Optimering och Utnyttjande av

Biology
 

Summary

Transient proteinproduktion i Nicotiana anläggningar baserade på vakuum infiltration med Agrobacteria bär lanserings vektorer (tobak viruset baserat) är en snabb och ekonomisk metod för att framställa vaccinantigener och terapeutiska proteiner. Vi förenklat förfarandet och förbättrat mål anhopning genom att optimera betingelser bakterieodling, välja värdart, och co-införa RNA tysta suppressorer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., Yusibov, V. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. J. Vis. Exp. (86), e51204, doi:10.3791/51204 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Agrobacterium-medierad transient proteinproduktion i växter är en lovande metod för att framställa vaccin-antigener och terapeutiska proteiner inom en kort tidsperiod. Dock är denna teknik bara börjat tillämpas på storskalig produktion så många tekniska hinder för att skala upp är nu övervinnas. Här visar vi en enkel och reproducerbar metod för industriell skala transient proteinproduktion baserad på vakuum infiltration av Nicotiana växter med Agrobacteria bär lanserings vektorer. Optimering av Agrobacterium-odlingen i AB-medium möjliggör direkt utspädning av bakteriekulturen i Milli-Q-vatten, vilket förenklar infiltrationsprocessen. Bland tre testade arter av Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) valdes som den mest lovande värd på grund av den lätthet med infiltration, hög reporter proteinproduktion, och cirka två-fgamla högre biomassaproduktion under kontrollerade miljöförhållanden. Induktion av Agrobacterium hysande pBID4-GFP (tobaksmosaikvirus-baserade) med användning av kemikalier såsom acetosyringon och monosackarid hade ingen effekt på proteinets produktionsnivå. Infiltrera växt i 50 till 100 mbar till 30 eller 60 sekunder resulterade i cirka 95% infiltration av växtbladvävnad. Infiltration med Agrobacterium laboratoriestammen GV3101 visade den högsta proteinproduktionen jämfört med Agrobacteria laboratoriestammar LBA4404 och C58C1 och vildtyp Agrobacteria stammar AT6, AT10, at77 och A4. Co-uttryck av en virus-RNA som tystar suppressor, p23 eller p19, i N. benthamiana ledde tidigare ackumulation och ökad produktion (15-25%) av målprotein (influensavirushemagglutinin).

Introduction

Växter är nu erkänd som en säker, pålitlig, skalbar och billig plattform för att producera heterologa rekombinanta proteinläkemedel och industri proteiner 1-3 och har viktiga fördelar jämfört med mikrobiella och animaliska cellexpressionssystem 4. Växter kan uttrycka korrekt veckade proteiner med post-translationella modifieringar, inklusive sammansatta multimera antikroppar 5-7. Flera vegetabiliska rekombinanta farmaceutiska proteiner genomgår klinisk utvärdering 8. Dessa inkluderar patientspecifika rekombinanta idiotypa vacciner (scFv) för behandling av non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin baserad pandemi och vaccin mot säsongsinfluensa kandidater 10,11 (Cummings et al., In till vaccin), anti-Streptococcus ytantigen I / II-antikropp för behandling av tandkaries 12 och humant insulin för behandling av diabetes 13. Vidare humant recombinant glukocerebrosidas för enzymersättningsterapi hos patienter med Gauchers sjukdom har godkänts i Israel och USA och finns under Expanded Access Program utanför USA 14,15.

Heterologa proteiner kan produceras i stabilt transformerade (transgen eller transplastomic) eller transient transformerade växter. Transient proteinproduktion erbjuder flera fördelar jämfört med produktion i transgena växter, inklusive kort tidsram för att uppnå uttryck och ackumulering 16, och kan uppnås genom att införa bakteriella binära vektorer eller rekombinanta växt virala vektorer i växtvävnader 4. Den mest avancerade övergående expressionssystem är baserat på användningen av "uppskjutnings vektorer 'som kombinerar komponenterna av växtvirus och binära plasmider, och levereras av agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration av en lanserings vektor baserad på tobaksmosaikvirus (TMV) har med framgång tillämpats på labskala för att framställa vaccinantigener mot patogener som humant papillomvirus 19, Yersinia pestis 20, influensavirus A 21,22, Bacillus anthracis 23, och smittkoppsvirus 24 i N. benthamiana leaves. Agrobacterium-medierad transient expression är också en lovande metod för samtidig produktion av flera proteiner 2,25-27. Till exempel har växt övergående expressionssystem använts för att producera tumörspecifika rekombinanta antikroppar 28,29, ett glykosylerat rekombinant antikropp mot epidermal tillväxtfaktorreceptor 30, och en monoklonal antikropp specifik för mjältbrand skyddande antigen 31,32. Co-infiltration av Nicotiana benthamiana växter med en målgen och en suppressor av genen som tystar ger förbättrad målprotein uttryck 33,34.

Agroinfiltration är en vanlig metod för att likformigt introsiering bakterier som hyser en gen av intresse i växtvävnader 35-37. Vakuum infiltration av Agrobacterium för transient genuttryck i intakta växtblad är en snabb, skalbar och användbar metod för produktion av främmande proteiner utan behov att alstra transgena växter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, är växter vänt upp och ned och antenn delar nedsänkta i Agrobacterium upphängning. Då vakuum appliceras orsakar gaser att evakuera från bladintercellulära utrymmen genom klyvöppningar. Snabb återtrycksättning efter utsläpp av vakuumresulterar i infusion av Agrobacterium-suspension in i bladet. Efter vakuum infiltration av Agrobacteria, är växter ytterligare odlas och mål uttryck övervakas. De högsta nivåerna av mål-uttrycket är vanligtvis observeras 2-3 dagar efter infiltration (dpi) med en binär vektor och 4-7 dpi med en lansering vektor, varefter uttrycket nivån vanligtvis decreaSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens är den mest använda fordon för att leverera en gen av intresse i en växt för proteinproduktion. Agroinfiltration fungerar utomordentligt bra i N. benthamiana men relativt dåligt i de flesta andra växter, inklusive Arabidopsis thaliana 46.

