该ChroP方法结合芯片和质谱剖析染色质的基因座特异性蛋白质组学风景

Biology

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Summary

通过结合本地和交联染色质免疫沉淀高分辨率质谱,ChroP方法使解剖的组蛋白修饰,变体和非histonic协同作用的蛋白质在功能上不同的染色质域的复合蛋白质结构。

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Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

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Abstract

染色质是一种高动态核蛋白复合物由DNA和蛋白质,其控制各个DNA依赖性过程。在特定区域的染色质结构和功能是由组蛋白的翻译后修饰(hPTMs)和变体,染色质结合蛋白,包括转录因子,和DNA甲基化的局部富集调节。染色组合物中的不同的功能区的蛋白质组分析的方法已经被缺乏有效的协议,以丰富这些域在适当的纯度和量为后续的深入分析物的质谱(MS)到目前为止妨碍。我们在这里介绍了新设计的染色质蛋白组学策略,命名ChroP(CHRO晨报P roteomics),由此制备型染色质免疫沉淀是用来隔离不同的染色质区域,其特征在hPTMs方面,变体和共同相关联的非histonic蛋白质,是通过MS进行分析。我们说明他重新ChroP的转录沉默的异染色质区域的富集和分析,其标志是三甲基化的组蛋白H3赖氨酸9的存在成立。所取得的结果证明ChroP在彻底表征异蛋白质组,并证明它作为理解如何染色质的独特的蛋白质决定簇相互作用和协同效应,建立基因座的特定结构和功能结构的有力的分析策略的潜力。

Introduction

染色质是涉及为所有的DNA介导的过程主模板一个高度动态的核蛋白复合物。核小体是染色质的基本重复单元和由含各规范组蛋白H2A,H2B,H3和H4,在其周围147 bp的DNA被包裹1,2两分子的蛋白质八聚体核心的。所有核心组蛋白的结构为球状结构域和一个灵活的N端“尾巴”突出了核小体之外。一种用于调节染色质结构和动力学的主要机制是基于共价键的翻译后修饰(翻译后修饰),其主要发生在N-末端组蛋白3,4。组蛋白修饰可以通过改变高阶染色质结构,通过改变之间的组蛋白-DNA或核小体之间的接触,并从而控制DNA结合蛋白( 机制)的可访问功能,或通过作为dockin克位点的调节蛋白,无论是作为单个单元,或者嵌入在多聚体复合物。这样调节蛋白可以发挥它们的功能以不同的方式:通过直接调节基因表达( TAF蛋白),或通过改变核小体定位( 染色质重塑复合物),或者通过修改其他组蛋白残基( 蛋白质具有甲基转移或乙酰基转移酶活性)( 反式机制)5。观察到在某些具体的染色质基因座不同的PTM模式群集导致了阐述这一假设在不同地点的不同修饰可协同作用以生成分子编码介导相关的DNA的功能状态。在“组蛋白密码假说”已经获得了很大的共识在多年,但它的实验验证已受困于技术限制6,7。

质谱(MS)为基础的蛋白质组学已成为一个功能强大的工具来映射组蛋白修饰模式和表征染色质结合蛋白8。 MS检测的变形作为肽的实验和理论质量之间的特定Δmass。在个人组蛋白的水平,微软提供了一个公正和全面的方法来映射翻译后修饰,允许其中9-14新的修改和揭示interplays的检测。

在最近几年,已经开发了多种策略来剖析染色质的蛋白质组合物,包括完整的有丝分裂染色体15,可溶性HPTM结合蛋白16-18的标识和特定染色质区域的分离和分析的表征( 端粒)19,20。然而,组蛋白翻译后修饰,变体和染色质相关蛋白之间的位点特异性的协同作用的研究仍然是不完整。在这里,我们描述了一种新的方法,命名为ChroP(染色体晨报P roteomics)21,我们已经开发了能够有效表征功能不同的染色质域。这种方法适应染色质免疫沉淀技术(ChIP),在表观遗传学研究中使用一套行之有效的方案,为充实样品的有效质谱为基础的蛋白质组学分析。我们已经开发出两种不同的协议,这取决于所用的输入和由MS处理的问题染色质的类型;具体为:1)芯片消化MNase不固定本地染色质是用来净化单核和解剖合作关联hPTMs(N-ChroP); 2)交联染色质碎片通过超声处理芯片采用的是与SILAC为主interactomics策略来描述所有共同丰富的染色质结合蛋白(X-ChroP)的组合。我们举例说明这里的N-和X-ChroP的丰富和研究异,采用H3K9me3为诱饵进行免疫沉淀步骤的结合。使用ChroP的可扩展研究无论是不同的区域染色质上,或变化过渡到一个不同的功能状态,在同一区域内的染色质组成,从而铺平了道路表观遗传学中的各种应用。

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Protocol

1,细胞培养

  1. 标准介质本土芯片
    1. 生长在补充有10%胎牛血清(FBS),1%谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素和10mM HEPES pH为7.5的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)的HeLa细胞。
  2. 交联沉淀SILAC标记
    1. 生长的HeLa细胞中SILAC DMEM培养基中,贫化赖氨酸和精氨酸的,补充有10%透析过的FBS,1%谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素,10mM的HEPES pH为7.5和任一的光L-赖氨酸(Lys 0)和L-精氨酸(精氨酸0)或它们的重对应,L-赖氨酸(Lys 8)和L-精氨酸(精氨酸10)( 材料表),在终浓度为73毫克/升和42毫克/升,分别为。
    2. 细胞生长长达八代在SILAC培养基中,以确保完整的同位素编码的氨基酸掺入。通过细胞每两天,当它们达到1.0-1.5×10 6细胞/ ml的密度,在交流播种它们oncentration的3×10 5个细胞/ ml。
    3. 评估细胞生长和生存力在SILAC到中个体化从生理学会导致从SILAC培养基的组合物较差,任何可能的变更;要做到这一点:
      1. 目视检查细胞的标记在每天形貌的显微镜。
      2. 计数细胞SILAC成长与标准介质的细胞和情节的生长曲线。

2,本机染色质免疫沉淀(N-CHIP)

  1. 从培养细胞的细胞核的准备
    1. 用1-2×10 8个未标记的HeLaS3每个实验的细胞。收获细胞,进行50×10 6个细胞的等分试样在50毫升管中并离心分离,在340×g离心10分钟,在4℃,用冰冷的PBS冲洗。
    2. 每个重悬细胞沉淀于8ml裂解缓冲液( 表1)并孵育10分钟,在4℃下在旋转的轮子。倒入约在蔗糖垫( 表1)和离心机的水平转子,在3,270 xg离心20分钟,在4℃下,以细胞核从细胞质分离refully每个细胞裂解液。
    3. 弃上清,保持核颗粒和在冰冷的PBS洗两次他们通过离心,弃上清在每次洗涤。
  2. 微球菌核酸酶(MNase)消化(小规模)和染色质消化后的质量控制
    1. 重新悬浮于1ml的消化缓冲液( 表1)中洗涤沉淀的核;划分于500μl两等份,并保持在冰上。
    2. 测量的光密度(OD)在等分试样的260纳米,0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)稀释1:200 :OD = 1对应于染色质的DNA的大约50微克/毫升。通常情况下,从2×10 8个细胞开始,OD是在40-60的范围内。
    3. 取核的1%,加MNase酶为0的最终浓度。酶ü005 /微升核和孵化在37℃不同时间流逝(0,10,20,40,60分钟)。
    4. 在每个时间点,收集4微升消化原子核,并添加1毫米EDTA停止MNase反应。置于冰上。
    5. 提取的DNA样品进行PCR纯化试剂盒以及它们洗脱在50μl的TE缓冲液( 表1)。
    6. 取20微升的每个DNA样品,加入10微升缓冲液中( 表1),并装载样品在1%(重量/体积)含溴化乙锭,用PCR标记的大小控制的琼脂糖凝胶。
    7. 检查消化评估由MNase孵化生产的染色质核小体的阶梯。
    8. 选择用于消化的最佳时间的基础上,单核小体在制备的患病率。通常情况下酶/微升核MNase消化的最佳时间是60分钟( 图1B,左图 )的0.005ü :digesti的最佳MNase浓度/时间上可能取决于所需的细胞类型和对核小体拉伸的大小来调节。
  3. Large-scale/preparative MNase消化和可溶性染色质馏分回收
    1. 加至每个等分试样(参见2.2.1)5微升MNase,对应的酶/微升晶核0.005 U A的最终浓度;轻轻混匀,并在37℃下进行60分钟(或一般的用于优化的时间间隔,基于小规模试验)。
    2. 加入1毫摩尔EDTA以终止反应并保持在冰上。通过离心沉淀消化的原子核在7800×g离心4℃10分钟。转移上清液(级分S1),在一个新的管并储存于4℃ 注:S1中包含染色质的第一可溶性组分,其包括单核小体。加入蛋白酶抑制剂( 表1)。
    3. 1毫升透析缓冲液( 表1)仔细悬浮颗粒和透析过夜,4°C(CUT斯达康关闭透析管为3.5 kDa的),在3升透析缓冲液,用恒定的轻微搅拌。收集透析材料和离心机在7800×g离心10分钟,在4°C。转移上清液(S2分数)在一个新的Eppendorf管中并储存于4℃ 注:S2包括二至EPTA-核小体,取决于MNase消化程度。
  4. 免疫染色前的质量控制
    1. 采取相应的等分试样以5微克S1和S2染色质级分(通过测量OD 260nm处的的NanoDrop系统定量)。用PCR纯化试剂盒提取DNA并洗脱在50μl的TE缓冲液( 表1)。
    2. 取20微升S1和S2的DNA,用10微升上样缓冲液( 表1)混合,并将它们加载于1%(W / V)琼脂糖凝胶。检查的质量和MNase消化由核小体阶梯目视检查的效率注:分数S1是高度富含单核,而组分S2主要含有聚核小体( 图1B,右图 )。
  5. 染色质与抗体的孵育
    1. 储存在-20℃下50微升中一小部分用于后续的质谱分析。
    2. 加入1倍体积的ChIP稀释液( 表1),以分数S1。
    3. 添加对感兴趣的HPTM(或蛋白质)的抗体;孵育过夜上的旋转轮在4℃ 注意:通常情况下,使用抗体的10微克至20微克为2×10 8个细胞。抗体的量与起始细胞数目之间的最佳比例必须仔细设置个别情况,这取决于所用的样品内的诱饵HPTM /蛋白质的丰度和对抗体的效率。优化是实验性的基础上,进行下列测试:
      1. 比较的输入和流过(FT之间的利益HPTM /蛋白质的量,见2.7.2)通过Western印迹或质谱来验证该免疫沉淀富集的特定的染色质区域的显著比例注:这通常是实现当HPTM /蛋白诱饵的至少50%被耗尽在FT( 图1C)
      2. 查所感兴趣的蛋白进行免疫沉淀检测的是在SDS-PAGE凝胶,这确保了材料的足够量的可用于MS的分析注:在对应于四个核心组蛋白在正确的化学计量比的条带的凝胶的存在表明完整的核小体被免疫沉淀的由N-ChroP( 图1D)。缺乏适当的化学计量的,其实是反映一个部分中断/展开的​​核小体组成。
    4. 同时,准备了G蛋白偶联磁珠(见2.6)。
  6. 平衡和阻塞的G蛋白偶联磁珠
  7. 平衡100微升蛋白G-偶联的磁珠浆料在封闭液( 表1),洗涤三次,并过夜温育它们在4℃下在旋转的轮子注:以下的小珠的结合能力,使用100微升浆料供2-20微克抗体。
  8. 用封闭液,然后两次带芯片稀释液( 表1)洗一次封锁的珠子。
  • 染色质的使用磁珠分离
    1. 加入100微升的封闭的珠至S1染色质样品孵育它们在旋转的轮在4℃下3小时。离心机在340×g离心1分钟以从技巧的盖降速样品。放在一个磁架沉淀的珠子。
    2. 将上清转移到一个新的Eppendorf管中。这是流过(FT),染色质即分数未结合的抗体。
    3. 洗珠4次洗涤缓冲液( 表1)在每次洗涤(75,125和175 mM氯化钠)增加盐的浓度。
    4. 以洗脱免疫染色,孵育在30微升LDS样品缓冲液中,在70℃下补充有50mM的二硫苏糖醇(DTT)的5分钟的珠分离洗脱的蛋白质在4-12%的Bis-Tris丙烯酰胺的SDS-PAGE预制梯度凝胶染色和用胶体考马斯亮蓝染色试剂盒( 图1D)的凝胶。
  • 3,交联染色质免疫沉淀(X片)

    1. 细胞与甲醛的交联
      1. 添加0.75%的甲醛以SILAC标记的细胞,短暂混合后,于室温下10分钟。通过加入125mM的甘氨酸淬灭甲醛孵育5分钟,在室温下进行。
      2. 分化的细胞以5×10 7个等分试样;冲洗他们三次,用冰冷的PBS通过离心在430×g离心5分钟,在4℃,并在每次洗涤后弃去上清液。在最后一次洗涤,弃去上清液,并保留沉淀。注意:一旦细胞是交联的,可以将它们存储于-80℃,如果不是立即使用。
    2. 原子核的准备
      1. 每个重悬细胞沉淀在10ml裂解缓冲液( 表1)。孵育10分钟,在4℃下用旋转。离心机在430×g离心5分钟,在4℃下弃上清液;保持核颗粒。
      2. 重悬的每个核沉淀在10ml洗涤缓冲液( 表1)。在室温下孵育,以一个旋转的轮子10分钟。
      3. 离心机在430×g离心5分钟,在4℃下弃上清液,收集颗粒。
      4. 每个重悬核颗粒在3毫升沉淀孵育缓冲液( 表1)。置于冰上。
    3. 染色质超声和质量控制
      1. 超声通道。romatin在200瓦(30秒的“开”和1分钟“关”周期),在冷却的Bioruptor,将其分解质 :循环和超声处理的时间间隔的数目依赖于细胞类型和核小体的平均长度舒展理想。典型地,超声处理30分钟是必要的,以产生300-500碱基对长度的DNA片段,对应二 - 和三 - 核小体。片段大小的选择取决于染色质结构域的受调查的类型。
      2. 取总输入的2%,由孵化反向交联,在65℃下至少1小时的沉淀孵育缓冲液中。通过PCR纯化试剂盒提取DNA,洗脱在50μlTE缓冲液,并载入DNA琼脂糖凝胶上检查染色质碎片。
    4. 染色质与抗体的孵育
      1. 加1/10体积的10%的Triton X-100的超声处理的染色质。 12,000×g离心,在4℃下10分钟沉淀德业务收益指数。
      2. 除50微升染色输入从繁重的细胞,用于测试的SILAC氨基酸掺入水平标记的细胞和蛋白质分析。
      3. 选择的抗体添加到剩余的重链和轻标记的超声处理的染色质和孵育过夜,在4℃在旋转轮。在光通道,还添加了可溶性肽的过量倍。孵育过夜,在4℃下在旋转的轮子注:抗体的微克和细胞的起始材料之间的最佳条件的选择的情况下通过的情况下,如在2.5.3中讨论。在相对于所述抗体的可溶性肽的最佳过量倍摩尔浓度必须通过的情况下小心地滴定的情况。
    5. 染色质的使用磁珠分离
      1. 平衡,并按照2.6中所述的步骤,并采用芯片孵育缓冲液阻断G蛋白偶联的磁珠。
      2. 加入100μl阻断乙EADS到染色质的样品,孵育在4℃旋转轮3小时离心机在340×g离心1分钟以从技巧的盖降速样品。放在一个磁架沉淀的珠子。上清液通过(FT)的流量,含有未结合核小体。洗涤珠子4次洗涤缓冲液( 表1)而增加的盐浓度(2次洗涤在150mM和2,在300 mM氯化钠)。
      3. 在95℃下温育珠中加入30μlSDS-PAGE上样样品缓冲液( 表1)和25分钟到两个洗脱和去交联的免疫沉淀的蛋白质。分离蛋白质的4-12%的Bis-Tris丙烯酰胺的SDS-PAGE预制凝胶( 图3D)。

    4,样品制备之前的MS

    1. 在凝胶组蛋白由N-CHIP丰富的消化
      注意:在蛋白质的消化和肽的提取步骤照顾以减少角蛋白污染,与LC-MS/MS干扰,如前所述22,23。
      1. 对应于该核心组蛋白条带( 图1D)剪切凝胶切片。去色斑的凝胶片,用50%乙腈(ACN)在DDH 2 O,用100%乙腈交替收缩凝胶。重复直至凝胶块完全去染色,干他们在真空离心机。
      2. 加入D 6-乙酸酐1点09(体积/体积)中的1M碳酸氢铵(NH 4 HCO 3)(典型的最终体积是60-100微升)和3微升醋酸钠(CH 3 COONa),为催化剂。孵育3小时,在37℃强烈震动 :样品可能会产生的第一分钟气泡反应的组装后:它重要的是要谨慎处理和释放产生的气体,开盘时的管在孵化。
      3. 冲洗凝胶块数倍数w第i个NH 4 HCO 3,替代用ACN的比例增加(从50%到100%),以完全消除署署长6 -乙酸酐残留物。
      4. 收缩的凝胶片在100%ACN;干他们在真空离心机,以确保完全的脱水。再水合凝胶片,用冰冷的100纳克/微升的50mM NH 4 HCO 3的胰蛋白酶溶液并孵育过夜,37℃ :在使用氘代乙酸酐和胰蛋白酶消化赖氨酸的化学修饰的组合,生成一个“ARG- C相似的“在组蛋白21,24的凝胶消化模式。
      5. 丢弃过量的溶液和50mM的NH 4 HCO 3的体积加至完全覆盖凝胶块;孵育过夜,在37°C
      6. 收集可溶性消化的肽在一个新的Eppendorf管中。冻干肽。重悬它们在0.5%乙酸acid/0.1%三氟乙酸(TFA)。脱盐和浓缩肽在反相上手工制作的微柱-C 18 /碳“夹心”和离子交换色谱(SCX)(StageTip)25。
      7. 通过把含有固定-C 18 /炭(“三明治”)和SCX珠在200微升提示铁氟龙网状磁盘准备StageTip微柱。获得“三明治”通过装有活性炭滤芯第二尖的顶部加载了C 18微柱注:在很短肽,未保留在C 18的过滤器,通过在直接加载在流通碳提示,通常捕获它们。 SCX StageTips可以丰富具体的肽,例如H 3(3-8)肽,而不是通过反相色谱法有效地保留。
      8. 负载肽的50%到了C 18 /炭“三明治StageTip”,50%到SCX StageTips。使用80%ACN/0.5%醋酸交流了C 18 /炭提示他们洗脱id和从SCX提示,用5%氢氧化铵(NH 4 OH)/ 30%甲醇中。冷冻干燥后,重悬肽在0.1%FA和用LC-MS/MS分析。
    2. 胶内消化免疫纯化的蛋白质
      凝胶内消化的蛋白质进行如前所述的22,有轻微的修改。
      1. 切10片( 图3D)每个车道和1毫米3个小立方体每个切片。去色斑的凝胶片,用50mM NH 4 HCO-3/50%乙醇,并加入无水乙醇收缩凝胶。重复,直到凝胶完全去染。
      2. 添加还原缓冲液( 表1)的凝胶片1小时,在56℃,随后在室温下45分钟,加入烷基化缓冲液( 表1),在黑暗中。在真空离心洗干净并擦干凝胶块。
      3. 再水合的凝胶片,用冰冷的12.5毫微克/微升胰蛋白酶溶胶ution在50毫米的NH 4 HCO 3和在冰上孵育直至凝胶块完全补液。在去除多余的胰蛋白酶。
      4. 添加50mM的NH 4 HCO 3以完全覆盖凝胶片。孵育过夜,在37°C。
      5. 收集的液体部分。提取缓冲液( 表1)添加到该凝胶块;孵育在强力搅拌下,在室温下10分钟。重复两次。
      6. 孵育凝胶片在乙腈10分钟,在强力搅拌。重复两次,汇聚各上清液。
      7. 冻干肽。重悬干燥的肽在0.5%乙酸acid/0.1%TFA。
      8. 脱盐和浓缩的肽在反相C 18的StageTip,如所述26,27。
      9. 从C 18 StageTip用80%ACN/0.5%醋酸洗脱肽。通过在真空离心机蒸发除去有机溶剂和悬浮的肽在0.1%甲酸(通常为5-10及#181,L),当准备将MS分析。

    5,LC-MS分析

    1. 液相色谱分析
      1. 装在15厘米的石英发射器(75微米内径350微米外径)分析柱,使用反相(RP):C 18,在甲醇中为3μm树脂,在一个恒定的氦压力(50巴),使用炸弹装载装置,如前面描述的28。
      2. 耦合装发射器(C 18反相柱)直接连接到HPLC上的6端口阀通过一个20厘米长(25微米内径)的出口熔融二氧化硅不使用预柱或分流装置。
      3. 加载用C 18反相柱的消化肽在流量500升/分钟流动相A(0.1%FA / 5%乙腈在DDH 2 O)的。
      4. 样品装载之后,使用以下梯度分离的肽:
        1. 适用0-40%流动相B(0.1%FA/99%ACN在DDH 2 O),在250升/分钟以上90分钟,然后40-60%的梯度在10分钟和60〜80%在5分钟内,肽从组蛋白衍生的洗脱(参见图2)。
        2. 应用0-36%流动相B,在250升/分钟以上120分钟,随后的36-60%梯度,10分钟和60〜80%在5分钟内,肽从免疫纯化蛋白质衍生的洗脱(参见图3)。
    2. 使用LTQ-FT-ICR-超质谱质谱分析
      1. 工作在数据依赖采集(DDA)模式,以MS和MSMS收购之间自动切换。 MS全扫描谱从200-1,650获得的,通常是在m / z范围中,获取与分辨率R = 100,000,400 M / Z。五(初到)最强的离子使用的是碰撞诱导解离(CID)在目标值5000隔离碎片的线性离子阱。
      2. 使用表2 FO列出的参数r中的“调整”收购文件。
      3. 定的标准采集设置,如表2所列。

    6,数据分析

    1. 标记的组蛋白修饰共同富含染色质结构域自由量化
      1. 所采集的原始文件转换为使用Raw2msm软件(1.10版)29 MGF文件。
      2. 搜索用吉祥物守护进程(2.2.2版本),设置在表3中所述的参数组蛋白修饰。
      3. 在吉祥物输出肽列表,删除肽得分低于15或超过5假定的翻译后修饰29 注:对于每一个单一的肽的ID,选择具有最高的吉祥物得分的肽,并过滤掉所有其他多余的肽相同的ID 。
      4. 构建提取离子色谱图(XIC)对应于每一个修饰肽前体每一个,BAS版上的m / z值,使用QualBrowser。计算出的曲线(AUC)为每个峰( 图2A)下的面积。
      5. 验证包含使用QualBrowser( 图2B)的MS / MS谱的目视检查修改每个所识别的肽。
      6. 计算的相对丰度为每个修饰肽。计算在所述芯片编材料的每个修改的相对富集注:相对丰度被计算为超过AUC的相同肽的所有修饰和未修饰形式的总和每个特定修饰的肽的AUC之间的比率,而相对富集在该芯片在输入( 图2C)的特异性修饰的相对丰度的比值。
    2. 蛋白质的定量蛋白质组学分析合作相关的染色质域之内
      1. 对于蛋白质鉴定和定量使用MaxQuant包上(http://www。maxquant.org /)30。配置内置的搜索引擎“仙女座”使用AndromedaConfig.exe 31和设置在表3中列出的搜索参数。
    3. 掺入 ​​试验
      1. 估计重氨基酸掺入程度分为重标记的染色质蛋白的输入,使用MaxQuant软件,如下所示:
        1. 设置在6.2描述,但禁用重新量化选项的参数。
        2. 计算比例掺入采用以下公式来非冗余肽比率: 注册(%)=比(H / L)/比(H / L)+ 1×100( 图3B)注:只接受,如果掺入> 95 %。

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    Representative Results

    染色质免疫沉淀法是用于分析沿基因组中的蛋白或组蛋白修饰的定位一个强大的技术。在蛋白质组学当量,芯片随后基于MS的蛋白质组学识别定性和定量的hPTMs,组蛋白变体与染色质结合蛋白是与感兴趣的修饰或蛋白免疫沉淀一起,作为“诱饵”。在N-ChroP方法中,在图1A中,原生芯片,其中染色质消化MNase( 图1B)所述,作为输入到从散装染色质独特的功能域净化。消化染色质富集的单核小体孵育与特定的抗体和免疫纯化的蛋白通过SDS-PAGE分离。在所示的示例中,H3K9me3,沉默染色质32,33的标记物,用于建立的方法。该选择是基于这样的事实,既其功能作用以及它的一些蛋白相互作用物有很好的描述。此外,对于芯片优化的高度特异性和高效抗体可用34一样,也证实了通过视觉检查的考马斯凝胶,其中所述完整的核小体,与核心组蛋白的正确化学计量比,富集了适当量的MS( 图1D )。

    H3K9me3的存在于流过(FT)和输入(IN)的量之间的比较表明,约50%的感兴趣区域的被免疫纯化,但不包括由于一个小亚群的富集一个偏差的风险染色质( 图1C)。 MS被用来在翻译后修饰特征共同相关联的富集核内:每个核心组蛋白是利用设计的协议特设为了实现一个“的Arg-C,如”消化,在聚丙烯酰胺凝胶中消化。事实上,一方面的Arg-C是用于hPTMs b MS分析的最佳蛋白酶ecause它产生最佳长度的肽;在另一方面,它不能有效地在凝胶切割。为了克服这种限制,我们的定制协议利用赖氨酸的化学烷基化孵育组蛋白凝胶条带氘(D 6) -乙酸酐,随后胰蛋白酶消化来实现。由于胰蛋白酶不切割Ð3-乙酰化赖氨酸,由此产生的肽混合物,可模拟“的Arg-C状”图案( 图1E)。

    加入A D 3-乙酰基部分的赖氨酸生产的45.0294道尔顿一个明确的增量肿块,在MS本土和化学添加乙酰化区分。此外,D 3 -乙酰化提供了便利同量异位素修饰的肽的辨别两个额外的优点:第一,烷基化反应只发生于未修饰的和单甲基化的赖氨酸,但不能在二和三甲基化的残基;因为这样的修饰肽轴承相同TOT人多的修改,但在不同的安排差异是由不同的集合,产生明确的M / Z转变ð3 -乙酰基装饰。其次,不同的教育署署长3-烷基化模式导致略有不同的保留时间在反相柱,它产生分离的等压修饰肽21的附加 ​​级别的液相色谱法。

    所有hPTMs由相应的MS / MS谱( 图2B)的人工检验的验证后,标签自由量化是在两个步骤实现:首先,我们计算每个修改的相对丰度使用未改性的和改性物种的信号强度为相应的肽,通过提取离子色谱图(XIC)的计算( 图2A和2C所示,上部面板 )进行测定;第二,相对富集被估计为每改性中的相对丰度之间的比率N的芯片编八聚体,并从输入端( 图2C,下图)对应的相对丰度。在H3的分析(9-17)肽展示二-和三甲基化的K9的富集,与未修饰的和单甲基化形式( 图2C)的相应损耗。与此结果作为阳性对照抗体的特异性,共同关联或所有其他的修改耗尽可以评估,无论是在对同一H3帧内分子水平和在分子间的电平,对于其他共同富集的组蛋白同样的核小体。这允许hPTMs的H3K9me3域内交叉会谈的筛选,即所谓的“异modificome”( 图2D):与基因沉默相关的已知标记物的显著富集,与基因活化连锁的标记的相应耗尽观察。此外,新的关联性检测,如H3K18m的富集E1。

    用于筛选的所有蛋白质共同关联于异,经典的交联芯片结合SILAC(稳定同位素标签由氨基酸在细胞培养)( 图3A)。在SILAC实验中,赖氨酸和精氨酸(光形式)中培养用培养基替换为它们的同位素标记的类似物(重形式)。后在轻型和重型培养基中生长和复制的细胞中,这两个差分同位素编码的氨基酸代谢掺入蛋白质,产生,轻重形式的蛋白质分别是可区分的经MS,由于特定的Δmass。开始大规模的SILAC实验之前,标记效率进行评价,计算掺入水平,测定重肽的百分比馏分与重链和轻的总和,唯一重标记的样品中找到。掺入优于95%为重精氨酸和他阿维赖氨酸需要精确的蛋白质定量( 图3B)。重链和轻细胞的交联后,染色是通过超声处理分散。 SILAC是使用可溶性H3肽(QTARĶSTGG)过量倍事关K9三甲基化,以便从背景区别特定H3K9me3交互件用于与竞争试验联合使用。可溶性肽过量加入到2 SILAC的ChIP实验,它浸透了抗体的结合能力,因而“竞争出”多数的H3K9me3-核小体,因此,所有的特定交互件之一。在其他SILAC通道,竞争肽不被添加到该芯片和免疫沉淀发生正常。 SILAC竞争实验中通常进行一式两份在所谓的“正向”和“反向”的格式,其中用过量的可溶性肽的竞争从日切换Ë重(H)的光(L)的染色质样品。这导致倒互补SILAC比率读数,用于从非特异性结合剂挑剔正品:富含特别是蛋白质在实验用的光的形式(蛋白比H / L> 1)的比较与目前在重形式强度较高,其中多余的肽被加入到光信道(正向)( 图4A,上图 );相反的趋势(蛋白质比H / L <1)中的反向复本( 图4A,下面板 )被观察到。蛋白质,其强度在重型和轻型的形式是类似的正向和反向的实验产生一个恒定的比率接近1,并归类为背景( 图4B)。

    最佳的过量倍的可溶性肽的选择是重要的,必须精确地调谐。通常情况下,我们设置进行竞争分析USI正确的抗体对肽的比例纳克过量的肽的连续稀释液和对照“诱饵”阳性对照芯片之间(HPTM /蛋白质),其中所述肽不被添加,而不同的序列竞争的芯片,通过蛋白质印迹或MS的电平。通常,最佳的过量折叠肽的约90%降低HPTM /蛋白在免疫沉淀的物质的量。事实上,一方面,较大得到的蛋白质比,较高的SILAC的鉴别力;另一方面,过大的饱和的肽可以驱逐完全从抗体的特异性结合,从而导致缺少量化和统计分析的H / L的比率。对于H3K9me3抗体,我们定义了正确的比例通过测量H / L比值为QTARK(ME3)STGG肽,在竞争试验中远期进行设置,我们把这个值作为竞争的效率( 图3C措施)。

    正向一个的交集d倒退X片实验导致的635蛋白,存在于两个实验和量化与至少2比计数的鉴定。日志2情节的H / L的比率代表了所谓的“heterochromatome”( 图4C),其中真正的H3K9me3交互件被明确地认定为内前40%的蛋白质比分布(右上象限中存在的蛋白质散点图和图4D)。

    图1
    图1:在N-ChroP工作流程本土芯片结合质谱分析 )计划的示意图 。从细胞中染色质的消化MNase和富含单核小体(S1)的馏分用抗-H3免疫沉淀K9me3抗体。免疫纯化的蛋白通过SDS-PAGE分离和核心组蛋白是在凝胶消化特设协议来模仿的Arg-C消化。肽由nano-LC-MS/MS分析。组蛋白的翻译后修饰被确定,通过MS / MS谱图人工检查验证和定量B)的小规模试验MNase:DNA解析关于染色质消化MNase在不同的时间间隔(左图)后,在1%琼脂糖凝胶;大型MNase消化:DNA解析在1%琼脂糖凝胶60分钟后MNase染色质消化和S1组分分离后,含S2派单核小体,含聚核小体(右图)富集C)估算/未改性的枯竭,单 - ,二 - ,和在流过三甲基K9(FT)相比,输入端(IN)。直方图表示平均±标准误差从每个修改D)的SDS-PAGE染色输入和共免疫三次独立实验纯化的蛋白:核心组蛋白H3,H4,H2A和H2B是可见的周围和下方的17kDa带,H3和H2B共迁移(黑色正方形)E)从两个核小体免疫沉淀和输入每个核心组蛋白是化学烷基化使用氘化(。 D 6) -乙酸酐胰蛋白酶处理,以得到一个“的Arg-C,如”在凝胶消化之前。在D 6-乙酸酐反应与未修饰的和单甲基化的赖氨酸的ε氨基,但不与二甲基,三甲基化和乙酰化的赖氨酸。作为结果,胰蛋白酶的酶活性被阻止在所有天然和化学乙酰化赖氨酸,从而产生一个“的Arg-C,如”消化图案。这个数字已经被修改21,使用图1,图S1和图S5作为参考。 点击这里查看大图。

    “FO:保持together.within页=”总是“> 图2
    图2:在H3K9me3“modificome”A在相应的m / z值构造质谱分析 )缩放质谱和提取离子色谱图(XIC)2 +充电未修改,单,双和三甲基化K9在H3(9-17)肽,都为输入和芯片样品B)代表的MS / MS谱使用CID碎片。的b离子和y离子系列允许定义H3的(9-17)肽序列和本地化专门对K9的残留物。C三甲基化)的不同程度的甲基化对K9在H3的相对丰度( 9-17)肽,通过用对应于所有区域的总和每个修饰的肽的曲线(AUC)下,将该区域估计观察unmodifi编辑和修饰形式的肽,在输入和芯片版八聚体。直方图表示从每个修改(上图)3次独立实验的平均值±SEM表示。 K9甲基化的H3(9-17)肽的相对富集。富集表示为一个日志2比芯片版八聚体作为比较输入每个甲基化的相对丰度之间。直方图表示平均值±SEM来自三个独立实验(下图)。D)热图,概述识别的组蛋白H3,H4和H2A的所有共同相关联hPTMs的富集。每一行对应于一个不同的修改(次未检测到的修改)。这个数字已经被修改21,使用图1,图2,图3和图S10作为参考。 点击这里查看大图。


    图3:交联芯片,结合质谱分析的X ChroP工作流程A)计划的示意图 。在轻型和重型培养基中生长的细胞用甲醛固定和染色质输入通过超声碎片产生的DNA片段。在一个前向建立后,超声处理的重标记的染色是使用抗H3K9me3抗体而光标记的染色质保温与可溶性H3肽轴承K9me3过量折饱和的相同抗体进行免疫沉淀。来自重链和轻染色质免疫沉淀的蛋白质被汇集,提取并通过SDS-PAGE分离。 SILAC标记的蛋白质用胰蛋白酶消化和肽由nano-LC-MS/MS。 分析)效率监测计算重赖氨酸的掺入INE(Lys8)和精氨酸(Arg10)成蛋白质。在情节,赖氨酸和精氨酸肽密度分布的中值等于0.974(绿线)和0.964(红线),分别为C)的缩放质谱在的2 +充电三甲基化相应的m / z值K9在H3(9-17)肽,既为轻,重形式,输入和芯片版八聚体。而在输入的重和轻肽的强度是接近1,在正向SILAC芯片,光肽的强度比重对应的1低得多,从而表明一个有效的竞争D)的SDS-PAGE的光(L)和重(H)标记的免疫共沉淀材料的染色质和输入:对应于芯片版材料的车道被切成10片(黑线),而输入的只有两个条带被掺入测试分析(蓝线)。这个数字已经被修改21,使用图4和图六为重干扰。 点击这里查看大图。

    图4
    图4:H3K9me3“相互作用组”的质谱分析。 A)代表全谱显示对应于HP1肽和宏观2A蛋白SILAC对的:比值H / L> 1的正向实验(上图),通过比H / L <1的反向镜像副本(下图),表明这些蛋白在异的特定富集B)代表全光谱与SILAC配对对应于肽1的背景蛋白质:在正向H / L比率及反向重复等于1℃)量化蛋白质。是的distribut海关在根据自己的SILAC-比率,正向和反向试验(x和y轴,分别)的散点图;红色虚线表示的前40%,蛋白质的比例为30%,如图所示。从输入D)蛋白质的比例分布(H / L 1:1混合)(黑色),远期(蓝色)和反向(橙色)的X ChroP实验;红色虚线表示蛋白质的比例,设定为临界值,选择真正的交互者的前40%。这个数字已经被修改21,使用图5作为参考。 点击这里查看大图。

    缓冲段2 组成
    裂解缓冲液 10%蔗糖,0.5 mM的EGTA pH值8.0,15 mM氯化钠,60毫米氯化钾,15毫米的HEPES,0.5%的Triton,0.5 mM的PMSF,1mM的DTT,5毫米NAF,5毫米的Na 3 VO 4,5mM的NaButyrate,5毫克/毫升抑肽酶,5毫克/毫升胃蛋白酶抑制剂A,5毫克/毫升亮肽素
    蔗糖垫在20毫升裂解缓冲液2克蔗糖
    消化缓冲液的0.32M蔗糖,50mM的Tris-HCl pH值为7.6,4 mM的氯化镁,1mM的氯化钙,0.1mM的PMSF
    TE缓冲液的10mM的Tris-HCl pH为7.5,1mM EDTA中
    透析缓冲液的10mM的Tris-HCl pH值为7.6,1毫摩尔EDTA,0.5 mM的PMSF,5mM的NAF,5毫米的Na 3 VO 4,5mM的NaButyrate,蛋白酶抑制剂鸡尾酒
    沉淀稀释液 100毫米的Tris盐酸pH值7.6,100 mM氯化钠和10 mM的EDTA
    堵方案牛血清白蛋白0.5%在PBS中
    洗涤液 50毫米的Tris-HCl pH值7.6,10毫米EDTA
    蛋白酶抑制剂无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒,0.5mM的PMSF,5mM的NAF,5mM的四氧嘧啶,5mM的NaButyratË
    上样缓冲液橙色上样染料,50%(V / V)甘油中H20
    缓冲区第3条组成
    裂解缓冲液的50mM HEPES-KOH pH为7.5,140 mM氯化钠,1mM EDTA中,10%甘油,0.5%NP-40,0.25%的Triton-100,0.5mM的PMSF,5mM的NAF,5毫米的Na 3 VO 4,5mM的NaButyrate, 5毫克/毫升抑肽酶,5毫克/毫升胃蛋白酶抑制剂A,5毫克/毫升亮肽素
    洗涤液的10mM的Tris-HCl pH为8,200 mM氯化钠,1mM EDTA中,0.5mM的EGTA,0.5mM的PMSF,5mM的NAF,5毫米的Na 3 VO 4,5mM的NaButyrate,5毫克/毫升抑肽酶,5毫克/毫升胃酶抑素A ,5毫克/毫升亮肽素
    沉淀孵育缓冲液的10mM的Tris-HCl pH为8,100 mM氯化钠,1mM EDTA中,0.5mM的EGTA,0.1%脱氧胆酸钠,0.5%钠lauroylsarcoside,0.5mM的PMSF,5mM的NAF,5毫米的Na 3 VO 4,5mM的NaButyrate,5mg / ml的抑肽酶,5毫克/毫升胃蛋白酶抑制剂A,5毫克/毫升亮肽素
    洗涤缓冲液2 的20mM的Tris-HCl pH值为7.6,2毫摩尔EDTA,0.1%SDS,1%的Triton-100
    装载样品缓冲液 250mM的三 - 盐酸pH值为8.8,0.5Mβ-巯基乙醇,2%SDS
    缓冲区第4节组成
    烷基化缓冲区 55 mM的碘乙酰胺在50毫米的NH 4 HCO 3
    减少缓冲 10 mM的二硫苏糖醇在50毫米的NH 4 HCO 3
    提取缓冲液 30%乙腈和3%TFA在DDH 2 0

    表1。缓冲器组成。

    调整收购文件参数
    全场满SCAÑ 积累目标值1×10 6;最大充盈时间1,000毫秒
    IT级质谱积累目标值10×10 4;最大充盈时间150毫秒
    采集设置参数
    电电压 2.4千伏
    鞘和辅助气流
    离子传输毛细管温度 200°C
    排除动态高达500的母离子为60秒时MSMS
    排除质量宽度 10 ppm的
    使用宽带激活模式规范化碰撞能量 35%
    离子选择阈值 100计数
    激活q 0.25
    ACTIV时间通报BULLETIN 30毫秒

    表2 MS设置。

    Mascor守护进程搜索参数笔记
    数据库依赖于有机体( HeLa细胞:人类资料库,3.68版本; 87,061项)
    ARG-C 精氨酸-C裂开在所有的精氨酸残基的C-末端
    变量的修改乙酰基(K),氧化(M)中,D 3 -乙酰化(K),甲基-D 3 -乙酰基(K),二甲基(k)时,三甲基(K)的乙酰基[42.010达],抗氧化[15.995达],D3-乙酰化[45.0294达],甲基-D3-乙酰基[的14.016 Da和45.0294达总和],二甲基[28.031],三[42.046大]
    错过了分裂最多2个
    在搜索中母离子的质量精度 10 ppm的
    大众精度CID MSMS 0.5大
    MaxQuant搜索参数笔记
    数据库依赖于生物体
    胰蛋白酶/ P 胰蛋白酶切割的所有赖氨酸和精氨酸残基的C-末端。执行搜索服用在帐户的事实,胰蛋白酶的效率切割赖氨酸和当下一个氨基酸是脯氨酸(/ P)精氨酸降低。
    固定修饰 carbamidomethylation
    变量的修改 N-乙酰基(蛋白质),氧化(M)
    错过了分裂高达3
    Label参数 lys8和arg10
    最大标签amminoacid 3胰蛋白酶
    母体离子在初始“仙女”搜索质量精度 20 ppm的
    在主要的“仙女座”搜索母离子的质量精度 6 ppm的
    大众精度CID MSMS 0.5大(六上面峰per100大)
    肽错误发现率(FDR) 0.01
    蛋白质错误发现率(FDR) 0.01 肽和蛋白质的设置罗斯福到0.01意味着确定两种肽和蛋白质的预期包含误报1%。使用目标诱饵数据库估计这个值
    最大后ERROR概率(PEP) 1 PEP是一个单独的肽是一种假阳性匹配的概率。 PEP在你的设置等于1意味着所有的肽将采取不论人教版因而滤波在罗斯福完全基于。
    最小长度的肽 6
    肽的最低数量 2
    独特的肽的最小数量 1
    只使用未经修改的肽和氧化(M)/乙酰(蛋白质N-端) 启动选项肽与修改一般应不计入蛋白定量,因为他们的丰度可能不反映相应蛋白的比例。
    最低比率计 1
    “运行之间匹配” 启动选项

    表3数据分析。

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    Discussion

    我们最近已描述ChroP,定量策略染色质中的蛋白质组分的大规模表征。 ChroP结合的表观遗传领域使用两种互补的方法,芯片和质谱,从自己的优势中获利,克服各自的局限性。沉淀耦合到深度测序技术(ChIP-SEQ)允许的组蛋白修饰在核小体少35的分辨率的全基因组的映射。虽然便于其敏感性,基于抗体的测定是在自己有能力区分类似的修改和解剖的组蛋白密码36组合方面的限制。另一方面,当MS提供hPTMs,单独和组合9的全面和公正的分析,它迄今被应用到批量染色质的分析,具有随之而来的缺乏对位点特异性翻译后修饰patters信息。我们采用的ChIP的修改版本以隔离功能不同的染色质结构域和质谱表征了组蛋白PTM模式和非histonic蛋白特异性共同富集。

    通过使用N-ChroP,hPTMs与H3K9me3共同相关联的分析揭示了显著富集沉默染色质相关的标记物,并用活性染色质相关联的修改的耗尽。这些结果与以前的研究37的协议证明该策略的鲁棒性。在H3K9me3域的X ChroP,染色质相互作用蛋白的SILAC为基础的调查证实了一些先前描述的干扰作用,从而验证了该方法。

    ChroP提出了两个主要的原方面就已经提供给调查染色质的蛋白质组分的策略:例如,以显示修改的相同原封未动的单原子核内装潢独特核心组蛋白之间的分子间协同作用的可能性eosome由N-CHIP纯化;第二次的机会,评估组蛋白变体和连接组蛋白亚型的具体条块。由于组蛋白变体的调查受困于缺乏优质的试剂( 抗体),ChroP出现为可用以评估他们的位置和功能作用的独特的工具。

    ChroP在其目前的一个局限设立在于在MS用于肽为中心(“自下而上”)的方式,与组蛋白在消化短肽和检测修改之间的长距离连接随之而来的减值准备。因此,ChroP与“自底向上”MS分析的缀合允许的组蛋白密码的组合的方面中的一个局部的评估。我们预计,替代MS策略,如“中东和自顶向下”的hPTMs在较长肽映射(> 20 AA)最多的完整蛋白质38-40,实现将克服这种克制。

    总体而言,N和X-ChroP互补性强,具有解剖染色质结构的复杂性,在功能上不同的领域的可能性,与单以寡核小体的分辨率。我们预测,ChroP将是有益也标志着特定非histonic核蛋白质的存在的染色质区域的组成特征,例如转录因子(TF)。此外,ChroP可以在功能性研究可以使用全局转录激活过程中染色质的动态组合物在映射后的各种扰动的特定位点,例如。由于这些原因,ChroP出现在可用解剖染色质的蛋白质组景观分析战略武库中的其他有用的工具。

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    Disclosures

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgments

    这项研究最初发表在分子细胞蛋白质组学。索尔多米和染色质功能域Bonaldi T的蛋白质组学研究揭示新型增效作用之间鲜明的异染色质成分的MCP。 2013; 12:64-80。 ©美国社会生物化学与分子生物学。我们感谢罗伯塔Noberini(技术和IEO的意大利学院,意大利)的手稿的批判性阅读。结核病工作是由来自乔瓦尼Armenise哈佛基金会职业发展计划,意大利癌症研究协会和健康的意大利外交部资助。 MS工作是由一个FIRC奖学金支持。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

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