Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

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Bioengineering

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Summary

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

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Jones, C. N., Hoang, A. N., Dimisko, L., Hamza, B., Martel, J., Irimia, D. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. J. Vis. Exp. (88), e51215, doi:10.3791/51215 (2014).

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Abstract

Os neutrófilos desempenham um papel essencial na proteção contra infecções e seus números no sangue são freqüentemente medido na clínica. Maiores número de neutrófilos no sangue são geralmente um indicador de infecções em curso, enquanto a baixa contagem de neutrófilos são um sinal de alerta para os riscos mais elevados para infecções. Para realizar as suas funções, os neutrófilos, também tem que ser capaz de se mover de forma eficaz a partir do sangue, onde eles passam a maior parte de sua vida, para os tecidos, onde ocorrem infecções. Consequentemente, quaisquer defeitos na capacidade dos neutrófilos para migrar pode aumentar os riscos de infecções, mesmo quando os neutrófilos estão presentes em números adequados no sangue. No entanto, a medição de neutrófilos capacidade de migração na clínica é uma tarefa desafiadora, que é demorado, exige grande volume de sangue, e conhecimento especializado. Para lidar com essas limitações, nós projetamos um robusto ensaios microfluídicos para a migração de neutrófilos, o que requer uma única gota de sangue não transformados, circumvents a necessidade de separação dos neutrófilos, e é fácil de quantificar num microscópio simples. Neste ensaio, os neutrófilos migram directamente a partir da gota de sangue, através de pequenos canais, no sentido da fonte do quimioatractor. Para evitar que o fluxo granular de células vermelhas do sangue através dos mesmos canais, implementamos filtros mecânicos com ângulo direito voltas que bloquear seletivamente o avanço das células vermelhas do sangue. Nós validamos o ensaio comparando a migração de neutrófilos de gotas de sangue coletadas de punção digital e sangue venoso. Também comparamos todo estes sangue (BM) fontes com migração de neutrófilos a partir de amostras de neutrófilos purificados e encontrou velocidade consistente e direcionalidade entre as três fontes. Esta plataforma microfluídica permitirá o estudo da migração de neutrófilos humano na clínica e no ambiente de pesquisa para ajudar a avançar a nossa compreensão das funções de neutrófilos na saúde e na doença.

Introduction

Tráfico de neutrófilos desempenha um papel fundamental na determinação do progresso e resolução de muitas doenças inflamatórias, incluindo aterosclerose 1, infecção bacteriana ou sepsia 2, lesão por queimadura e 3. Por sua grande contribuição para as condições de saúde e doença, contagem de neutrófilos é parte da análise de sangue padrão muitas vezes considerado em laboratórios clínicos e de pesquisa. No entanto, apesar de ser um dos testes mais ubíquos, o valor de contagem de neutrófilos para o diagnóstico da infecção e sépsis tem sido frequentemente questionada 4. Por exemplo, um estudo de neutrófilos em pacientes com queimaduras revelou que a contagem de neutrófilos e função de migração de neutrófilos não se correlacionam; significando contar que neutrófilos por si só não é um indicador preciso do estado imunológico 3. Embora mais difícil de medir, competência funcional de neutrófilos tem sido proposta como mais valioso em uma ampla gama de condições.

t "> É importante, muitos dos defeitos de neutrófilos são transientes e não são provocados por defeitos genéticos permanentes, uma distinção que tem sido largamente ignorada na clínica até recentemente. No contexto de queimaduras, a migração de neutrófilos pode ser monitorizada durante o curso de o tratamento de um paciente como um indicador do estado inflamatório ou infecção 3. ensaios de migração tradicionais actualmente utilizados no laboratório (câmara de Boyden, Dunn câmara, ensaio micropipeta) não pode ser traduzido em um ambiente clínico porque requerem grandes volumes de sangue e pesado demorado técnicas de isolamento de neutrófilos (Tabela 1). Estes ensaios também não pode ser usado para monitorar as mudanças transitórias na quimiotaxia de neutrófilos em animais de laboratório pequenos, tais como ratos, porque o volume de sangue necessário para o isolamento de neutrófilos permite apenas um exemplo e muitas vezes até mesmo exige conjugação de sangue de vários animais para um único ensaio. Por exemplo, um estudo envolvendo mcondições ultiple e tratamentos ao longo de vários pontos temporais poderiam exigir milhares de ratos usando ensaios de quimiotaxia atuais. Isso restringe a pesquisa biológica básica que pode ser feito para compreender a complexa dinâmica da função imune no contexto de lesão, infecção ou queimar freqüentemente estudados em modelos murinos 5.

Para satisfazer a necessidade de um ensaio funcional de neutrófilos que é rápida e robusta, enquanto o volume de sangue que exige um mínimo, temos desenvolvido um dispositivo de microfluidos, que mede a quimiotaxia de neutrófilos directamente a partir de uma pequena gota de sangue completo. Sabe-se que muitos fatores em sangue total, incluindo soro 6 e 7 plaquetas, afetar a função dos neutrófilos. Por conseguinte, é benéfico que o doseamento de microfluidos sangue total minimiza o processamento da amostra para manter o microambiente in vivo dos neutrófilos ao medir variações de quimiotaxia com um ensaio in vitro 8. Esta abordagemreduz o tempo de coleta de sangue para testes de migração de neutrófilos de horas usando técnicas tradicionais, a poucos minutos (Tabela 1). A plataforma de microfluidos sangue total produz um gradiente linear quimioatractiva estável durante a duração da experiência, não tem partes móveis, e não necessita de uma fonte de pressão exterior (isto é, uma bomba de seringa). A característica-chave no desenho de conjunto do dispositivo de microfluidos de sangue é a incorporação de uma célula de sangue vermelho (RBC) pente filtração que filtra mecanicamente GVs de entrar no canal de migração do dispositivo. As voltas à direita deste pente filtração evitar a necessidade de filtração exclusão de tamanho, o que provavelmente seriam obstruídos por hemácias e, portanto, bloquear o gradiente chemoattractant de atingir os neutrófilos migram ativamente na WB. A incorporação de todo o dispositivo de microfluidos de sangue em uma placa de 12 ou 24 poços facilita o rastreio de vários mediadores de si quimiotaxia de neutrófilos humana ou murinataneamente.

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Protocol

1. Fabricação de dispositivos microfluídicos

  1. Usando técnicas de fotolitografia padrão, fabricar o wafer molde mestre em uma classe de 1000 sala limpa. Padrão da primeira camada de material fotosensitivo 3 mícrons-fina à base de epóxi negativo para definir os canais de migração de acordo com as instruções do fabricante. Padrão a segunda camada de 50 mícrons de espessura para definir as câmaras de célula de carga e quimiocinas.
  2. Use o wafer padronizada para lançar dispositivos polidimetilsiloxano (PDMS). Misture vigorosamente PDMS (20 g) com o iniciador (2 g) durante 5 min usando garfo de plástico, em grande bandeja de pesagem de plástico.
  3. Com cuidado, despeje PDMS para molde.
  4. Desgasificar o PDMS pela colocação do molde com PDMS vertida num exsicador de vácuo durante 1 hora.
  5. Asse e curar PDMS dispositivos de microfluidos para, pelo menos, 3 horas num forno regulado para 65 ° C.
  6. Perfurar os WBLCs centrais usando um perfurador com um diâmetro da ponta de 1,5 mm.
  7. Retire o dispositivos em forma de anel inteiras usando uma punçãoela com um diâmetro da ponta de 5,0 mm.
  8. Remova as partículas a partir de dispositivos de rosca com fita adesiva.
  9. Lavar a 12 poços placa com água deionizada e, em seguida, seco com nitrogênio. Colocar em placa a 60 ° C forno durante 5 min.
  10. Plasma de oxigénio tratar a placa de 12 poços por duas vezes; uma vez sozinho por 35 segundos e, em seguida, novamente com os dispositivos de rosca para outros 35 seg.
  11. Com cuidado, coloque os dispositivos nos poços da placa, usando uma pinça.
  12. Asse placa com dispositivos ligados em uma placa quente definida como 80 ° C durante 10 min.

2. Microfluidic Ensaio Preparação

  1. Dispositivos de microfluidos Prime imediatamente após o tratamento por plasma de oxigénio, quando o dispositivo é hidrófilo e os efeitos capilares pode promover a iniciação dos pequenos canais no dispositivo.
  2. Criar solução quimioatractiva pela mistura de 5 mL de fMLP [solução stock 10 uM] com 5 mL de fibronectina [solução de estoque de 1 mg / mL] e 490 uL de HBSS.
  3. Lentamente pipeta & #160; solução quimioatractiva em WBLC, utilizando uma ponta de carga do gel (Figura 1A). Pipeta um adicional de 20 ul de quimioatractor em torno do exterior do dispositivo.
  4. Coloque a placa num secador durante 15 minutos. Através da aplicação de um vácuo para o dispositivo, a solução é instilada nos canais laterais do dispositivo e o ar deslocado difundido para fora através das PDMS.
  5. Retire a placa de exsicador e confirmar umedecimento do canal dispositivo sob microscópio. Veja como bolha torna-se menor, como solução chemoattractant entra na câmara. Nenhuma bolha deve estar presente no interior do dispositivo após o tratamento a vácuo.
  6. Lava-se a WBLC e fora do dispositivo completamente para remover o excesso de solução quimioatractor. Este passo produz um gradiente de quimioatractor de cada uma das câmaras quimiotáticos focais (FCC) para o centro do dispositivo.
    1. Encha uma seringa de 1 ml com PBS, adicionar uma 30 G contundente ponta da agulha de seringa. Gentilmente, insira a ponta da agulha da seringa nopara o centro do orifício de rosca. Suavemente empurrar 100 ul de PBS no orifício de modo a que uma gotícula de formas de PBS na parte superior do dispositivo.
    2. Placa de inclinação e de pipeta de 1 ml de PBS em torno do dispositivo de modo a que o líquido se acumula na parte inferior do poço. Aspirar o processo líquido e repita para o total de 3x usando solução tampão fresco (media de uso em vez de buffer se os neutrófilos separados serão carregados em media) 9.
  7. Encher cada poço com a mídia até que os topos dos dispositivos estão submersos sob líquido. Deixe os dispositivos descansar por 15 min para permitir inclinação a se estabilizar. Os resultados experimentais e os dados teóricos obtidos em simulações de elementos finitos mostram que os gradientes em estes dispositivos são estáveis ​​até cerca de 24 horas, para as moléculas pequenas (por exemplo, fMLP) e até um de vários dias para o maior peso molecular (por exemplo, IL8).
  8. Usando Dicas para colocar o gel, lentamente pipeta 2 mL de sangue (neutrófilos ou isoladas) em cada loa sangue totalding câmara (WBLC) (Figura 1A).

3. Preparação de Amostras

Os neutrófilos humanas A partir de sangue capilar

  1. Coletar sangue capilar de punção digital de voluntários saudáveis, que está em nenhum imunossupressores. Todas as amostras dos pacientes foram obtidas com consentimento informado por escrito, e através de procedimentos aprovados pelo MGH e Shriners Conselhos de Revisão Institucional.
    1. Para a coleta de sangue de punção digital, lavar as mãos com água e sabão e seque a pele. Preparar a solução estoque anti-coagulant/stain adicionando 1 ml HBSS + 0,2% de HSA e 10 mL Hoechst mancha (32,4 mM) à heparina tubo de coleta de sangue (1,65 USP/50 mL de sangue). Picar o dedo usando uma lanceta segurança SurgiLance (profundidade de 2,2 mm, 22 G), limpe primeira gota de sangue e recolher 50 mL de sangue em tubo Eppendorf contendo o estoque de anti-coagulante e solução fluorescente mancha Hoechst (10 mL) e gentilmente misturar.
    Incubar o sangue e Hoechst mancha durante 10 min para permitir a coloração fluorescente núcleo. Execute amostra dentro de 1 hora da coleta de sangue.

Neutrófilos humanos do sangue venoso

  1. Desenhar 10 ml de sangue periférico, venoso em tubos contendo 33 USP de heparina.
  2. Adicionar 50 mL de sangue venoso para a mídia e Hoechst mancha como descrito anteriormente. Incubar o sangue e Hoechst mancha durante 10 min para permitir a coloração fluorescente núcleo. Execute amostra dentro de 1 hora da coleta de sangue.

Neutrófilos Separação De Sangue - Controle Positivo

  1. Para separar os neutrófilos, utilizar técnicas estéreis para isolar os neutrófilos a partir de 10 ml da amostra de sangue total venoso usando Hetastarch (6% w / v) de gradiente de densidade, seguido por uma selecção kit de isolamento de esfera magnética negativa seguindo o protocolo do fabricante.
  2. Ressuspensas a alíquota final, de neutrófilos a uma concentrção de 4.000 células / ul em 1X HBSS + 0,2% de albumina do soro humano. Manter as células a 37 ° C até que esteja pronto para executar o experimento.

4. Microscopia e Análise de Imagem para medições de quimiotaxia de neutrófilos

  1. Defina-se a temperatura biochamber a 37 ° C, humidade entre 80% e CO 2 a 5%.
  2. Comece imaginando imediatamente o uso de imagens de lapso de tempo em um microscópio (10X ou superior ampliação).

5. Statistical Analysis

  1. Rastrear manualmente, pelo menos, 50 neutrófilos em cada amostra.
  2. Contar as células que entram na FCC ao longo do tempo (Figura 2).
  3. Calcular as velocidades de neutrófilos no canal entre WBLC e CCI, utilizando o ImageJ (NIH) (Figura 2).
  4. Quantificar direccionalidade de neutrófilos através da contagem do número de células que passam a bifurcação e calcular a razão entre o número de células que voltam-se para o FCC e que as células de saída the dispositivo. As células que não são direcionais não seguem o gradiente quimiotático e, portanto, migrar em números iguais em direção à FCC e do canal de saída (Figura 2).

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Representative Results

O sangue (BM) ensaio quimiotaxia de neutrófilos todo foi validada medindo o acúmulo de neutrófilos para um gradiente fMLP (S1 Filme). Os resultados confirmam que os glóbulos vermelhos estão presos pelo pente filtração enquanto neutrófilos (azuis) são capazes de migrar ativamente de todo o sangue (Figura 3A e S1 Filme). O gradiente estável linear chemoattractant (verde), formado por todo o dispositivo micro sangue foi confirmado usando dextrano marcadas com FITC (Figura 3A inserção) e mediram os níveis de fluorescência ao longo do tempo. Os gradientes produzidos nestes dispositivos eram estáveis ​​até 24 horas, para as moléculas pequenas e até uma semana para o maior peso molecular. A eficiência do protocolo de lavagem foi verificada pela imagem do sinal de fluorescência localizada no FCC com nenhum sinal no WBLC ou em torno do dispositivo. Os dispositivos foram em seguida utilizados para avaliar as diferenças na migração de neutrófilos a partir de diferentes blfontes ood.

Os resultados obtidos usando o romance plataforma quimiotaxia WB revelam que neutrófilos de uma gota de punção digital de WB, de WB venoso, ou isolados a partir de sangue venoso migrar com velocidade constante (20 ± 2 mm / min, linha azul) e com células migratórias totais semelhantes ( 38 ± 10 células / hr, barras a sombreado) a partir de todas as fontes de sangue (Figura 3B). Nós também foram capazes de quantificar a direção ou a capacidade dos neutrófilos de seguir corretamente o gradiente quimiotático. A bifurcação incorporadas ao design do dispositivo sangue total nos permitiu quantificar os neutrófilos que migraram direcional ao longo gradiente chemoattractant para a FCC em comparação com neutrófilos que migraram aleatoriamente sob quimiocinese e saiu do dispositivo. Os neutrófilos que migram de todas as três fontes de sangue migrou com um índice de 0,9 direcionalidade (9 células para FCC para cada célula que saiu do dispositivo).


Figura 1. Esquemática do dispositivo em forma de donut. A) Quimioatraente está preparado para o dispositivo e um gradiente é formado ao longo do canal de migração para as câmaras de quimiotaxia focais (FCC). Dezesseis FCC cercam cada WBLC. Após a lavagem, o quimioatraente apenas permanece no FCC, e um gradiente linear é formado ao longo do canal de migração. O glóbulos vermelhos (RBC) comb filtração impede hemácias de entupimento do canal, impedindo a migração de neutrófilos ativa. Veja S1 Filme. B) Os neutrófilos migram ativamente de sangue total e se acumulam na FCC, e sua velocidade, direcionalidade e os números podem ser quantificados com precisão. Clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquemática e visão geral do esquema de contagem de células para o dispositivo WB. Os neutrófilos migram ativamente de 2 mL de sangue inteiro (BM) carregado no carregamento sangue câmara todo (WBLC) passado a pente filtração de células vermelhas do sangue e na entrada do dispositivo. Direcionalidade da célula é medido com base na decisão da célula na bifurcação. Neutrófilos direcionais seguirá o gradiente quimiotático levando para as células da câmara de quimiotaxia e não-direcionais focais não vai seguir o gradiente e migrará aleatoriamente para o canal de saída ou FCC com uma distribuição igual. Contagem de células final é calculada em cada ponto de tempo por meio da contagem de células no FCC.files/ftp_upload/51215/51215fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Medição quimiotaxia de neutrófilos a partir de uma gota de sangue completo (WB). A) AR (1 ml) é carregado para todo o carregamento da câmara de sangue (WBLC). Os neutrófilos (azuis) migram ao longo do gradiente quimiotático fMLP formado no canal de migração para a FCC. B) Os neutrófilos a partir de uma gota de punção digital de WB, de WB venoso, ou isolados a partir de sangue venoso migrar com números consistentes (bares) e de velocidade (azul linha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Tabela 1. Comparação de protocolos para a quimiotaxia de neutrófilos usando toda a plataforma de microfluidos sangue versus um dispositivo de microfluidos de canal lateral e a câmara de Boyden tradicional. A quantidade de tempo e reagentes para completar cada passo de protocolo são comparadas entre os diferentes métodos para medir a quimiotaxia de neutrófilos. A plataforma de microfluidos sangue reduz o tempo total necessário para realizar o ensaio em 95% e o volume de sangue necessário> 99%.

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Discussion

Neste trabalho, foi desenvolvida uma plataforma microfluídica para medir quimiotaxia de neutrófilos a partir de uma gota de sangue (2 mL). A filtragem mecânica on-chip de hemácias de migração de neutrófilos ativamente contorna a necessidade de métodos complicados de separação de células, como a densidade gradientes 10, a seleção positiva 11, ou seleção negativa de 12, que são propensas a introduzir artefatos ativando neutrófilos. A filtragem mecânica de hemácias distingue a nossa tecnologia de outros chips microfluídicos para sondar a migração de neutrófilos. Por exemplo, os trabalhos anteriores de nosso laboratório e 13 Beebe et al. 8 selectinas utilizados no chip, para separar os neutrófilos a partir de toda a amostra de sangue, antes do ensaio de quimiotaxia. Após separação sobre superfícies de selectina, a migração de neutrófilos ocorreu em solução tampão. Nestas condições, qualquer efeito do soro na quimiotaxia dos neutrófilos foi removido. Além disso, as selectinas são conhecidospara activar as células, envolvendo receptores específicos e, portanto, podem alterar em medições de quimiotaxia in vitro. A separação mecânica pelo pente filtração RBC em nosso dispositivo não altera o estado de neutrófilos medidos pelo nosso dispositivo. Nosso dispositivo facilita as medições robustas de velocidade e célula número de acumulação, bem como direcionalidade celular.

Neste estudo, demonstrámos que os neutrófilos a partir de voluntários saudáveis ​​que migram do sangue capilar, uma gota de sangue venoso, e separados do sangue venoso migrar com velocidade e direccionalidade 14 semelhante. A medição de neutrófilos direccionalidade é importante em condições inflamatórias, tais como queimaduras, 3, 15 e 16, onde o trauma direccionalidade é conhecida a ser prejudicada. Prejudicada e mais estimulado neutrófilos podem migrar para longe do local da lesão e, potencialmente, causar danos a tecidos saudáveis. Uma limitação do presente dispositivoed neste trabalho é que o enriquecimento de células no dispositivo não é possível e, portanto, a contagem de células dependem da proporção em que eles são encontrados no sangue total nativa. Isto pode apresentar problemas na aquisição de medições de quimiotaxia de um número significativo de células em condições tais como a neutropenia, em que a contagem de neutrófilos é baixa. Outro problema potencial no nosso dispositivo é o impedimento estérico da migração de células de glóbulos vermelhos ou outras células migratórias simultaneamente. Em nossos experimentos, os neutrófilos pode espremer hemácias últimos presos nas voltas da filtração pente RBC sem alterar sua velocidade de migração. Além disso, a concentração de quimioatraente e potência é extremamente importante na indução de migração celular. Para solucionar o ensaio com outras condições, pode ser importante para executar curvas de dose-resposta com diferentes magnitudes de quimioatractor. Manuseio e processamento chemoattractants mais instáveis ​​como mediadores lipídicos também é fundamental, por isso é importante para os dispositivos de primeira linhaimediatamente antes da WB carregamento. Finalmente, também é crítico que o sangue não coagula antes de purgar o dispositivo de WB. Se não é possível executar o ensaio imediatamente após a recolha de sangue arterial deve ser armazenado em um balancim em heparina. O carregamento de amostra deve ser feito lentamente, com cuidado para não introduzir uma pressão excessiva no dispositivo WB.

No futuro, o dispositivo pode ser usado para medir as perturbações da função dos neutrófilos, em queimadura ou pacientes de trauma sem remover os neutrófilos a partir de soro nativo do paciente, que, provavelmente, desempenha um papel-chave na disfunção de neutrófilos 17. Este dispositivo também pode ser utilizado no futuro para rastrear potenciais agentes terapêuticos pró-resolução para restaurar a função dos neutrófilos normais nestes doentes. Finalmente, este dispositivo pode ser ainda mais manipulada para medir a quimiotaxia de outras células migratórias tais como monócitos, macrófagos e células-T.

Em conclusão, temos desenvolvido um Novel método para medir a quimiotaxia de neutrófilos directamente a partir de uma gota de sangue total. A incorporação de todo o dispositivo de microfluidos de sangue em um de 12 ou 24 poços placa facilita o rastreio de várias condições em simultâneo. Este dispositivo irá facilitar o desenvolvimento de mediadores de resolução da inflamação para o tratamento de queimaduras e outras condições inflamatórias. No futuro, este dispositivo irá ser utilizado para medir a perturbações na função quimiotáctico de neutrófilos ao longo do tempo em amostras de pacientes e de modelos de murino, onde o volume da amostra é limitada.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse de divulgar.

Acknowledgements

O apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (concede GM092804, DE019938) e Shriners Hospital Queimaduras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Fabrication
SU-8 Microchem Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides Fisher Scientific 125495 1 X 3 inches
Glass-bottom plate MatTek P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm Ted Pella, Inc. 15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm Ted Pella, Inc. 15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip Fisher Scientific 02-707-139
Syringe Fisher Scientfic 309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in. Brico Medical Supply BN3005
Vacutainer, Heparin Becton Dickinson
HBSS Sigma-Aldrich
Human serum albumin Sigma-Aldrich A5843-5G 0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895-1MG
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G SLN240
Hoescht stain Life Technologies H3570
Positive Control
HetaSep STEMCELL Technologies Inc. 7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies Inc. 19257
Plasma Asher March Instruments P-250
Lindberg/Blue M Oven Thermo Scientific 13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers Techni Tool 758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator Fisher Scientific 08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate Alpha Multiservices PMC 720
Nikon TiE inverted microscope Nikon - Micro Video Instruments Inc. MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective Nikon - Micro Video Instruments Inc. MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon Nikon - Micro Video Instruments Inc. 500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters Chroma - Micro Video Instruments Inc. 31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels Qimaging - Micro Video Instruments Inc. RET-2000R-F-M-12-C

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References

  1. Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
  2. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  3. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
  4. Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
  5. De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
  6. Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
  7. Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
  8. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
  9. Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
  10. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
  11. Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
  12. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
  13. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
  14. Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. 0, 1-9 (2013).
  15. Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. (2013).
  16. Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
  17. Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).

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