I denna studie har vi utvecklat en enkel, effektiv och ekonomisk metod för transient proteinproduktion i 5-6 veckor gamla N. benthamiana använder A. tumefaciens infiltration. Den största nackdelen med industriell skalning av agroinfiltration tekniken är centrifugering av skördade bakterier och återsuspension av den bakteriella pelleten i medium innehållande 4'-hydroxi-3 ', 5'-dimetoxiacetofenon (acetosyringon), monosackarider, och 2 - (N-morfolino) -etansulfonsyra (MES) buffert för induktion av vir-gener. Vi har kunnat lösa dessa problem genom att optimera Agrobacterium N. benthamiana och N. excelsior, samt i hybrid N. excelsiana.

Protocol

1. Växtodling

För efterföljande agroinfiltration vi utvärderade två vildtyp Nicotiana arter (N. benthamiana och N. excelsior) och en hybrid (N. excelsiana) vuxit hydroponically på stenull i inomhusanläggningar.

  1. Blöt Rockwool plattor i en växtgödningslösning.
  2. Så fröer av vildtyp N. benthamiana, N. excelsior och N. excelsiana (hybrid av N. benthamiana × N. excelsior) på de näringsämnen blöt rockwool yta.
  3. Odla växter från fröna under kontrollerade betingelser (24 ° C och 40-65% relativ fuktighet) och en lång-dagars fotoperiod (14 h ljus och 10 h mörker, med belysning av 130-150 μE m -2 s -1) och 4-5 veckor för N. benthamiana och N. excelsiana, och 5-6 veckor för N. excelsior.

2. Konstruktion av vektorer för Agroinfiltration

  1. Sätt i en syntetisk reporter gen (grönt fluorescerande protein [GFP]), hellång hemagglutinin (HA) från A/California/04/2009 stam av influensavirus (HAC1), och omskapas likenas enzym (LicKM) 18 separat i lanseringen vektorn pBID4 18 (TMV-baserad vektor) för att erhålla pBID4-GFP, pBID4-HAC1 och pBID4-LicKM respektive 18,32,41,47.
  2. Häll 10 till 50 ng av pBID4 bär GFP eller HAC1 in i elektrokompetenta celler av A. tumefaciens stam GV3101 och LicKM in i elektrokompetenta celler av A. tumefaciens stammar GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 och A4 med genen MicroPulser elektroporator.
  3. Använd den transforme Agrobacteria för infiltrationsförsök, om inte annat anges.

3. Dammsug Infiltration av Agrobacterium i Nicotiana Växter

  1. Grow A. tumefaciens-stammar över natten (O / N) i LB-medium, YEB Medium eller AB-medium kompletterat med 50 mg / L av kanamycin vid 28 ° C med skakning vid 200-250 rpm.
  2. Späd Agrobacteria i Milli-Q-vatten till en optisk densitet vid 600 nm (A 600) på 0,5 eller centrifug Agrobacterium-celler odlas i LB eller YEB eller AB på 4000 × g under 10 min vid 4 ° C, re-suspendera i induktionsmedium (1x MS salt, 10 mM MES, 200 pM acetosyringon, 2% sukros [MMA]) till A 600 av 0,5, och rör om vid rumstemperatur under 1-3 hr, om inget annat anges.
  3. Infiltrera växter i en vakuumkammare, genom att sänka ned Nicotiana växt flygbilder vävnader i Agrobacterium-suspension och att applicera en 50 till 400 mbar vakuum under 30 eller 60 sek. Den optimala infiltration rutinmässigt tillämpas vid 50-100 mbar för 60 sek.
  4. När vakuum är bruten, ta bort växter från vakuumkammaren, skölj i vatten, och växa i 5-7 dagar under samma odlingsbetingelser som används för pre-infiltration tillväxt.
  5. För att testa effektivitetenav kemikalier som inducerar Agrobacterium vir-genen, olika koncentrationer av acetosyringon (0, 100, 200 eller 400 | im) sattes till Agrobacteria suspenderades i infiltrering buffert (1x MS, 10 mM MES, 2% glukos). För effekten av monosackarid om induktion av vir-genen, olika procentsatser av glukos (0, 1, 2 eller 4%) tillsattes till Agrobacteria suspenderades i infiltrationen buffert (1x MS, 10 mM MES, 200 pM acetosyringon). N. benthamiana växter infiltrerade som nämnts ovan i steg 3.3 och 3.4).
  6. Agrobacterium laboratoriestammar GV3101, C58C1 och LBA4404 och vildtyp stammarna A4, AT06, AT10, och At77 härbärgerar pBID4-LicKM vektor späddes i Milli-Q-vatten till en 600 av 0,5. N. benthamiana växter infiltrerades med varje särskild stam som nämnts ovan i steg 3.3 och 3.4.

4. Co-agroinfiltration Förfarande för Viral Ljuddämpning Suppressor

  1. Mix de Milli-Q-vatten-utspädda Agrobacterium GV3101 kulturer bär GFP-genen och den virala ljuddämpning suppressor p19 av Tomato buskig stunt virus (TBSV) på 1:01, 2:01, 3:01 och 4:01 nyckeltal. Infiltrera N. benthamiana växter som beskrivits ovan.
  2. Infiltrera N. benthamiana växter med en blandning av två Milli-Q-vatten-utspädda Agrobacterium GV3101 kulturer: den första bär pBID4-HAC1 plasmiden och den andra bär en av de tysta dämpare - P19 av TBSV eller p23 av Citrus tristeza virus, i pCassp plasmiden ( pCassp19) och i PGR binär plasmid under 35S-promotorn (PGR-P23), respektive, i förhållandet 04:01.

5. Western blot-analys

  1. Samla slumpbladprover från N. benthamiana, N. excelsior eller N. excelsiana växter på 4-7 dpi och pulverisera i flytande kväve till ett fint pulver.
  2. Lägg tre volymer 1x PBS-buffert innehållande 0,5% TritonX-100 till varje prov.
  3. Skaka försiktigt de extraherade proverna under 15 minuter vid 4 ° C.
  4. Centrifugera extraktet i 5 min och samla totalt lösligt protein till ett rent Eppendorf-rör.
  5. Späd extrakten till en lämplig utspädning (1:50 1:100) i 1 x PBS extraktionsbuffert, och tillsätt 5 x provbuffert (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% bromfenolblått, 50% glycerol v / v, och 500 mM DTT) till en slutlig 1 × koncentration.
  6. Koka proverna i 5 minuter.
  7. Separata proteiner genom 10% SDS-PAGE, överföring till Immobilon-P-överföringsmembran, och blocket med 0,5% I-block.
  8. Detect GFP med användning av kanin polyklonalt anti-GFP-antiserum vid 1:5000 och HAC1 användning av mus anti-poly-histidin-monoklonal antikropp vid 1:1000 i blockeringslösning under 1 timme.
  9. Efter märkning primära antikroppen, tvätta membranen tre gånger under 10 min vardera med 1 × PBST-20 och inkuberas med en pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad anti-kanin-antikropp vid 1:5000 eller HRP-konjugatd-anti-mus-antikropp vid 1:10.000 under 1 h, för GFP och HAC1 detektion, respektive.
  10. Process Western blotting med hjälp av Supersignal West Pico Chemiluminescent substrat.
  11. Använd GeneTools Programvara för att analysera bandintensitet av proteinet och ingen band kalibrerad mängd.

Proteinproduktion: (kalibrerad mängd x utspädning av provet) / mängd prov laddad) x 4 = mg / kg.
Ekvation: Proteinproduktion (P), kalibrerad mängd (C), spädning av provet (D) och mängden prov laddades (S).

6. Zymogram analys

  1. Samla pBID4-LicKM-infiltrerat N. benthamiana random vävnadsprover.
  2. Extrahera proteiner med användning av samma metoder som beskrivits ovan för Western blot-analys och sedan analysera genom 10% SDS-PAGE med 0,1% lichenan ingår i gelerna.
  3. Efter elektrofores tvättas gelén två gånger under 10 minuter vardera i tvättbuffert (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] och 0,1% Triton X-100) Och därefter inkubera i tvättbuffert vid 65 ° C under 1 timme.
  4. Efter inkubation, kassera tvättbuffert och färga gelerna med 0,5% kongorött under 5 min vid rumstemperatur.
  5. Skölj geler i Milli-Q-vatten tre gånger under 10 minuter vardera, och tillsätt 1 M NaCl för att visualisera likenas aktivitet. Den renade bakteriella likenas proteinet användes som en positiv kontroll för enzymaktivitet.

7. GFP Imaging

  1. Utför visuell upptäckt av GFP fluorescens i hela transient transformerade växter med hjälp av en handhållen långvågig UV-lampa.
  2. Fotografera transient omvandlas anläggningar med en digitalkamera med en gul 8, ES 52 filter (exponeringstid, 15 sek).
  3. Få bilder från Western blot analyser använder GeneSnap programvaran på en GeneGnome och kvantifiera resultaten med hjälp av GeneTools programvara, med en kalibreringskurva baserad på renat GFP standard.
  4. Kvantifiera HAC1 protein med användning av en kalibreringskurva baserad på reninged HAC proteinstandard från A/Indonesia/05/05 stam av influensavirus.
  5. Beräkna medelvärden 3-4 replikat för alla experiment.

Representative Results

Närings krav för växternas tillväxt. Användningen av hydrotillväxtmedium (Rockwool) och näringslösning garanterar likformighet N. benthamiana tillväxt och eliminerar komplexiteten (mekanisk, reglerande och effektivitet) i samband med att använda mark för växtodling. Vi växte N. benthamiana på Rockwool plattor indränkt i kommersiellt tillgängliga gödningsmedel för att fastställa de optimala förutsättningarna för växternas tillväxt och ackumulation av biomassa. Vi observerade 95-100% frögroning. Man bör notera att även fosfor är avgörande för att uppnå groning, eftersom vi funnit att näringslösning som saknar fosfor misslyckats med att stödja groning och tillväxt av N. benthamiana frön (Figur 1A).

Effekter av Agrobacterium tillväxt och infiltration media på växtskydds-och proteinproduktion. Vi har testat flera media förutsättningar för att optimera effektiviteten i tHan agroinfiltration teknik för storskalig produktion. Bakterier (A. tumefaciens GV3101-stam) som härbärgerar pBID4-GFP konstruktet odlades O / N i olika mediebetingelser (YEB, LB eller AB), och antingen centrifugerades och återsuspenderades i induktionsmedium (MMA) (innehållande 1 x Murashige & Skoog [MS] Basal Salt blandning, 10 mM MES pH 5,6, 20 g / l sackaros och 200 ^ M acetosyringone) eller utspädd i Milli-Q-vatten till en 600 på 0,5 före användning för växt infiltration. Vi observerade att vakuum infiltration av växter med bakterier som späds med vatten resulterade i proteinproduktion jämförbara med de som uppnåddes med någon infiltration media i tidigare rapporter 42,48. Däremot infiltration med outspädd Agrobacteria odlas i YEB eller LB media resulterade i fullständig vissnar N. benthamiana lämnar i mindre än 24 timmar efter infiltration, medan outspädda Agrobacteria odlas i AB-medium hade ingen effekt på hälsan hos infiltrerade växter (daten ej visad). Såsom illustreras i figur 1B, växter infiltreras med Agrobacterium-odlingar som växt i YEB, LB-eller AB-medium och späddes med Milli-Q-vatten (01:05, A 600 av 0,6 till 0,8 eller 1:10, A 600 av 0,3 till 0,4) visade inga symtom och uppvisade en genomsnittlig GFP produktion av 1645, 1520 och 1839, respektive. Agrobacteria centrifugeras och åter suspenderas i induktionsmedium (MMA) visade inga symtom och ingen signifikant skillnad i proteinproduktion jämfört med Agrobacteria direkt utspädd i Milli-Q-vatten ( 1671 ± 102 och 1667 ± 131 mg / kg). Därför Milli-Q-vatten rekommenderas för att späda Agrobacterium kulturer för växt infiltration och rutinmässigt används i våra efterföljande försök att uppnå en A 600 på 0,5.

Effekter av Agrobacterium fjädring celltäthet och tidsförloppet på målet uttryck. Vi nästa granskat om bakteriecelltäthetpåverkar effektiviteten av infiltration och nivåer av mål-expression. För detta ändamål utvärderas vi fyra olika cellsuspensions densiteter av Agrobacterium som bär pBID4-GFP, A 600 av 1,0, 0,5, 0,1 och 0,05. Efter infiltration, N. benthamiana växter övervakades för synliga symptom utveckling och tidsförloppet av mål-uttryck genom att samla in prover vid 4, 7 och 10 dpi. Vid 4 dpi, observerade vi märkbara skillnader i GFP fluorescens bland växter infiltrerade med olika cellsuspensions tätheter av Agrobacterium (ingen GFP uttryck observerades vid en 600 på 0,05). Vid 7 dpi, GFP fluorescens var likartad i växter infiltrerat vid cellsuspensions tätheter av A 600 1,0, 0,5 och 0,1, men var lägre i växter infiltrerat på en A 600 på 0,05. Som visas i figur 1C, var dessa uppgifter bekräftas av Western blot analyser av prover som samlats in vid 4 dpi, visar mycket låg produktion protein vid A 600 600 på 1,0 (1739 mg / kg). Vid 7 dpi, växter visade inga signifikanta skillnader i beräknad GFP produktion vid A 600 på 1,0, 0,5 och 0,1 (1.662, 1.870 och 1.890, respektive), medan en 600 på 0,05 visade lägre GFP produktion (1,199 mg / kg). I motsats därtill vid 10 dpi inga skillnader i GFP-produktion observerades bland växterna infiltrerade med någon av de fyra cellsuspensions densiteter (1218, 1181, 1197 och 1304).

Infiltration med alternativa stammar av Agrobacterium. För att öka mångfalden av Agrobacterium stammar tillgängliga för transient proteinproduktion, testade vi vildtyp isolat. Dessa stammar, som isolerats från kronan-galla av naturliga värdar, var vänligen av Dr Gelvin (Purdue University, West Lafayette, Indiana). För att undersöka deras användbarhet i gående proteinproduktion, infiltrerade vi N. benthamiana med följande stammar carrying pBID4-LicKM 18 A. rhizogenes (A4) och A. tumefaciens vildtyp Nester stammarna A348, A208 och A281 (uppkallad AT6, AT10 och At77, respektive), samt konstruerade laboratoriestammar av A. tumefaciens GV3101, C58C1 och LBA4404. De infiltrerade löven uppsamlades vid 7 dpi och nivån av LicKM uttryck uppskattades med Western blot-analys. Som visas i figur 2A, den högsta nivån av LicKM produktion kan uppnås med stammarna GV3101, A4 och LBA4404 (~ 1750 ± 163, 1650 ± 26 och 1450 ± 117 mg / kg), med små skillnader; den lägsta nivån av uttryck (~ 900 ± 102 mg / kg) med C58C1; och mellanliggande produktion med AT6, AT10 och At77 (~ 1250 ± 19, 1100 ± 42 och 1200 ± 111 mg / kg). Den likenas enzymatiska aktiviteten demonstrerades med hjälp Zymogram analys. Figur 2B visar att likenas produceras i infiltrerat växtvävnader med någon av deAgrobacterium-stammar var enzymatiskt aktivt. Man bör också notera att N. benthamiana växter infiltrerade med A4 och At77 stammar uppvisade patologiska symptom (dvärgväxt, bladskaft töjning och curling, och löv curling), medan med AT10 sila symtomen var lindriga. Inga symptom observerades i N. benthamiana växter infiltrerade med laboratoriestam GV3101 (figur 2C).

Infiltration av alternativa Nicotiana arter. Vi jämförde andelen generationens biomassa och proteinproduktion i två vildtyp arter av släktet Nicotiana (N. benthamiana och N. excelsior) och i en hybrid art, N. excelsiana (N. benthamiana × N. Excelsior). Av de testade arter, N. benthamiana, ett vanligt värd för transient proteinproduktion med hjälp av Agrobacterium-baserade eller virusbaserade expressionssystem 2,34,49, når infiltration beredskap inom 4-5 veckor efter groning. Den nödvändiga tillväxtperioden för att skapa den optimala nivån av biomassa är också 4-5 veckor för N. excelsiana men är längre (6-7 veckor) för N. excelsior. Dessutom växtinternoder är relativt korta för N. Excelsior jämfört med andra Nicotiana arter.

Dessutom konstaterade vi att vakuum infiltration av N. benthamiana och N. excelsiana på 50-250 mbar för 60 sekunder är mycket effektiv för agroinfiltration av hela blad, medan N. Excelsior är svårt att infiltrera grund av deras lägre canopy och läderartade blad, även när ett vakuum applicerades tre gånger under vardera 1 min i närvaro av icke-joniska ytaktiva medel såsom Sillwet-77 eller S240. Också grobarheten av N. excelsiana och N. excelsior frön var ~ 40-50%; i syfte att öka grobarheten till 90-100%, måste frön behandlas med 10% blealm i 1 h innan sådd. Under samma odlingsbetingelser, den högsta blad biomassa som kan genereras från N. excelsiana är cirka två gånger högre jämfört med N. benthamiana (tabell 1).

Proteinproduktion undersöktes i N. benthamiana, N. excelsior och N. excelsiana infiltrerade med Agrobacterium-stammen GV3101 hysande pBID4-GFP. GFP ackumulering bedömdes vid 7 dpi i hela infiltrerade blad med UV-ljus följt av Western blot-analys. Figur 3A visar jämn fördelning av GFP i N. benthamiana och N. excelsiana och ojämn fördelning i N. Excelsior (på grund av en svårighet att infiltrera ett helt bladyta i N. excelsior). Figur 3B visar graden av GFP produktionen uppskattas av UV-ljus belysning i infiltrerade löv som samlats in från de tre Nicotiana arter vid 7 dpi. GFP ackumuleradening nivån var högre i N. benthamiana (~ 2,23 g / kg) än i N. excelsiana och N. Excelsior (~ 1,89 och 1,54 g / kg, respektive). Den låga proteinproduktion i N. Excelsior beror på ojämn infiltration och distribution av ackumulerad GFP i insamlade blad.

Vi observerade att övre bladen är direkt utsatta för ljus uppvisar ofta de tidigaste och högsta nivåerna av övergående GFP ackumulation (vid 2-4 dpi) än löv under trädkronorna. Men i våra studier, var GFP ackumulation den högsta på 7 dpi och fördelade jämnt över de flesta bladen, utom i oinfiltrerad nyligen växande blad som inte visar någon GFP ackumulering.

Effekter av vakuumtryck och längd på övergående proteinproduktion. Vacuum infiltration ökar betydligt övergående uttryck nivåer som jämför till tryck appliceras för hand injektion med en spruta utan nål 42. Tillämpningen av envakuum orsakar gaser att evakuera från nedsänkta blad genom klyvöppningar. När vakuumet bryts och trycket ökar snabbt, är upphävandet av Agrobacterium drivs in bladen för att ersätta den evakuerade gaserna 50.

För att testa effekten av vakuumtrycket på bladen av N. benthamiana, infiltrerade vi växter med Agrobacterium-stam GV3101 hysande pBID4-GFP vid olika vakuumtryck (50-400 mbar) i 30 eller 60 sek. Det visades att den starkare vakuum (under 50 mbar) ansökt om 30 eller 60 sek resultat i mekaniska skador av infiltrerat blad, vilket leder till vävnadsvissnande och växt död kort efter infiltration (24-48 timmar). Å andra sidan, tillämpningen av den mildare vakuum (400 mbar) resulterar i infiltrering av endast 50% av bladytan och en minskad nivå av GFP-produktion (303 ± 90 mg / kg) (figur 4A). Viktigt observerade vi inga skillnader i GFP produktion under 50, 100 och 200 mbar (1,651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 mg / kg) (Figur 4A) och mild till ingen, annan negativ påverkan på växtskydd när vakuumtryck 50-200 mbar tillämpades för 30 eller 60 sek. Därför är 50 till 100 mbar vakuumtryck som rekommenderas för infiltrations experiment.

Effekten av att varaktigheten av undertrycket på målet uttryck utvärderades genom att infiltrera en platt av N. benthamiana växter varje timme med en A 600 0,5 av GV3101 hyser pBID4 -. GFP för 8 timmar i samma Agrobacterium kultur Figur 4B visar att nivån av GFP produktionen var liknande på all-time poäng upp till 8 timmar, vilket tyder på att över denna tidsperiod Agrobacterium bibehåller dess förmåga att starta en enkelsträngad DNA.

Effekt av kemisk induktion på proteinproduktion. Vissa växtfenolmetaboliter och socker kan induce virulensgener A. tumefaciens 1,52. Som en följd av detta har många kemikalier och monosaccharaides rapporterats att öka transient proteinproduktion i olika växtarter. Acetosyringone är oftast läggs till kulturer av A. tumefaciens för att inducera den vir-operonet innan agroinfiltration 40,53-57.

Vi har utvärderat effekten av olika koncentrationer av acetosyringon (0, 100, 200 och 400 ^ M) och glukos (0-4%) på övergående GFP proteinproduktion i N. benthamiana infiltrerade med Agrobacterium-stammen GV3101 hyser pBID4 - GFP. För detta ändamål vi återsuspenderas Agrobacterium-celler i MMA induktion media innehållande olika koncentrationer av acetosyringon och glukos till 1-3 h före infiltrering. Enligt resultaten av både visuell observation (data visas ej) och Western blot-analys (Figur 4C), ingen av de testade koncentrationenav dessa föreningar ledde till en signifikant ökning av GFP-fluorescens eller proteinproduktion jämfört med kontroll där induktionsmediet innehöll ingen acetosyringon eller glukos.

Effekt av co-infiltration av en tyst suppressor på övergående produktion av GFP och HAC1 gener i N. benthamiana lämnar. Det har tidigare visats att samtidig uttryck för en tyst suppressor (p19 i Tomat buskig stunt virus [TBSV]) stör posttranskriptionell geners uttryck (PTGS), vilket resulterar i ökad produktion av reporterproteiner 34.

Vi har utvärderat effekten av samtidig infiltration av N. benthamiana med lanseringen vektorn bär GFP reporter genen (pBID4-GFP) och p19. Före infiltration, en A 600 0,5 utspädningar av A. tumefaciens GV3101 kulturer som hyste pBID4-GFP och p19 var för sig blandas i förhållanden av 1:01, 2:01, 3:01 och 4:01. Expression av ljuddämpnings suppressor kontrollerades av blomkålsmosaikvirus 35S-promotor. Som framgår av resultaten av Western blot-analys vid 7 dpi (Figur 5A), gjorde förekomsten av p19 inte öka eller minska GFP produktion i N. benthamiana, vid vilket förhållande som helst av de två Agrobacterium suspensioner.

Vi har också jämfört effekten av två virus-gen tysta dämpning - p23and P19 - om förebyggande av PTGS för HAC1. Odlingar av Agrobacterium som bär lanseringen vektor pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) och en av de två virala Ljuddämpnings suppressor plasmider utspäddes till ett A 600 av 0,5, blandades i ett förhållande av 04:01, respektive, och samtidigt infiltreras i 4-5 veckor gamla N. benthamiana. En suspension av A. tumefaciens som bär pBID4 - HAC1 ensam infiltrerades såsom en kontroll. De infiltrerade bladprover uppsamlades från 3 till 8 dpi. Experimentet var Repeated tre gånger och genomsnittliga nivåer i HAC1 uttrycket bestäms av Western blot-analys.

Såsom visas i figur 5B, co-infiltration av N. benthamiana med p23 eller p19 ledde till (642 ± 157 och 764 ± 108 mg / kg) en ökning HAC1 produktion jämfört med att använda utan att tysta dämpare (ca 15-25%, respektive) vid 6 dpi. Detta tyder på att p23 och p19 är effektiva i vårt system. Emellertid bör det noteras att ackumuleringen av HAC1 inträffade en dag tidigare när pBID4-HAC1 samin infiltrerade med p19. Därför är våra resultat visar att effekterna av tysta suppressor p19 på HAC1 och GFP ackumulation är olika, vilket tyder på selektiv förstärkning av övergående uttryck och / eller stabiliteten hos vissa proteiner i N. benthamiana.

Vi observerade också att både i närvaro och i frånvaro av ett ljuddämpnings suppressor nivån för HAC1 protein produktion började sjunkande vid 7 dpi. Detta tyder på att tidpunkten för nedgången i den övergående proteinproduktion i N. benthamiana infiltrerade med lanseringen vektorn är målspecifika.

Den cellbank av Agrobacterium hysande lanseringen vektor utvärderades varje år för målgenen stabilitet, Agrobacterium livskraft och den nivå av protein-ackumulering. Den glycerol lager av cellbank av GV3101 stam transformerad med pBID4-HAC1 att vid -80 ° C lagrades har visat sig vara mycket stabil i mer än tre år utan förändringar i nivån av övergående proteinproduktion i infiltrerade N. benthamiana växter. Figur 5C visar att HAC1 proteinproduktionen uppskattas av Western blotting under åren 2010, 2011, 2012 och 2013 var 670, 685, 566 och 683 mg / kg, respektive. Medel HAC1 produktion i N. benthamiana växter var 651 ± 49,4 mg / kg.


Tabell 1. Jämförelse av N. benthamiana och N. excelsiana växtodling biomassa.

Figur 1
Figur 1. Western blot-analys av övergående genuttryck i N. benthamiana. (A) Sex veckor gamla N. benthamiana 1) växter som växer i en lösning gödselmedel som innehåller 4,8% fosfor och 2) växter som växer i en lösning gödselmedel som innehåller 0% fosfor. Tjugofem pg av färska blad vikt motsvarande laddades per körfält. (B) Jämförelse av GFP produktion i växter vakuum infiltrerade med pBID4-GFP-härbärge Agrobacterium GV3101 kulturer odlas i tre olika medier: YEB, AB och LB. GV3101 kulturer odlas O / N i YEB eller LB-medium centrifugerades vid låg hastighet och återsuspenderades i induktionsmedium (MMA) (spår: MMA-1 och MMA-2, respektive), eller odlas O / N i YEB, LB eller AB media och direkt utspädd till 1:05 eller 1:10 med Milli-Q-vatten (spår: YEB / 5 och YEB/10, AB / 5 och AB/10, LB / 5 och LB/10) (C) Jämförelse. av GFP uttryck vid 4, 7 och 10 dpi efter vakuum infiltration med olika koncentrationer (A 600 på 1,0, 0,5, 0,1 och 0,05) av A. tumefaciens GV3101 stam bär pBID4-GFP.

Figur 2
Figur 2. Jämförelse av övergående likenas produktion och aktivitet efter vakuum infiltration av N. benthamiana växter med diffehyra stammar av Agrobacteria. Kulturer av Agrobacteria stammar (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, AT10 och LBA4404) hyser lanseringen vektorn pBID4-LicKM var infiltrerat sig in i blad av N. benthamiana. Infiltrerade löv samlades vid 7 dpi. (A) likenas produktionen kvantifieras av Western blotting. (B) Zymogram analys visar likenas produktion genom enzymatisk aktivitet. (C) Effekt av Agrobacterium (vildtyp A4, AT10, At77 och laboratoriestam GV3101) infiltration på N. benthamiana växtskydd vid 7 dpi. Tjugofem ng av färskt bladvikt ekvivalent laddades per bana.

Figur 3
Figur 3. Transient GFP uttryck i blad av N. benthamiana, N. excelsiana och N. excelsior vid 7 dpi efter vakuum infiltration med A. tumefaciens hyser lanseringen vektor pBID4 - GFP. (A) Visuell undersökning av GFP-uttryck i ultraviolett ljus. (B) Western blot-analys av GFP-ackumulering.

Figur 4
Figur 4. (A) Effekter av vakuumtryck på övergående GFP uttryck och växtskydd. N. benthamiana växter infiltrerats med pBID4 -. GFP under vakuumtryck på 400, 200, 100 eller 50 mbar, vid vakuum hålltid på 30 eller 60 sek (B) Stabilitet och smittsamhet av A. tumefaciens i N. benthamiana infiltrerade med Agrobacterium GV3101 hysande pBID4-GFP odlades i AB-medium och späddes till en A 600 av 0,5. Agroinfiltration utfördes genom att infiltrera en platt av N. benthamiana växter varje timme i samma utspädda Agrobacterium-kultur (banorna 0-8). (C) Effekt av olika koncentrationer av acetosyringon och glukos på transient uttryck av GFP. Den Agrobacterium-stam GV3101 hysande pBID4 - GFP odlades O / N i YEB medium, centrifugerades och resuspenderades till en A 600 av 0,5, antingen i MMA innehållande 2% glukos med acetosyringon vid 0, 100, 200 eller 400 | iM, eller i MMA innehållande 200 ^ M acetosyringone med glukos vid 0, 1, 2 eller 4%. Agrobacterium suspensionerna förvaras under 3 h vid rumstemperatur innan infiltration.

Figur 5
Figur 5. Effekter av tysta dämpning på övergående proteinproduktion i N. benthamiana lämnar. (A) Western blot-analys av GFP-proteinet efter samtidig infiltration av pBID4-GFP och P19 vid olika förhållanden. Prov som samlats in vid 7 dpi (25 pg av färska blad vikt motsvarande laddades per spår). (B) En kultur av Agrobacterium bär pBID4-HAC1 var individuellt blandad i proportionen 4:1 med en kultur som bär p19 eller p23 ljuddämpning dämpare plasmider. De erhållna kombinationerna av Agrobacterium Kulturerna vakuum infiltreras i växter. Infiltrerat vävnader HAC1 samlades dagligen upp till 8 dpi för rekombinant protein kvantifiering. (C) Stabilitet av Agrobacterium cellbank. Växterna infiltrerades med samma sats av Agrobacterium cellbank varje år för att utvärdera protein-ackumulering. Femtio pg av färska blad vikt motsvarande laddades per körfält. Klicka här för att se en större version av thär figur.

Discussion

I denna studie har vi utvecklat en enkel agroinfiltration protokoll för rutin transient proteinproduktionen i vissa Nicotiana art med användande av Agrobacterium-stammar som bär lanseringen vektor. Dessutom har vi identifierat de optimala förutsättningar för att uppnå högsta rekombinanta proteinproduktionsnivån i vår övergående växtexpressionssystem.

Vakuum infiltration av den utspädda A. tumefaciens stam GV3101 hyser lanseringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana och N. excelsior resulterade i högre nivåer av mål-proteinproduktion inom 7 dpi jämfört med andra växtarter, såsom Pisum sativum infiltreras med GV3101 hysande alfalfamosaikvirus - eller gurkmosaikvirus baserade vektorer som uttrycker GFP-reportergenen under 35S-promotorn 41 eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum och Arabidopsis thaliana infiltreras med C58C1 stam av A. tumefaciens som bär beta-glukuronidas reporter gen 57. N. benthamiana och N. excelsiana var lätta att dammsuga infiltrera på 50 mbar för 30-60 sek, med 90-95% infiltration effektivitet. De återstående 5-10% av bladytan var inte infiltreras på grund av någon flyt av blad på ytan av det Agrobacterium-suspension under applicering av vakuum. Sedan lanseringen vektorn har förmåga för cell-till-cellrörelse 18, uppstår övergående protein ackumulering i hela blad samt bladskaft vid 7 dpi. Vid 10 dpi, den beräknade GFP produktionen var något lägre på grund av att pBID4 expressionsvektor kan röra sig från cell till cell, men inte röra system 18; Därför behöver nya odlade blad innehåller inte vektorn och inte bidrar till produktionen av målet. Dessutom nedbrytning av det rekombinanta proteinet med tiden may bidra till minskad proteinnivå på 10 dpi. Våra resultat visade att infiltrering av A. tumefaciens-stammen GV3101 förmedlade höga nivåer av övergående proteinproduktion i N. benthamiana. Vidare kan målproteinet vara konstruerad som N-terminala, C-terminala eller interna fusioner till likenas (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanas, som är ett värmestabilt enzym från Clostridium thermocellum och ger värmestabilitet till många mål proteinfusion 18. Infiltration av N. benthamiana med A. tumefaciens vildtyp stammar (AT6, AT10 och at77) hyser genen av intresse framkallade milda eller allvarliga symtom: blad curling, bladskaft töjning, och curling. Inga patologiska symptom observerades i N. benthamiana infiltrerade med laboratoriestammen GV3101 hyser tom pBID4 vektor, medan vissa gener in i pBID4 och omvandlas till laboratoriestammar GV3101, C58C1 eller LBA4404 framkallade milda nekrotiska svar och lövkloros / gulnande symptom i infiltrerade regioner av löv. Nekrotiska symptom orsakade av vildtyp Agrobacterium eller avväpnade stammar i Solanaceae växter har tidigare 56,57 rapporterats. Den nekrotiska svar skulle kunna resultera från virulensfaktorer från typ III-sekretionssystemet, bakteriella proteiner som överförs till växtcellen genom typ IV sekretionssystemet, och / eller känslighet för flagellin 58-60. Vi har funnit att övergående produktion av heterologa proteiner också kan framkalla patogenicitet och en överkänslig reaktion på infiltrerade blad. Många forskare rapporterade att agroinfiltration av olika växtarter med växt binära vektorer produceras upp till 5-20 gånger högre nivåer av övergående proteinproduktion jämfört med stabilt transformerade växter 28,57. Våra data visar att N. benthamiana infiltrerade med GV3101 hysande pBID4-GFP uttrycktes transient höga nivåer av GFP, vilket liknar GFP utbyte rapporteras förN. benthamiana infiltrerade med Agrobacteria bär Pich-GFPSYS virusvektor (upp till 80% av den totala lösligt protein) 44. Agroinfiltration använda vår lansering vektorn gav hög produktion av det termostabila proteinet LicKM, 50-faldigt högre än den som observerades med användning av en vanlig binär plasmid 18.

För att testa smittsamhet av A. tumefaciens och stabiliteten i lanseringen vektor, infiltrerade vi en platta av N. benthamiana varje timme i upp till 8 h med användning av samma Milli-Q-vatten-utspädda kultur av GV3101 härbärgerar den pBID4-GFP plasmid. Våra data visade att GV3101 stammen effektivt smitt i minst 8 timmar och pBID4 (lanseringen vektor) är mycket stabil under 8 timmar långa infiltration.

Glycerol lager av GV3101 stam härbärge lanseringen vektorn pBID4-HAC1 (cellbank) förvaras vid -80 ° C har visat sig vara mycket stabil i tre år utan förändringar i övergående protei produktion i infiltrerade växter.

N. benthamiana växter som odlas under optimala förhållanden och mellan 35 och 42 dagar efter sådd var optimala för vakuuminfiltrering-medierad transient genuttryck 40. Yngre växter (3-4 veckor) kan inte infiltreras i sin helhet på grund av löv som flyter på cellsuspensionsytan och vävnadsskada från de mekaniska effekterna av att tillämpa ett vakuum. I anläggningar som är äldre än 45 dagar, N. benthamiana bultning skede under optimala ljusförhållanden som används, är den nivå av övergående uttryck låg.

Lågmolekylära fenolföreningar (acetosyringone) och monosaccharaides (glukos) är kända för att inducera vir-gener i A. tumefaciens 55,61. Dessutom infiltration av N. benthamiana med den binära vektorn pCAMBIA (GFP) i närvaro av acetosyringon vid koncentrationer av 50-600 | iM visade sig öka något övergåendegenuttryck 40. Vi studerade effekten av olika koncentrationer av acetosyringon och glukos i vårt system genom att lägga till dessa föreningar till GV3101 kulturer hyser pBID4-GFP i MMA i 3 timmar, och fann ingen skillnad i GFP uttryck. Intressant GV3101 kulturer hyser pBID4-GFP och efter utspädning i Milli-Q-vatten till en A 600 på 0,5 och infiltrerade utan vir geninduktion uttryckte samma mängder av GFP som de infiltrerade med inducerade kulturer. Den A. tumefaciens vir-genen (s) skulle kunna induceras av växtfenolföreningar (acetosyringone och sinapinsyra) och växt monosaccharaides (glukos och fruktos) som finns i bladvävnad. Därför kan vi spekulera i att liknande nivåer av GFP-uttryck i närvaro eller frånvaro av exogena vir-genprodukter inducerare kan vara ett resultat av verkan av cytoplasmatiska vir-genprodukter inducerare närvarande under replikation av GFP-uttryckande lanseringen vektorn i växtceller.

N. benthamiana har använts som en modell värd för transient proteinproduktion 49. Men N. benthamiana s relativt låga avkastning biomassa hindrar sin ansökan om storskalig produktion av rekombinanta proteiner. Den optimala värden bör kombinera en hög nivå av övergående uttryck, lätt tillväxt i ett växthus, och vara mottagliga för Agrobacterium infiltration 2. För att välja en alternativ värd, vi infiltrerade två olika vildtyp arter av Nicotiana (N. benthamiana och N. excelsior) och en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens stam GV3101 härbärgerar pBID4-GFP plasmid. Bland dessa tre arter, nivån av GFP uttryck var något högre i N. benthamiana. N. excelsior växter visade svårighet vakuum agroinfiltration grund av sina läderartade blad, och N. excelsianaproduceras cirka två gånger mer biomassa på samma villkor tillväxt. Den övergående produktionen av GFP vid 7 dpi är relativt lika i N. benthamiana och N. excelsiana. Därför, N. excelsiana kan vara en mer lämplig värd för rekombinant proteinproduktion.

Agrobacterium-medierad transient proteinproduktion är begränsad av PTGS 26, som kan övervinnas genom samexpression av geners suppressorer av växtvirus ursprung 62. Transient proteinproduktion har tidigare visats att ökas 50-faldigt i närvaro av p19-protein av TBSV, som hämmar PTGS i infiltrerade vävnader 34. I vår studie, bedömde vi effekten av två virustyst dämpning (P19 och P23) separat co-infiltrerade med lanseringen vektorn pBID4-HAC1. Samtidig infiltration av dessa tysta dämpare verkade ha lite inflytande på gående uttryck av HAC1, med endast en liten ökning i HAC1proteinackumulering (15-25%) i närvaro av co-infiltrerade p23 eller p19. För att positivt påverka proteinproduktion, kan tysta dämpare måste vara särskilt utvalda för att vara effektivt för de berörda växtarter och virusvektor 63. TMV helikas har en suppressor av RNA som tystar aktivitet 64,65. Våra data bekräftar denna observation som co-infiltration av p23 eller p19 med pBID4-HAC1 gav ingen ökning av GFP eller en liten ökning av övergående HAC1 proteinproduktion.

Sammanfattningsvis har vi modifierat och optimerad anläggning och Agrobacterium tillväxtförhållanden och effektiviserat vakuum infiltration. Denna teknik det möjligt för oss att växa och infiltrera hundratals kilo växtmaterial inom några timmar. Vi framgångsrikt automatiserat anläggningen gående uttryck teknik för hög genomströmning vaccinproduktionen vid industriella skalor enligt nuvarande Good Manufacturing Practices (cGMP) villkor. För mer information aboUT automation och användning av anläggningen övergående proteinproduktionssystem för produktion av rekombinanta proteiner, inklusive subenhet vaccinkandidater, under cGMP förhållanden, är läsarna hänvisas till webbplatsen www.fhcmb.org/ .

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Fraunhofer USA Centrum för Molekylär Bioteknik, Ibio, Inc. och Defense Advanced Research Projects Agency (bidrag # HDTRA1-07-C-0054). Författarna erkänner de generösa gåvor av Dr. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammar) och Wayne Fitzmaurice av Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frön), liksom Jennifer Nicholson of US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior frön ). Författarna tackar Margaret Shillingford och Christopher Hull för att ge växter och utmärkt tekniskt stöd. Författarna tackar också Dr. Stephen Streatfield och Natasha Kushnir för redaktionell hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nicotiana benthamiana Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555478 TW16 Infiltration
Nicotiana excelsior Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University PI 555685 TW47 Infiltration
Nicotiana excelsiana Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA LSBC EBA 042304.02 Infiltration
Vacuum skid Abbas, Ashland, MA Custom made Plant infiltration
Rockwool Grodan Inc., Ontario, Canada AO 50/40 Hydroponic media for growing plant
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ 172595000 Buffer
Murashige & Skoog salt (MS salt) Phyto Technology Lab M524 Tissue culture media
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406-5G Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane Millipore, Billerica, MA IPVH00010 Western blotting
I-block Applied Biosystems, Foster City, CA T2015 Western blotting
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum  Washington Biotechnology, Baltimore, MD Western blotting
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody Qiagen GmbH, Hilden 34670 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody  Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 111-035-003 Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 115-035-003 Western blotting
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL 34078 Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland P-LICHN Lichenase Activity
Congo Red  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO C6277 Gel staining
Digital camera  Olympus, Center Valley, PA C-8080 Chemiluminescence imaging
GeneGnome Syngene, Frederick, MD Chemiluminescence imaging 
GFP standard  Made in house Chemiluminescence imaging 
Plant fertilizer solution Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE 67-23-20 Plant growing
Lichenase Standard Purified in house Western blotting
MicroPulser Electroporator BioRad, Hercules, CA 165-2100 Agrobacterium transformation 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics