого типа A4, AT06, AT10, и At77 несущие вектор pBID4-LicKM разводили в Milli-Q воды в 600 0.5. N. benthamiana растения проникли с каждого конкретного штамма, как указано выше в шагах 3.3 и 3.4.

4. Процедура сотрудничества агроинфильтрации для вирусного глушителей Suppressor

  1. МIX Milli-Q воды разбавлено Agrobacterium GV3101 культуры, несущие ген GFP и вирусную глушителей подавитель p19 томатного пушистый трюк вируса (TBSV) 1:1, 2:1, 3:1 и 4:01 отношения. Проникнуть N. benthamiana растения, как описано выше.
  2. Проникнуть N. benthamiana растения смесью двух Milli-Q водой разбавляют Agrobacterium GV3101 культур: первый несущий плазмиду pBID4-HAC1 и второй несущий один из глушителей супрессоров - р19 из TBSV или p23 вируса Citrus Tristeza, в плазмиде pCassp ( pCassp19) и в PGR бинарную плазмиду под промотора 35S (PGR-P23), соответственно, в соотношении 4:1.

5. Вестерн-блоттинга

  1. Соберите образцы случайных листьев от N. benthamiana, Н. Excelsior или N. excelsiana растения на 4-7 руб и распылить в жидком азоте в мелкий порошок.
  2. Добавить три тома 1x буфера PBS, содержащем 0,5% ТритонX-100 для каждого образца.
  3. Аккуратно встряхните извлеченные образцы в течение 15 мин при 4 ° С.
  4. Спин экстракта в течение 5 мин и собирают общего растворимого протеина в чистую пробирку Эппендорфа.
  5. Развести экстракты к соответствующему разведения (1:50 1:100) в 1x PBS буфере для экстракции, и добавить 5 × буфера для образца (250 мМ Трис-HCl [рН 6,8], 10% SDS, 0,5% бромфенолового синий, 50% глицерина об / об, и 500 мМ DTT) до конечной концентрации 1 ×.
  6. Образцы кипятят в течение 5 мин.
  7. Отдельные белки на 10% SDS-PAGE, передавать на Immobilon-P передачи мембраны, и блок с 0,5% I-блока.
  8. Обнаружение GFP с помощью кроличьей поликлональной анти-GFP антисыворотки на 1:5000 и HAC1 использованием мышиного анти-поли-гистидина моноклональное антитело по 1:1000 в блокирующем растворе в течение 1 часа.
  9. После маркировки первичного антитела, промывка мембран три раза в течение 10 мин каждый с 1 × PBST-20 и инкубировать с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированной анти-кролик антител на 1:5000 или HRP-конъюгатаD анти-мышиного антитела в 1:10000 в течение 1 ч, за GFP и обнаружения HAC1, соответственно.
  10. Процесс западных помарки помощью SuperSignal Запад Пико хемилюминесцентные подложку.
  11. С помощью программного обеспечения для анализа GeneTools интенсивность полосы белка и получить полосу калиброванный количество.

Производство белка: (калиброванная величина х разбавление образца) / количество образца загруженной) х 4 = мг / кг.
Уравнение: Продуцирование белка (Р), калиброванный количество (С), разбавление образца (D) и количество образца загружалась (S).

6. Zymogram Анализ

  1. Сбор pBID4-LicKM-проникли Н. benthamiana образцы случайным тканей.
  2. Извлечение белков с использованием тех же методов, описанных выше для Вестерн-блоттинга, а затем анализировать на 10% ДСН-ПААГ с 0,1% лихенан включены в гелях.
  3. После электрофореза гели мыть два раза в течение 10 минут в каждом из промывочного буфера (100 мМ Трис-HCl [рН 8,0] и 0,1% Тритон Х-100), А затем инкубируют в промывочном буфере при 65 ° С в течение 1 часа.
  4. После инкубации отбросить промывочный буфер и окрашивают гели с 0,5% конго красного в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Промыть гелей в Milli-Q воды три раза в течение 10 мин каждый, и добавить 1 М NaCl визуализировать лихеназы деятельность. Очищенный бактериальный белок лихеназы был использован в качестве положительного контроля для активности фермента.

7. GFP изображений

  1. Выполнение визуальное обнаружение флуоресценции GFP в целых временно трансформированных растений с помощью ручного длинноволновой УФ-лампы.
  2. Фотография временно трансформированные растения с цифровой камеры через желтый 8, ES 52 фильтр (время экспозиции, 15 сек).
  3. Получение изображений с Вестерн-блот анализ с помощью программного обеспечения GeneSnap на GeneGnome и количественного определения результатов с помощью программного обеспечения GeneTools, с калибровочной кривой, основанной на очищенной стандарта GFP.
  4. Количественно HAC1 белка с использованием калибровочной кривой на основе purifiред HAC стандарт белка из штамма A/Indonesia/05/05 вируса гриппа.
  5. Рассчитать средние значения от 3-4 повторяет во всех экспериментах.

Representative Results

Потребность в питательных веществах для роста растений. Использование гидропоники среде роста растений (Rockwool) и питательного раствора гарантирует равномерность N. рост benthamiana и устраняет сложности (механическая, нормативные и эффективность), связанные с использованием почвы для выращивания растений. Мы выросли N. benthamiana на минеральной ваты плит, пропитанных коммерчески доступных удобрений для определения оптимальных условий для роста растений и накопления биомассы. Мы наблюдали 95-100% прорастание семян. Следует отметить, что в том числе фосфора имеет решающее значение для достижения прорастание, потому что мы обнаружили, что питательный раствор не хватает фосфора не в состоянии поддержать прорастание и рост N. Семена benthamiana (рис. 1а).

Последствия роста Agrobacterium и инфильтрации СМИ на фитосанитарной и белка производства. Мы протестировали несколько медиа условия для оптимизации эффективности тон методика агроинфильтрации для крупномасштабного производства. Бактерии (A. tumefaciens штамма GV3101), несущие pBID4-GFP конструкцию культивировали O / N в различных средах условиях (YEB, LB или AB), и либо центрифугировали и ресуспендировали в индукционной среде (ММА) (содержащего 1 × Murashige & Skoog [MS] базальной смесь солей, 10 мМ MES рН 5,6, 20 г / л сахарозы и 200 мкМ ацетосирингона) или разбавленными в Milli-Q воды до 600 0,5 до использования для растений инфильтрации. Мы заметили, что вакуум инфильтрация растений с бактериями разбавленных в воде привело к продукции белка, сравнимого с тем, которые достигаются с любым инфильтрации СМИ в предыдущих докладах 42,48. В противоположность этому, инфильтрация неразбавленным Agrobacteria выращенного в Yeb или LB СМИ привело к полному увяданию N. benthamiana оставляет менее чем 24 часа после инфильтрации, в то время как неразбавленный Agrobacteria выращенные в АБ среды не оказывает влияния на здоровье проникли растений (DATне показано). Как показано на фиг.1В, растения проникли с Agrobacterium культур, выращенных в Yeb, LB или AB медиа и разбавляли Milli-Q воды (1:5, 600 0.6-0.8 или 1:10, 600 0.3-0.4) показали никаких симптомов и не имел среднюю производство GFP из 1645, 1520 и 1839, соответственно. Agrobacteria центрифугировали и ресуспендировали в индукционной среде (ММА) не показали симптомов и никакого существенного различия в продукции белка по сравнению с Agrobacteria непосредственно разведенного в Milli-Q воды ( 1671 ± 102 и 1667 ± 131 мг / кг, соответственно). Таким образом, Milli-Q воды рекомендуется для разбавления Agrobacterium культур для растений инфильтрации и был обычно используются в наших последующих экспериментах для достижения 600 0.5.

Влияние плотности Agrobacterium подвеска клеток и времени курса по целевой выражения. Затем мы рассмотрели, если плотность бактериальных клетоквлияет на эффективность инфильтрации и уровней целевой выражения. Для этой цели, мы оценивали четыре различные плотности суспензии клеток Agrobacterium, несущие pBID4-GFP, A 600 1,0, 0,5, 0,1 и 0,05. После инфильтрации, Н. benthamiana растения были проверены для развития видно симптомов и времени ходе целевой выражения, собирая образцы в 4, 7 и 10 руб. В 4 точек на дюйм, мы наблюдали заметные различия в флуоресценции GFP среди растений проникли с различной плотностью суспензии клеток Agrobacterium (никакого выражения GFP не наблюдался при 600 0,05). В 7 руб, флуоресценция GFP был похож на заводах проникли в клеточной суспензии плотностей A 600 1.0, 0.5 и 0.1, но была ниже в растениях проникли на 600 0.05. Как показано на фиг 1С, эти данные были подтверждены с помощью Вестерн-блоттинга анализы образцов, собранных на 4 точек на дюйм, показывающие очень низкое производство белка в 600 600 1,0 (1739 мг / кг). В 7 точек на дюйм, растения не показали существенных различий в расчетной производства GFP в 600 1,0, 0,5 и 0,1 (1662, 1870 и 1890, соответственно), в то время как 600 0,05 показал снижение производства GFP (1199 мг / кг). В отличие от этого, в 10 руб не наблюдалось никаких различий в производстве GFP среди растений проникли с любой из четырех плотностей суспензии клеток (1218, 1181, 1197 и 1304).

Проникновение с альтернативными штаммов Agrobacterium. Чтобы увеличить разнообразие штаммов Agrobacterium, доступной для переходного продукции белка, мы протестировали дикого типа изолятов. Эти штаммы, выделенные из коронной желчи природных хозяев, были любезно предоставлены доктором Gelvin (Университет Пердью, Уэст-Лафайетт, штат Индиана). Чтобы изучить их полезность в переходных продукции белка, мы проникли N. benthamiana со следующими штаммами Карринь pBID4-LicKM 18: А. rhizogenes (А4) и А. tumefaciens дикого типа Нестер напрягает A348, A208 и A281 (названный AT6, AT10, и At77, соответственно), а также инженерные лабораторные штаммы А. tumefaciens GV3101, C58C1 и LBA4404. Инфильтрованного листья были собраны на 7 точек на дюйм и уровень экспрессии LicKM была оценена с помощью Вестерн-блот-анализа. Как показано на рисунке 2А, самом высоком уровне LicKM производства может быть достигнуто с штаммов GV3101, A4 и LBA4404 (~ 1750 ± 163, 1650 ± 26 и 1450 ± 117 мг / кг, соответственно), с небольшими различиями; самый низкий уровень экспрессии (~ 900 ± 102 мг / кг) с C58C1; и промежуточная продукция с AT6, AT10 и At77 (~ 1250 ± 19, 1100 ± 42 и 1200 ± 111 мг / кг, соответственно). Лихеназы ферментативная активность была продемонстрирована с помощью Zymogram анализа. Рисунок 2B показывает, что лихеназы производится в проникли тканях растений, используя любой изШтаммы Agrobacterium был ферментативно активный. Следует также отметить, что Н. benthamiana растения проникли с A4 и At77 штаммов показали патологические симптомы (задержка роста, черешок удлинения и щипцы, и листьев керлинг), в то время как с AT10 напрягать симптомы были легкими. Отсутствие симптомов не наблюдалось Н. benthamiana растений проникли с лабораторного штамма GV3101 (рис. 2С).

Проникновение альтернативных видов Nicotiana. Мы сравнили тарифы поколения биомассы и производства белка у двух видов дикого типа рода Nicotiana (Н. benthamiana и Н. мягкой древесной стружки) и в гибридных видов, N. excelsiana (Н. benthamiana × N. стружку). Из тестируемых видов, N. benthamiana, широко используемый хост для переходного производства белка с использованием Agrobacterium на основе или на основе вирусов систем экспрессии 2,34,49, достигает инфильтрации готовность в течение 4-5 недель прорастания. Необходимый период роста для генерации оптимального уровня биомассы также 4-5 недель для N. excelsiana но больше (6-7 недели) для N. Excelsior. Кроме того, междоузлий растений являются относительно короткими для N. Excelsior сравнению с другими видами Nicotiana.

Кроме того, мы наблюдали, что вакуумный инфильтрацию N. benthamiana и Н. excelsiana на 50-250 мбар в течение 60 секунд высокоэффективен для агроинфильтрации целых листьев, в то время Н. эксцельсиор трудно проникнуть из-за их более низкой сени и кожистыми листьями, даже когда был создан вакуум три раза в течение 1 мин каждый в присутствии неионных поверхностно-активных веществ, таких как Sillwet-77 или S240. Кроме того, всхожесть N. excelsiana и Н. Семена Excelsior был ~ 40-50%; в целях повышения всхожесть 90-100%, семена должны быть обрабатывали 10% BleaCH в течение 1 ч перед посевом. При тех же условиях роста, самого высокого листьев биомассы, которая может образоваться от N. excelsiana примерно в два раза выше по сравнению с N. benthamiana (табл. 1).

Производство белка был рассмотрен в N. benthamiana, Н. Excelsior и Н. excelsiana проникли с штамма GV3101 Agrobacterium, несущего pBID4-GFP. Накопление GFP был оценен в 7 руб в целых листьев проникли с помощью УФ-света с последующим вестерн-блоттинга. Фиг.3А показывает равномерное распределение GFP в N. benthamiana и Н. excelsiana и неравномерное распределение в N. Excelsior (из-за трудности проникновения всю область лист Н. стружку). показывает уровень производства GFP оценкам УФ-освещением в проникших листьев, собранных из трех видов Nicotiana на 7 руб. GFP накопилсяУровень ционных была выше в N. benthamiana (~ 2,23 г / кг), чем в N. excelsiana и Н. эксцельсиор (~ 1,89 и 1,54 г / кг, соответственно). Низкий уровень продукции белка в N. Excelsior является из-за неравномерного проникновения и распространения накопленного GFP в собранной листа.

Мы заметили, что верхние листья непосредственно под воздействием света часто демонстрируют самые ранние и самые высокие уровни переходных накопления GFP (на 2-4 руб), чем листьев под навесом. Тем не менее, в наших исследованиях, накопление GFP был самым высоким в 7 точек на дюйм и был распространен равномерно по большинству листьев, за исключением uninfiltrated вновь растущих листьев, которые не проявляют накопление GFP.

Эффекты вакуумного давления и продолжительности на переходный производства белка. Вакуумной пропитки значительно увеличивает переходные уровни экспрессии по сравнению с применяемой инъекции стороне с безыгольного шприца 42 давления. Применениевакуум вызывает газы эвакуироваться из затопленного завода оставляет через устьица. Когда вакуум нарушается, и давление резко возрастает, приостановка Agrobacterium приводится в листья, чтобы заменить эвакуированных газов 50.

Для оценки влияния вакуумного давления на листьях N. benthamiana, мы проникли растения с штамма GV3101 Agrobacterium, несущего pBID4-GFP в различных вакуумных давлениях (50-400 мбар) в течение 30 или 60 секунд. Было показано, что чем сильнее вакуум (ниже 50 мбар) применяется в течение 30 или 60 сек результатов в механических повреждений проникли листьев, что приводит к ткани увядание и отмирание растений вскоре после инфильтрации (24-48 ч). С другой стороны, применение более мягкой вакууме (400 мбар) результатов в инфильтрации только 50% площади листа и снижением уровня производства GFP (303 ± 90 мг / кг) (рис. 4А). Важно отметить, что мы не наблюдали различия в производстве GFP под 50, 100 и 200 мбар (1651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 мг / кг, соответственно) (рис. 4А) и легкой до нет, вредные последствия для здоровья растений, когда вакуумные давление со 50-200 мбар были применены на 30 или 60 сек. Таким образом, 50-100 мбар вакуумного давления рекомендуется для проникновения экспериментов.

Влияние продолжительности вакуума на целевой выражения оценивали путем пропитки один плашмя N. benthamiana растения каждый час с 600 0,5 от GV3101, несущего pBID4 -. GFP в течение 8 часов в той же культуры Agrobacterium Фиг.4В показывает, что уровень производства GFP был похож на все время указывает до 8 часов, предполагая, что над этим Период времени Agrobacterium сохраняет свою способность начать одноцепочечной ДНК.

Влияние химической индукцией по производству белка. Некоторые растения фенольные метаболиты и сахара могут индUCE гены вирулентности А. tumefaciens 1,52. Как следствие, многие химические вещества и monosaccharaides были зарегистрированы для повышения переходных производства белка в различных видов растений. Ацетосирингона чаще всего добавляют к культурам А. tumefaciens, чтобы побудить вир оперона до агроинфильтрации 40,53-57.

Мы оценили эффект различных концентраций ацетосирингона (0, 100, 200 и 400 мкм) и глюкозы (0-4%) на временную производства GFP белка в N. benthamiana проникли с штамма GV3101 Agrobacterium, несущего pBID4 - GFP. С этой целью мы ресуспендировали Agrobacterium клеток в ММА индукционной средой, содержащей различные концентрации ацетосирингона и глюкозы в течение 1-3 часов, после чего инфильтрации. По результатам обоих визуального наблюдения (данные не показаны) и Вестерн-блот-анализа (рис. 4С), ни один из испытанной концентрациииз этих соединений вызывали значительное увеличение флуоресценции GFP или продукции белка по сравнению с контролем, где индукционные средства массовой информации не содержал ацетосирингона или глюкозы.

Влияние совместного инфильтрации глушителей подавитель на переходном производства GFP и HAC1 генов в N. benthamiana уходит. Ранее было показано, что сотрудничество экспрессию глушителей подавитель (р19 из помидоров густой вируса трюк [TBSV]) мешает посттранскрипционной молчания генов (PTGS), что приводит к усилению производства репортер белков 34.

Мы оценили эффект совместного инфильтрации N. benthamiana с ракетой-вектора, несущего ген GFP репортер (pBID4-GFP) и p19. До инфильтрации, А.Н. 600 из 0,5 разведения А. tumefaciens GV3101 культуры, несущие pBID4-GFP и p19 были соответственно смешаны в соотношении 1:1, 2:1, 3:01 и 4:01. Экспрессион глушителей подавитель контролировалась промоутера Цветная капуста мозаичного вируса 35S. Как показывают результаты Вестерн-блот-анализа на 7 точек на дюйм (фиг.5А), присутствие p19 не увеличивать или уменьшать выработку GFP в N. benthamiana, в любом соотношении этих двух Agrobacterium суспензий.

Мы также сравнили эффекты двух вирусных генов глушителей супрессоров - p23and р19 - по предупреждению PTGS для HAC1. Культуры Agrobacterium, несущие вектор запуска pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) и один из двух вирусных глушителей супрессоров плазмид были разбавлены до 600 0.5, смешивали в соотношении 4:1, соответственно, и совместно проникли в 4-5-недельных N. benthamiana. Суспензию А. tumefaciens, несущие pBID4 - HAC1 одна была проникли в качестве контроля. Инфильтрованного пробы листьев были собраны от 3 до 8 точек на дюйм. Эксперимент был REPEускоренные три раза и средние уровни экспрессии HAC1 определено Вестерн-блот-анализа.

Как показано на рисунке 5В, со-инфильтрации N. benthamiana с p23 или p19 привело (642 ± 157 и 764 ± 108 мг / кг, соответственно) увеличение HAC1 производства по сравнению с без использования глушителей подавитель (примерно 15-25%, соответственно) в 6 руб. Это говорит о том, что p23 и p19 являются эффективными в нашей системе. Тем не менее, следует отметить, что накопление HAC1 произошло на день раньше, когда pBID4-HAC1 был одним из проникли с p19. Таким образом, наши результаты показывают, что эффекты глушителей супрессора p19 на HAC1 и накопления GFP различны, предполагая, избирательное усиление кратковременной экспрессии и / или устойчивости некоторых белков в N. benthamiana.

Мы также отметили, что как в присутствии, так и в отсутствии глушителей подавитель уровень белка Prod HAC1ед ен ие начал сокращаться на 7 руб. Это указывает на то, что сроки снижения переходного производства белка в Н. benthamiana проникли с вектором запуска является мишенью конкретной.

Ячейка банк Agrobacterium, несущие вектор запуска оценивали каждый год в течение стабильности гена-мишени, Agrobacterium жизнеспособности и уровня накопления белка. Исходный раствор в глицерине клеточной берегу GV3101 деформации, трансформированной pBID4-HAC1, которое было сохранено при -80 ° С, как было показано, чтобы быть очень стабильным в течение более трех лет без изменений в уровне переходного производства белка в проникли N. benthamiana растения. Рисунок 5C показывает, что производство белка HAC1 оценивается вестерн-блоттинга в годы 2010, 2011, 2012 и 2013 было 670, 685, 566 и 683 мг / кг, соответственно. Средняя производство HAC1 в N. benthamiana растения было 651 ± 49,4 мг / кг.


Таблица 1. Сравнение N. benthamiana и Н. excelsiana завод по производству биомассы.

Рисунок 1
Рисунок 1. Вестерн-блот-анализ временной экспрессии генов в N. benthamiana. (А) Шесть-недельных Н. benthamiana 1) растения, растущие в удобрений раствора, содержащего 4,8% фосфора и 2) растения, произрастающие в удобрений раствора, содержащего 0% фосфора. Двадцать пять мкг свежего веса листьев эквиваленте был загружен на полосу. (В) Сравнение производства GFP в растениях вакууме пропитывают pBID4-GFP-укрывательство Agrobacterium GV3101 Культуры, выращенные в трех различных средах: YEB, АВ и LB. GV3101 культуры выращивают O / N в Yeb или LB медиа центрифугировали при низкой скорости и ресуспендировали в индукционной среде (ММА) (ММА полосы:-1 и ММА-2 соответственно), или выращенных O / N в Yeb, LB или AB СМИ и непосредственно разбавляют до 1:05 или 1:10 с Milli-Q воды (полосы: YEB / 5 и YEB/10; AB / 5 и AB/10; LB / 5 и LB/10) (С) Сравнение. из GFP экспрессии в 4, 7 и 10 руб следующих вакуумной инфильтрации с различных концентрациях (600 из 1,0, 0,5, 0,1 и 0,05) А. tumefaciens GV3101 штамм, несущий pBID4-GFP.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сравнение переходных производства лихеназы и активности после вакуумной инфильтрации N. benthamiana растения с Diffeарендовать штаммы Agrobacteria. Культуры штаммов Agrobacteria (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, AT10 и LBA4404), несущие вектор запуска pBID4-LicKM были проникли индивидуально в листьях N. benthamiana. Проникли листья были собраны на 7 точек на дюйм. (A) лихеназы производство количественно с помощью Вестерн-блоттинга. (B) Zymogram анализ демонстрирует лихеназы производства за счет ферментативной активности. (C) Эффект Agrobacterium (дикого типа A4, AT10, At77 и лабораторный штамм GV3101) инфильтрация на N. benthamiana здоровье растений в 7 руб. Двадцать пять мкг свежего веса листьев эквиваленте был загружен на полосу.

Рисунок 3
Рисунок 3. Переходные GFP выражение в листьях N. benthamiaпа, Н. excelsiana и Н. Excelsior в 7 руб после вакуумной пропитки с А. tumefaciens, несущие ракеты вектор pBID4 - GFP. (A) Визуальный осмотр экспрессии GFP под УФ-светом. (B) Вестерн-блот анализ накопления GFP.

Рисунок 4
Рисунок 4. (A) Эффекты вакуумного давления на временной экспрессии GFP и растений. Н. benthamiana растения проникли с pBID4 -. GFP под вакуумом давлениях 400, 200, 100 или 50 мбар, в вакуумной проведения времени 30 или 60 сек (В) Стабильность и инфекционность А. tumefaciens в N. benthamiana проникли с Agrobacterium GV3101 укрывательство pBID4-GFP выросли в АБ среды и разбавляют до 600 0.5. Agroinfiltration проводили путем пропитки один плашмя N. benthamiana растения каждый час в той же разбавленной культуры Agrobacterium (дорожки 0-8). (C) Влияние различных концентраций глюкозы и ацетосирингона по временной экспрессии GFP. Штамм GV3101 Agrobacterium, несущие pBID4 - GFP был выращен O / N в YEB информации, центрифугируют и повторно суспендируют с 600 A 0,5 либо в ММА, содержащей 2% глюкозу с ацетосирингона при 0, 100, 200 или 400 мкМ, или в ММА, содержащий 200 мкМ ацетосирингона с глюкозой в 0, 1, 2 или 4%. В Agrobacterium суспензии выдерживали в течение 3 ч при комнатной температуре до инфильтрации.

Рисунок 5
Рисунок 5. Влияние глушителей супрессоров на переходном производства белка в N. benthamiana уходит. () Вестерн-блот анализ из GFP белка следующее совместное проникновение pBID4-GFP и p19 в различных соотношениях. Пробы, собранные на 7 руб (25 мкг свежего веса листьев эквивалента был загружен на полосу). (Б) культура Agrobacterium проведение pBID4-HAC1 индивидуально смешивали в соотношении 4:1 с культуры, несущей р19 или р23 глушителей подавитель плазмид. Полученные в результате комбинации культур Agrobacterium пропитывают под вакуумом растений. Проникли ткани HAC1 ежедневно собирали до 8 точек на дюйм для рекомбинантного количественного белка. (С) Устойчивость банка клеток Agrobacterium. Растения проникли с той же самой партии банка клеток Agrobacterium каждый год, чтобы оценить накопление белка. Пятьдесят мкг свежего веса листьев эквиваленте был загружен на полосу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию гоявляется фигурой.

Discussion

В этом исследовании, мы разработали простой протокол агроинфильтрации для рутинной переходного производства белка в отдельных видов Nicotiana использованием штаммов Agrobacterium, несущие вектор запуска. Кроме того, мы определили оптимальные условия для достижения наивысшего рекомбинантный уровень производства белка в нашем переходном системы экспрессии растений.

Вакуумная инфильтрация разбавленного А. tumefaciens штамм GV3101, несущие вектор pBID4 запуска в N. benthamiana, Н. excelsiana и Н. эксцельсиор привело к более высоким уровням производства белка-мишени в течение 7 руб по сравнению с другими видами растений, таких как Pisum посевного пропитывают GV3101, несущего вирус мозаики люцерны - или вируса огуречной мозаики на основе векторов, экспрессирующих ген GFP-репортер под промотора 35S 41, или Lactuca сатива, Solanum LycoPersicum и арабидопсис проникли со штаммом C58C1 А. tumefaciens, несущие репортер ген бета-глюкуронидазы 57. Н. benthamiana и Н. excelsiana было легко пропылесосить проникнуть в 50 мбар в течение 30-60 сек, с 90-95%-ной эффективности инфильтрации. Остальные 5-10% площади листа не проникли из-за некоторого плавающего листьев на поверхности суспензии Agrobacterium в течение применением вакуума. Так как вектор запуск имеет способность для движения 18 от клетки к клетке, накопление переходный белка происходит в целых листьев, а также черешках на 7 руб. В 10 точек на дюйм, по оценкам производство GFP был несколько ниже, потому что вектор экспрессии pBID4 способен двигаться от клетки к клетке, но не двигаться системно 18 лет; Поэтому, вновь выращенные листья не содержат вектор и не способствуют производству цели. Кроме того, ухудшение рекомбинантного белка с течением времени май способствовать снижению уровня белка в 10 руб. Наши результаты показали, что проникновение в А. tumefaciens штамм GV3101 опосредованные высокие уровни переходных производства белка в N. benthamiana. Кроме того, целевой белок может быть спроектирован как N-концевые, С-концевые или внутренние слитых в лихеназы (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-глюканазы, который является термостабильный фермент из Clostridium thermocellum и дает термостабильность во многие цели слитый белок 18. Проникновение N. benthamiana с А. tumefaciens штаммов дикого типа (AT6, AT10 и at77) укрывательство интересующий ген вызвал умеренные или тяжелые симптомы: лист керлинг, черешок удлинения, и щипцы. Никаких патологических симптомов не наблюдалось в N. benthamiana проникли с лабораторным штаммом GV3101 укрывательство пустой pBID4 вектор, в то время как некоторые гены вставлены в pBID4 и превращается в лаборатории штаммов GV3101, C58C1 или LBA4404 вызвал умеренные некротические ответы и листхлороз / пожелтение симптомы в проникших регионов листьев. Некротические симптомы, вызванные дикого типа Agrobacterium или разоружены штаммов в пасленовых растений были сообщалось ранее 56,57. Некротический ответ может быть результатом факторов вирулентности секреции системы типа III, бактериальных белков, переданных в растительной клетке системой секреции типа IV, и / или чувствительности к флагеллином 58-60. Мы обнаружили, что переходный процесс производства гетерологичных белков также может вызывать патогенность и реакции гиперчувствительности в проникла листьев растений. Многие исследователи сообщили, что агроинфильтрации различных видов растений с растений двоичных векторов, произведенных до 5-20 раз более высокие уровни переходных продукции белка по сравнению с стабильно трансформированных растений 28,57. Наши данные показывают, что Н. benthamiana проникли с GV3101, несущие pBID4-GFP временно экспрессированного высокие уровни GFP, который похож на выход GFP, описанной дляН. benthamiana проникли с Agrobacteria неся вирусного вектора Pich-GFPSYS (до 80% от общего растворимого белка) 44. Агроинфильтрации с помощью нашего запуска вектор привело к высокой продукции термостабильной LicKM белка, в 50 раз выше, чем наблюдаемое с помощью стандартного бинарного плазмидного 18.

Чтобы проверить инфекционность А. tumefaciens и стабильность вектора ракеты, мы проникли один плашмя N. benthamiana каждый час в течение до 8 ч, используя тот же Milli-Q водном растворе культуры GV3101, несущие плазмиду pBID4-GFP. Наши данные показали, что штамм GV3101 эффективно инфекционный, по крайней мере 8 часов и pBID4 (вектор запуск) является очень стабильным в течение 8 ч на протяжении инфильтрации.

Глицерин запас GV3101 штамма, ракеты вектор pBID4-HAC1 (банк клеток), который хранится при -80 ° С, как было показано, чтобы быть очень стабильным в течение трех лет без изменений в переходных защпроизводства в проникших растений.

Н. benthamiana растения, выращенные в оптимальных условиях и между 35 и 42 дней после посева были оптимальными для вакуумной инфильтрации опосредованного временной экспрессии гена 40. Младшие растения (3-4 недель) не может быть полностью проник из-за листьев, плавающих на поверхности клеточной суспензии и повреждению тканей от механического воздействия применения вакуума. В растениях старше 45 дней, N. benthamiana болтов этап, при оптимальных условиях освещения, используемых, уровень кратковременной экспрессии является низким.

Низкомолекулярные соединения вес фенольные (ацетосирингона) и monosaccharaides (глюкозы), как известно, вызывают гены Вир в А. tumefaciens 55,61. Более того, проникновение N. benthamiana с бинарный вектор pCAMBIA (GFP) в присутствии ацетосирингона в концентрации 50-600 мкМ были показаны несколько увеличить переходныйэкспрессии генов 40. Мы изучали влияние различных концентраций ацетосирингона и глюкозы в нашей системе, добавив эти соединения в GV3101 культур, несущих pBID4-GFP в ММА в течение 3 часов, и не обнаружили различий в выражении GFP. Интересно, GV3101 культуры, несущие pBID4-GFP и разбавленные в Milli-Q воды до 600 и от 0,5 проникли без индукции гена Vir выражали то же самое количество GFP, как те проникли с индуцированных культур. А. Ген вир tumefaciens (ы) потенциально может быть вызвано фенольных соединений растений (ацетосирингона и sinapinic кислоты) и растений monosaccharaides (глюкоза и фруктоза), присутствующих в ткани листа. Таким образом, мы предполагаем, что подобные уровни GFP экспрессии в присутствии или в отсутствие экзогенного гена Vir индукторов может быть результатом эффекта цитоплазматических генов вир индукторов, присутствующих во время репликации GFP-экспрессирующих запуска вектора в клетках растений.

Н. benthamiana был использован в качестве типового хозяина для переходного продукции белка 49. Тем не менее, относительно низкий выход биомассы Н. benthamiana 'ы сдерживает его применение для крупномасштабного производства рекомбинантных белков. Оптимальное хост должен объединить высокий уровень кратковременной экспрессии, легкий роста в теплице, и быть восприимчивыми к Agrobacterium инфильтрации 2. Чтобы выбрать альтернативный хост, мы проникли два разных вида дикого типа Nicotiana (Н. benthamiana и Н. стружку) и гибридный N. excelsiana (Н. benthamiana × N. Excelsior) с А. tumefaciens штамм GV3101, несущих плазмиды pBID4-GFP. Среди этих трех видов, уровень экспрессии GFP был несколько выше, в N. benthamiana. Н. Excelsior растения показал трудности в вакуумной агроинфильтрации из-за их кожистыми листьями, и Н. excelsianaпроизводится примерно в два раза больше биомассы при тех же условиях роста. Переходный производство GFP в 7 руб относительно похожи в N. benthamiana и Н. excelsiana. Таким образом, N. excelsiana может быть более подходящим хозяином для рекомбинантного белка.

Переходные производство белка Агробактериальная ограничивается PTGS 26, который может быть преодолена путем совместной экспрессии гена глушителей супрессоры растительного вируса происхождения 62. Переходный производство белка Ранее было показано, чтобы быть повышена в 50 раз в присутствии белка р19 TBSV, который ингибирует PTGS в тканях проникли 34. В нашем исследовании мы оценивали влияние двух вирусных глушителей супрессоров (р19 и р23) отдельно совместно проникли с ракетой-вектора pBID4-HAC1. Совместное инфильтрация этих глушителей супрессоров, казалось, мало влияют на временной экспрессии HAC1, только с небольшим увеличением HAC1Накопление белка (15-25%) в присутствии со-проникли p23 или p19. Чтобы положительно повлиять на производство белка, глушителей супрессоров возможно, должны быть специально отобраны, чтобы быть эффективным для целевых видов растений и вирусного вектора 63. ВТМ геликаза имеет подавитель из РНК глушителей деятельности 64,65. Наши данные подтверждают это наблюдение как со-инфильтрация p23 или p19 с pBID4-HAC1 не привело к увеличению GFP или незначительного увеличения переходного производства HAC1 белка.

В заключение, мы изменили и оптимизированы завод и условия роста Agrobacterium и повысила эффективность вакуумной пропитки. Эта технология позволила нам расти и проникнуть сотни килограммов растительного материала в течение нескольких часов. Мы успешно автоматизировала переходный технику выражение завода по производству высокой пропускной вакцины в промышленных масштабах в нынешних надлежащей производственной практики (цГМФ) условия. Для получения дополнительной информации абоавтоматизация и использование растительного переходного белка производственной системы для производства рекомбинантных белков, в том числе кандидатов субъединицы вакцины, в условиях цГМФ ут, читатели могут обратиться к веб-сайта www.fhcmb.org/ .

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Fraunhofer США Центра молекулярной биотехнологии, Ibio, Inc и обороны Агентства перспективных исследовательских проектов (грант # HDTRA1-07-C-0054). Авторы признают, щедрые подарки от доктора. Стэнтон Gelvin биологических наук кафедра, Университет Пердью (Agrobacterium tumefaciens штаммы) и Уэйн Фитцморисом крупномасштабных биологии корпорации (Н. семян excelsiana), а также Дженнифер Николсон из США Nicotiana Collection, Государственного университета Северной Каролины (N. Excelsior семян ). Авторы выражают благодарность Маргарет Shillingford и Кристофер Халл для обеспечения растений и отличную техническую помощь. Авторы также благодарят доктора. Стивен Стритфилд и Наташа Кушнир за помощь в редактировании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics