منظمة حلزونية من الدم التخثر عامل الثامن على الدهون الأنابيب النانومترية

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نقدم مجموعة من المجهر البرد الإلكترون، والدهون تكنولوجيا النانو، وتحليل بنية تطبيقها لحل هيكل غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية: الإنسان والخنازير. يوصف المنهجية التي وضعت في المختبر لدينا لتنظيم حلزوني وهما وظيفية أشكال FVIII المؤتلف على الأنابيب النانوية الدهون سالبة الشحنة (LNT).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البرد المجهر الإلكتروني (البرد EM) 1 هو نهج قوية للتحقيق في الهيكل الوظيفي للبروتينات والمجمعات في حالة وغشاء البيئة المائية 2.

تخثر العامل الثامن (FVIII) 3 هو متعدد المجال بروتين سكري بلازما الدم. عيب أو نقص FVIII هو سبب لنوع الهيموفيليا A - اضطراب نزيف حاد. عند تنشيط بروتين، FVIII بربط البروتيني سيرين عامل IXA على غشاء الصفيحات المشحونة سلبا، وهو أمر حاسم لتخثر الدم الطبيعي 4. على الرغم من الدور المحوري يلعب FVIII في تجلط الدم، المعلومات الهيكلية للدولة ملزمة لها غشاء غير مكتملة 5. التركيز FVIII المؤتلف هو الدواء الأكثر فعالية ضد نوع الهيموفيليا A ويمكن التعبير المتاحة تجاريا على حد سواء FVIII تشكيل المجمعات وظيفية مع الإنسان عامل IXA 6،7 الإنسان أو الخنزير.

"> في هذه الدراسة نقدم مجموعة من المجهر البرد الإلكترون (البرد EM)، تطبيق تكنولوجيا النانو الدهون وهيكل تحليل لحل هيكل غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية: الإنسان والخنازير والمنهجية التي وضعت في المختبر لدينا لتنظيم حلزوني وهما وظيفية أشكال FVIII المؤتلف على الأنابيب النانوية الدهون سالبة الشحنة (LNT) يوصف. توضح النتائج أن ممثل نهجنا هو حساسة بما فيه الكفاية لتحديد الاختلافات في تنظيم حلزونية بين اثنين غاية مثلي في تسلسل (تسلسل 86٪ الهوية وترد) البروتينات. بروتوكولات تفصيلية لتنظيم حلزونية، البرد EM والإلكترون التصوير المقطعي (ET) الحصول على البيانات. وثنائي الأبعاد (2D) وتطبيق ثلاثي الأبعاد (3D) تحليل هيكل للحصول على اعادة البناء 3D من الإنسان والخنزير ويناقش FVIII-LNT. تظهر الهياكل FVIII-LNT الإنسان والخنازير قدم المحتملة للمنهجية المقترحة لcalculatه لمنظمة غشاء محدد وظيفية من عامل تخثر الدم الثامن في ارتفاع القرار.

Introduction

عامل تخثر الدم الثامن (FVIII) هو بروتين سكري كبيرة من الأحماض الأمينية 2،332 نظمت في ستة مجالات: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. على الثرومبين تفعيل FVIII بدور العامل المساعد للعامل IXA داخل مجمع Tenase غشاء محدد. ملزمة من FVIII المنشط (FVIIIa) لFIXA بطريقة اعتمادا غشاء يعزز كفاءة FIXA بروتين أكثر من 10 5 مرات، وهو أمر حاسم لكفاءة تخثر الدم 4. على الرغم من الدور المهم الذي يلعبه في FVIII تخثر وتشكيل Tenase المعقدة، وغشاء محدد وظيفية هيكل FVIII هو لم تحل بعد.

لمعالجة ذلك، واحد الأنابيب النانوية الدهون طبقة ثنائية (LNT) الغنية في فسفاتيديل (PS)، وقادرة على FVIII ملزم مع تقارب عالية 8 و 9 و تشبه سطح الصفائح الدموية تنشيط وضعت 10. وقد ثبت منظمة حلزونية متتالية من FVIII بد أن LNT أن يكون effectiلقد لتحديد هيكل FVIII غشاء محدد من قبل الدولة البرد EM 5. بين functionalized LNT هي النظام المثالي لدراسة البروتين البروتين التفاعلات والبروتين غشاء من البروتينات المرتبطة غشاء حلزوني نظمت من قبل البرد EM 11، 12. البرد EM لديه ميزة على الطرق الهيكلية التقليدية مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي، كما يتم الاحتفاظ العينة في الأقرب إلى البيئة الفسيولوجية (العازلة، غشاء، ودرجة الحموضة)، من دون إضافات والنظائر. في حالة FVIII، ودراسة هيكل غشاء محدد مع هذا الأسلوب هو أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، كما LNT تشبه من حيث الحجم والشكل وتكوين أقدام كاذبة من الصفائح الدموية تفعيلها حيث تجميع المجمعات Tenase في الجسم الحي.

عيوب ونقص FVIII سبب الهيموفيليا A، اضطراب النزيف الحاد التي تؤثر على 1 في 5،000 الذكور من السكان الإنسان 4، 6. الأكثر البريدالعلاج ffective عن الهيموفيليا (أ) هو الإدارة مدى الحياة من الإنسان FVIII المؤتلف (hFVIII). ومن المضاعفات كبيرة من المؤتلف FVIII الهيموفيليا والعلاج هو تطوير الأجسام المضادة المثبطة لشكل الإنسان التي تؤثر على ما يقرب من 30٪ من مرضى الهيموفيليا A 13. في هذه الحالة، يتم استخدام FVIII الخنازير (pFVIII) التركيز، كما يعرض FVIII الخنازير منخفضة عبر التفاعل مع الأجسام المضادة المثبطة ضد FVIII الإنسان وأشكال المجمعات وظيفية مع FIXA الإنسان 7. إنشاء المنظمة غشاء محدد من كل من الخنازير وأشكال FVIII الإنسان المهم أن نفهم أساس الهيكلية للFVIII ظيفة العامل المساعد وآثارها على الإرقاء الدم.

في هذه الدراسة، ونحن تصف مزيج من تكنولوجيا النانو الدهون، البرد EM، وتحليل بنية تهدف إلى حل المنظمة غشاء محدد من شكلين FVIII مثلي للغاية. البيانات البرد EM وهياكل 3D المقدمة للporci نظمت حلزونيFVIII شمال شرق والبشرية المشحونة سلبا على LNT تظهر إمكانات تكنولوجيا النانو المقترحة كأساس لتحديد هيكل FVIII وعوامل التخثر غشاء محدد والمجمعات في بيئة غشاء الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد نموذج

  1. تبادل عازلة الإنسان FVIII-14 وبدد الخنزيري FVIII-15 BDD ضد العازلة HBS-كا (20 ملي HEPES، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم CaCl ودرجة الحموضة = 7.4) والتركيز إلى 1.2 ملغ / مل. الحفاظ على حل البروتين في -80 درجة مئوية.
  2. تحضير الأنابيب النانوية الدهون (LNT) عن طريق خلط GalactosylCeramide (GC) وفسفاتيديل (PS) في 01:04 ث / ث نسبة في الكلوروفورم. تتبخر الكلوروفورم تحت الأرجون وذوبان في الدهون العازلة HBS إلى 1 ملغ / مل. الحفاظ على حل LNT في 4 درجات مئوية.

2. البرد المجهر الإلكتروني من FVIII-LNT

  1. البرد EM إعداد نموذج
    1. توهج التفريغ 300 شبكة Quantifoil R2 / 2 شبكات النحاس (الجانب الكربون متابعة) في خليط من O 2 و H 2 الغاز لمدة 10 ثانية في 50 W.
    2. مزيج من حلول FVIII وLNT في المنطقة العازلة HBS-CA في 01:01 ث / ث نسبة واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تطبيق قطرة من 2.5 ميكرولترمن عينة FVIII-LNT إلى ماء شبكة المجهر الإلكتروني في غرفة ترطيب Vitrobot مارك الرابع (100٪ الرطوبة).
    4. وصمة عار وفلاش تجميد الشبكة (لطخة واحدة ل 3.5 ثانية، والقوة وصمة عار 1) في السائل C 2 H تبريده بواسطة N 2 السائل للحصول على الجليد غير متبلور.
    5. متجر الشبكات في صناديق تخزين تحت السائل N 2 (LN2).
  2. جمع البيانات البرد EM
    ملاحظة: تم تجهيز JEM2100-LaB6 (عام 2010) مع نظام التشغيل TEMCON تتكون من جهاز كمبيوتر متصلة بشبكة المجهر الإلكتروني، وشاشة مع نوافذ قراءة نظام فراغ، ونظام الإضاءة، HT، والتيارات العدسة وذلك على، واثنين لوحات: اليسار واليمين، وضعت على جانبي العمود. التحول شعاع X، Y المقابض (SHIFT Y، Y نخل) ومتعددة الوظائف (DEF / ستيغ) هي المقابض على كلا الفريقين. على لوحة LEFT هو الإضاءة (BRIGTHNESS) مقبض الباب. على لوحة RIGHT هي: التكبير (MAG / CAM الطول) والتركيز (FOCUS) المقابض وتخيل ثلاثةز (MAG1، MAG2، LOWMAG) وحيود (DIFF) وسائط الأزرار. نحن لدينا في الحصول على البيانات MAG1 في ألفا 2. الحد الأدنى لظروف الإضاءة جرعة (MDS) المطلوبة للحصول على البيانات البرد EM يتم تعيين مع F1 من خلال الأزرار F6، الصف العلوي على لوحة RIGHT. في هذا البروتوكول يتم استخدام إعدادات عامة: F1 - رفع / انخفاض الشاشة، F2 - وضع بحث، F3 - وضع FOCUS، F4 - وضع الصورة، F5 - MDS OFF / ON وF6 - BEAM فارغة، وتستخدم لحماية العينة من الإشعاع الضرر من خلال تشتيت شعاع.
    1. وضع حامل البرد في محطة البرد وملء ديوار من صاحب التسجيل والبرد محطة مع LN2. عندما تصل درجة حرارة -192 درجة مئوية، ومصراع مفتوحة على طرف حامل، مكان جمدت سابقا البرد EM الشبكة في المكان المعين وآمن مع المشبك الحلبة.
    2. إدراج حامل البرد في المجهر الإلكتروني. إعادة ملء ديوار من البرد حامل وغرفة المضادة للcontaminator مع LN2. انتظر حامل لتحقيق الاستقرار لمدة 30-60 دقيقة. الصحافة F6 على وتحويل خيوط جرا. عندما يتشبع خيوط، F6 اضغط على الخروج وفتح مصراع على حامل لعرض الشبكة.
    3. الصحافة أدنى ماج / ألفا 1 (مجموعة ماج في 200X) وتحديد المناطق ذات الجليد الرقيق على الشبكة.
    4. التبديل إلى MAG 1/alpha 2 إلى تعيين الحد الأدنى جرعة (MDS) واسطة والحصول على البيانات البرد EM بجرعات منخفضة الإلكترون، دون الإضرار العينة.
      1. الصحافة F2 لضبط وضع البحث. تعيين التكبير في 40،000 خ. تكبير شعاع BRIGTNESS مع مقبض الباب لجرعة الإلكترون الحد الأدنى 0.04 ~ ه - / 2 ق ·. الصحافة مهرجان دبي السينمائي الدولي للتبديل إلى وضع حيود. تعيين طول الكاميرا إلى 120 سم مع MAG / CAM الممكن تغليفها مقبض الباب. تحديد المناطق على الشبكة ضمن مناطق مختارة مسبقا في LOWMAG التي لديها الأنابيب النانوية الدهون في ثقوب الفيلم الكربون.
      2. اضغط F4 لضبط وضع الصورة في 40،000 X التكبير وضبط الإضاءة مع سطوع مقبض بجرعات من 16-25 ه - / 2 ق ·. اضغط على زر معيار التركيز على وضع شروط التركيز ضبط Z-ارتفاعمن العينة مع Z UP / DOWN أزرار (لوحة التحكم لليمين). تعيين يزيل التباؤر بين -1.5 -2.5 ميكرون و.
      3. محاذاة بحث ووضع صورة عن طريق رسم مربع في نافذة عرض لايف على شاشة الكاميرا الرقمية في وضع المقابلة بحث إلى المنطقة المراد تصويرها في وضع PHOTO.
      4. الصحافة F3 لضبط وضع التركيز على 100،000 X التكبير. تركز الإضاءة لتغطية رقاقة CCD (~ 4-5 سم نصف القطر) وخارج المحور لعدم أشرق المنطقة المراد تصويرها في وضع PHOTO. ضبط يزيل التباؤر إلى ~ -1.5 -2.5 ميكرون ومع مقبض التركيز والصحيح لالاستجماتيزم من الصورة مع المقابض DEF / ستيغ.
    5. حدد FVIII-LNT ليمكن تصوير في وضع بحث من خلال الحصول على الصور الحية في إطار عرض لايف على شاشة الكاميرا الرقمية. توسيط FVIII-LNT في مربع رسمها على نافذة عرض لايف.
    6. تسجيل الصور الرقمية على الكاميرا CCD في التكبير X 52،000 فعالة و0.5 ثانية التعرض عن طريق التحول إلى وضع صورة فوتوغرافية والنقر على ACQUIRزر E على صورة مجهرية رصد الكاميرا الرقمية. يتم تعيين شروط الحصول على الصور مثل شعاع فارغة (SHUTTERS) مفتوحة فقط عندما يتم الحصول على الصورة في وضع PHOTO.
    7. تحقق من جودة ويزيل التباؤر من الصورة المكتسبة عن طريق الضغط على CTRL-F للحصول على تحويل فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس).

3. إعادة الإعمار 3D

ملاحظة: البرنامج تحليل الصور المستخدمة في 2D و 3D تحليل: هي EMAN2 وIHRSR متاحة بحرية. EMAN2 يمكن تحميلها من http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. ويمكن الحصول على البرنامج من IHRSR أستاذ Egelman: egelman@virginia.edu. يتم تشغيل التحسينات IHRSR النهائية على تكساس متقدمة الحوسبة العنقودية مركز: http://www.tacc.utexas.edu/ في جامعة تكساس في أوستن. خوارزمية إعادة الإعمار 3D هو مبين في الشكل 1 تتكون من خطوتين أساسيتين: الأولى اختيار مجموعة متجانسة من قطاعات حلزونية (جسيمات) مع الإشارة الحرة alignme 2Dالإقليم الشمالي (ار اف) الخوارزميات تنفيذها في EMAN 2، وتحقيق الثاني لإعادة الإعمار 3D استنادا إلى المعلمات حلزونية والخوارزميات الإسقاط الخلفي تأسست في IHRSR. الخطوة الأولى تستخدم البرامج التي وضعت لاختيار مجموعات متجانسة الجسيمات لإعادة الإعمار 3D مع واحدة الجسيمات SPA (الخوارزميات) التي EMAN2 تم تطويرها خصيصا وتوزيعها: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. وقد تم تكييف هذه الخطوة إلى البيانات البرد EM. ويتم تحقيق الخطوة الثانية مع خوارزمية IHRSR، والتي صممت خصيصا لنوع من الجمعيات حلزونية تم الحصول عليها مع أشكال العامل الثامن المؤتلف. وقد تم توثيق هذه الخوارزمية على نطاق واسع من خلال المؤلفات العلمية 12.

  1. إجراء تحليل صورة 2D مع EMAN2 العلمية لمعالجة الصور جناح: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 لتحديد الجسيمات متجانسة (الجزء حلزونية) مجموعات لإعادة الإعمار حلزونية.
    1. حدد الميكروسكوب البرد EM مع straigحزب التحرير ومنظمة تنظيما جيدا أنابيب حلزونية مع برنامج الكاميرا الرقمية وأدوات التصوير.
    2. المقلوب، تطبيع وتصفية بكسل الأشعة السينية في واجهة المستخدم الرسومية e2workflow.py والتعمير جسيم واحد الخيار (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. استيراد الصور المقلوب، تطبيع وبكسل الأشعة السينية التي تمت تصفيتها في واجهة المستخدم الرسومية e2helixboxer.py. حدد FVIII-LNT أنابيب حلزونية والجزء في 256 × 256 بكسل (2.9 Å / بيكسل) مع 90٪ باستخدام التداخل: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. تقييم يزيل التباؤر من الميكروسكوب الأصلي وتطبيق نقل النقيض وظيفة (CTF) تصحيح (تصحيح فقط المرحلة) إلى شرائح حلزونية من نفس الميكروسكوب مع خيار e2ctf.py أدرجت في e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. توليد الجسيمات الأولية (شرائح حلزونية) يحدد في واجهة المستخدم الرسومية e2workflow.py - الخيار SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. حساب المتوسطات فئة 2D مع خوارزمية e2refine2d.py تطبيق إشارة حرة تصنيف ك متوسط ​​لتحديد مجموعات البيانات متجانسة مع نفس LNT القطر ودرجة من النظام حلزونية (الشكل 2)، وبعد البرنامج النصي: "e2refine2d.py - معبر = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - مسار = r2d_001 - إدخال INPUT.hdf = - = NCLS 51 - simcmp = نقطة - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = نقطة - classraligncmp = المرحلة - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = متوسط ​​- normproj-classkeepsig وتغيير قيمة NCLS فقا لذلك.
      1. تصنيف البيانات الأولية المحددة في 'NCLS = 151' 150 الطبقات أكثر من 8 مرات التكرار مع 'classkeep = 0.8'، وهذا يعني أن الجسيمات مع أقل من 80٪ تشابه إلى متوسط ​​الدرجة مستثناة من فئة معينة. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. دمج جزيئات من الطبقة المتوسطاتمع حيود حلزونية وضوحا في e2display.py لخلق وسيطة مجموعة البيانات.
      3. تصنيف البيانات وسيطة تعيين في 'NCLS = 51' 50 فصول للتمييز الطبقات مع نفس القطر ودرجة من النظام.
      4. دمج الطبقات مع جزيئات من نفس القطر ودرجة من النظام في e2display.py لإنشاء مجموعة البيانات النهائية لإعادة إعمار ثلاثي الأبعاد: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. تنفيذ إعادة الإعمار حلزونية مع خوارزمية تكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء (IHRSR)، كما هو موضح في Egelman 17، 18.
    1. ويقدر الارتفاع، Δz (أ) من الحلزون FVIII-LNT من فورييه مجتمعة تحويل الجزيئات في مجموعة البيانات النهائية.
    2. تحديد زاوية السمتي ΔΦ (º) عن طريق تشغيل التحسينات IHRSR بالتوازي مع Δz المستمر، وزيادة ΔΦ من 576؛ إلى 60 درجة في 5 ° الزيادات.
    3. تشغيل 100 دورات متتالية IHRSR لكل البيانات النهائية التي تم تحديدها مع اسطوانة ملامح باعتباره حجم الأولي والمعلمات حلزونية الأولي Δz وΔΦ على النحو المحدد في 3.2.1. و3.2.2.
    4. تفقد وحدات التخزين النهائي للتقارب من المعلمات حلزونية والمراسلات بين متوسطات الدرجة من التصنيف 2D من مجموعة البيانات النهائية والتوقعات من إعادة الإعمار IHRSR النهائي.
    5. فرض التماثل إلى إعادة البناء 3D النهائي، المقابلة لتوزيع وحدة غير متكافئة لوحظ في وحدات التخزين 3D غير المتماثلة النهائية: 4 أضعاف للإنسان FVIII-LNT و 5 أضعاف لالخنزيري FVIII-LNT. تشغيل 100 دورات صقل أخرى لتوليد إعادة الإعمار 3D النهائي symmetrized.
    6. حساب منحنى الارتباط فورييه شل على حد سواء وحدات التخزين عن طريق فصل البيانات المناظرة الأولى المنصوص عليها في الفردية والزوجية: 'e2proc2d.py <infile> <outfilه> - انقسام = 2 '. قم بتشغيل 100 IHRSR التحسينات على التوالي كما هو موضح في 3.2.3. حساب FSC وحدات التخزين 3D إنشاؤها من مجموعات البيانات الفردية والزوجية: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. تصور والقطاع مجلدات FVIII-LNT في سان فرانسيسكو الوهم.
    1. فتح وحدات التخزين النهائي من الخطوة 3.2.5. في سان فرانسيسكو الوهم وتعيين مستوى كفاف إلى 0.005 في أدوات> حجم البيانات> الخيار VIEWER حجم.
    2. في اتصال> حجم البيانات> خريطة القطاعي، حدد وحدة التخزين في التبويب MAP القطاعي وانقر على قطعة لشريحة وحدة التخزين.
    3. مجموعة شرائح المقابلة لخلية وحدة واحدة عن طريق اختيار CTRL + SHIFT مع مجموعة والنقر.
    4. لون شرائح من قبل الخلية وحدة والحلزون مع الإجراءات> خيار اللون للتأكيد على السمات الهيكلية.

4. الكترون التصوير المقطعي

  1. الملون سلبا FVIII-LNT إعداد نموذج
      <لى> إعداد عينات FVIII-LNT بالنسبة للتجارب البرد EM.
    1. توهج التصريف 300 شبكة الشبكة النحاسية المغلفة الكربون (الجانب الكربون متابعة) في خليط من O 2 و H 2 الغاز لمدة 10 ثانية في 50 W بالنسبة للتجارب البرد EM.
    2. تطبيق قطرة من 2.5 ميكرولتر FVIII-LNT التعليق مع 6 نانومتر الذهب النانوية الغروية إلى الشبكة، وصمة عار السائل الزائد وصمة عار سلبا من خلال تطبيق الحل 5 ميكرولتر 1٪ خلات اليورانيل لمدة 2 دقيقة. وصمة عار السائل الزائد والهواء الجاف الشبكة.
  2. جمع البيانات الإلكترون التصوير المقطعي
    1. نقل الشبكة في حامل الميل واحد.
    2. نقل صاحب في المجهر الإلكتروني.
    3. جمع سلسلة الميل تلقائيا مع البرنامج SerialEM 19 في 2 ° الزيادات على نطاق الزاوي من -60 درجة إلى +60 درجة وسجل الصور مع كاميرا CCD في 52،000 X التكبير فعالة، ل-6 -10 ميكرون ويزيل التباؤر جرعة الإلكترون من 150 - 170 ايلىctrons / 2 · ثانية لكل صورة مقطعية.
  3. الإلكترون التصوير المقطعي إعادة إعمار FVIII-LNT
    ملاحظة: إعادة بناء سلسلة pFVIII-LNT وhFVIII-LNT يميل المكتسبة في 4.2. مع خيار ETomo من البرامج التالية IMOD البرنامج التعليمي: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. باستخدام نافذة الصالة، فتح مقطعية في 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. بن لمقطعية بنسبة 4 مع IMOD BINVOL الأمر لتقليل حجم مقطعية.
    3. تحديد الزاوية المناسبة لتدوير أنابيب الدهون على طول المحور Y في اهمال مقطعية باستخدام الأمر IMOD ROTATEVOL.
    4. تدوير مقطعية كاملة مع الأمر IMOD ROTATEVOL.
    5. اقتصاص أنابيب الدهون المحددة الموجهة على طول محور Y مع IMOD الأمر CLIP تغيير الحجم.
    6. فتح اقتصاص صورة مقطعية من الباطن مع 3DMOD.
    7. انقر على مقطعية لتصور ترتيب جزيئات العامل الثامن على طولشرائح في Z-المحور وعلى طول Y-axis في حجم مقطعية الفرعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظمت FVIII الخنازير والإنسان المؤتلف بنجاح حلزوني على المتهمين LNT طبقة ثنائية واحدة سلبا، تشبه سطح الصفائح الدموية تفعيلها. وكان تنظيم حلزونية من الإنسان والخنزير FVIII-LNT متسقة من خلال الميكروسكوب الرقمي جمعها (الشكل 2). تم اختيار LNT التحكم والإنسان وFVIII-LNT أنابيب حلزونية الخنازير ومجزأة مع واجهة المستخدم الرسومية e2helixboxer.py ومجموعات البيانات الأولية التي تم إنشاؤها باستخدام واجهة المستخدم الرسومية e2workflow.py، الخيار الجسيمات واحدة (الجدول 1).

تم تقييم النظام حلزونية من الإنسان غشاء محدد والخنزيري FVIII-LNT من تحويل فورييه من المتوسطات فئة مع واجهة المستخدم الرسومية e2display.py (EMAN2) (الشكل 3). يتم تعريف طبقة ثنائية المادة الدهنية في سيطرة أفضل LNT المتوسطات فئة 2D جيدا. النشرة الداخلية والخارجية وانخفاض كثافة الغشاء مسعور الأساسية هي واضحة للعيان ( (أرقام 3B و 3C). تطور أكثر وضوحا لFVIII-LNT أنابيب حلزونية الإنسان يشير إلى أن البروتين البروتين التفاعلات بين المتاخمة غشاء محدد جزيئات FVIII تختلف باستمرار لأشكال FVIII اثنين (أرقام 3B و 3C). تم دمج الجزيئات من فئة المتوسطات تظهر منظمة حلزونية جيدة (نمط حيود حلزونية) في واجهة المستخدم الرسومية e2display.py لتشكيل مجموعة الجسيمات المتوسطة (الجدول 1). جزيئات من مجموعات الجسيمات المتوسطة صنفت مرة أخرى في 50 فصول مع نفس القيود. تم دمج الجزيئات من المتوسطات فئة مع نفس القطر في البيانات النهائيةمجموعات (الجدول 1).

وأجريت عمليات إعادة البناء الأولية 3D للإنسان والخنزيري FVIII-LNT خارجا مع جزيئات 1،000 ممثل من مجموعات البيانات FVIII-LNT الخنازير الإنسان والنهائي. تم تشغيل مائة تكرارات متتالية IHRSR لكل إعادة الإعمار 3D مع اسطوانة ملامح (160 Å Å الداخلية و 500 القطر الخارجي)، وحجم الأولي. ارتفاع المحوري (Δz) تحسب من فورييه تحويل مجتمعة من شرائح حلزونية (مجموعة جزيئات) تساوي 41 ألف لالإنسان FVIII-LNT و 36 ألف لالخنزيري FVIII-LNT (أرقام 4A و 4B). ويقدر زاوية السمتي الأولي (ΔΦ) المعرفة من البحث في تكرارية 40.0 ° للإنسان FVIII-LNT و35.0 ° في لالخنزيري FVIII-LNT. يتم فحص وحدات التخزين النهائي للتقارب من المعلمات حلزونية والمراسلات بين متوسطات الدرجة والتوقعات من reconstr النهائيuction، كما يلي المعايير الموضحة في 5. وفرضت اعادة البناء 3D مختارة والمعلمات حلزونية المقابلة وحدات التخزين الأولي والمعلمات حلزونية الأولية لصقل IHRSR الثاني من 100 دورات التي تلاقت لمنظمة حلزونية أربع بدء للإنسان FVIII-LNT مع Δz = 41.1 ألف وΔΦ = 42.0 ° ومنظمة حلزونية تبدأ خمس سنوات لالخنزيري FVIII-LNT مع Δz = 35.5 ألف وΔΦ = 34.8 درجة. A النهائية 100 IHRSR تكرار فرض على بعد 4 أضعاف والتماثل حلزونية 5 أضعاف لاعادة البناء الخنزيري FVIII-LNT الإنسان وعلى التوالي تنفذ مع وحدات التخزين الأولية والمقابلة المعلمات حلزونية من آخر التحسينات IHRSR غير المتماثلة (أرقام 4C و 4D). تظهر وحدات التخزين النهائي 8 FVIII الإنسان و10 FVIII جزيئات غشاء محدد الخنازير نظمت حلزونية حول محور (الشكل 5A). كل الإنسانيتم تفعيل جزيء FVIII 41.2 ألف واستدارة 42.0 ° عن سابقتها وتتم ترجمة كل جزيء FVIII الخنازير 35.9 ألف واستدارة 35.2 º من سابقتها، الموافق المعلمات حلزونية من اعادة البناء 3D النهائي (الشكل 5B).

وtomograms الإلكترون أعيد تأكيد الفرق في تنظيم حلزونية بين FVIII-LNT الإنسان والخنازير التي تم الحصول عليها في نفس الظروف التجريبية. مقارنة بين وجهات النظر من أعلى tomograms بناؤها وحدات التخزين 3D من إعادة الإعمار حلزونية عرضها في اتجاه عمودي على محور حلزونية، بالتحقق من صحة مزيد من صحة اعادة البناء 3D المكرر مع IHRSR المعلمات حلزونية (الشكل 6). أبعاد الخلية وحدة 2D غير المتماثلة لإعادة إعمار FVIII-LNT 3D الإنسان هي: أ = 17.8 نانومتر، ب = 8.2، γ = 84 ° وللالخنزيري FVIII إعادة الإعمار 3D-LNT: أ =18.4، ب = 7.2 وγ = 70 درجة (الشكل 6). أبعاد الخلية وحدة من FVIII الإنسان نظمت في بلورات 2D غشاء محدد هي: أ = 8.1، ب = 7.0 و γ = 67 º، والتي تتطابق مع سطح واحد جزيء FVIII شوهدت نحو 20 غشاء سطح تغطيتها. مقارنة أبعاد الخلية وحدة بين FVIII نظمت في 2D و بلورات حلزونية يشير إلى أن كلا من جزيئات FVIII الخنازير الإنسان وتشكيل dimers عندما نظمت حلزوني على سطح LNT.

الشكل 1
الشكل 1. هيكل تحليل الرسم البياني. اتباع الخطوات لتحليل 2D تصنيف على أساس مرجعية الحرة خوارزميات المحاذاة تنفيذها في EMAN2 16 وحلقت في الزرقاء. اتبعت الخطوات لتحليل 3D نفذت مع حلزونية متكررة الحقيقي وحلقت خوارزميات إعادة الإعمار الفضاء (IHRSR) باللون الأحمر. يتم الرمز دورات IHRSR متكررة مع السهام متقطع.

الرقم 2
الشكل 2. الميكروسكوب البرد EM الرقمية. (4،096 خ 4،096 بكسل، 2.9 Å / بيكسل) من الأنابيب النانومترية الدهون (LNT) مع وبدون FVIII منضم. A. تحكم LNT. B. الإنسان FVIII-LNT. C. خنزيري FVIII-LNT . يشار إلى حافة حفرة في الفيلم الكربون التي يتم فيها تعليق FVIII-LNT في الجليد غير متبلور مع نجمة بيضاء. كثافة البروتين الدهني هي وباللون الأسود. آراء تضخيم (إدراجات) 512 X 512 اقتصاص المناطق (أبيض متقطع مربع) توضيح الفرق في تنظيم حلزونية من الإنسان وFVIII الخنازير، على التوالي. شريط المقياس هو 100 نانومتر.ig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. المتوسطات فئة الممثل 2D (الصف العلوي) وما يقابلها من التحويلات فورييه (الصف السفلي) من مجموعات الجسيمات المتوسطة (الجدول 1) تصنف في فئات 50 ألف تحكم LNT B. الإنسان FVIII-LNT C. خنزيري FVIII-LNT. وأشار عدد من الدرجة وعدد من الجسيمات المدرجة في كل فئة. ويعتبر الفرق في ترتيب حلزوني بين الإنسان والخنازير FVIII بوضوح على الصور وأكده أنماط الحيود تم الحصول عليها من فورييه يحول هذه الصور. الرجاء النقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. إعادة البناء حلزونية 3D من الإنسان والخنزير FVIII-LNT. A. المشتركة تحويل فورييه من 1،000 شرائح حلزونية. وتتركز خط الطبقة الأولى والثانية في 1/82 ألف -1 و 1/41 ألف -1 لالإنسان FVIII-LNT، وفي 1/72 Å -1 و 1/36 ألف -1 لالخنزيري FVIII-LNT (أبيض السهام). B. تمثيل سطح الإنسان في ردي (Δz = 41.1 Å، ΔΦ = 42.0 º) والخنازير في الزرقاء (Δz = 35.9 Å، ΔΦ = 35.2 º) FVIII-LNT 3D اعادة البناء حلزونية. يتم عرض كل وحدات التخزين في 0.005 مستوى كفاف (الحد الأدنى هو 0 الكثافة والكثافة القصوى 0.02، كما يحسب في سان فرانسيسكو الرنينرا، الخيار حجم المشاهد 21). طول الأنبوب FVIII-LNT هو 256 بكسل في 2.9 Å / بيكسل. الارتباط C. فورييه شل (FSC) مؤامرات لالإنسان والخنازير FVIII-LNT يظهر القرار من 20.5 Å في FSC = 0.5.

الرقم 5
الرقم 5. منظمة حلزوني من FVIII-LNT. تمثيل سطح مقسمة الإنسان والخنازير من FVIII-LNT اعادة البناء حلزونية الإنسان والخنازير، هو مبين في الشكل 4B. وقد تم تقسيم وحدات التخزين بعد فرض التماثل 4 أضعاف إلى الإنسان FVIII-LNT والتماثل 5 أضعاف إلى الخنزيري FVIII-LNT. الوحدات غير المتماثلة لونا مميزا الأصفر والأحمر للإنسان FVIII-LNT والأخضر والأزرق لالخنزيري FVIII-LNT. A. المشاهدات طول محور حلزونية أشار مع مربع للإنسان وكماشكل خماسي لالخنزيري FVIII-LNT. ويبين هيكل FVIII-LNT الإنسان 8 الجزيئات نظمت حول الغشاء الخارجي LNT ويظهر هيكل FVIII الخنازير 10 الجزيئات نظمت حول الغشاء الخارجي LNT، أشار مع الأرقام. B. المشاهدات عمودي على محور حلزونية. الإنسان FVIII-LNT هو بنية حلزونية 4 بدء والخنزيري FVIII-LNT هو بنية حلزونية تبدأ-5. يشار إلى فرد واحد اللوالب البداية مع الأرقام ومرمزة. أكدنا واحدة من اللوالب من كل بنية مع (*) وخطوط خضراء. شريط المقياس هو 20 نانومتر.

الرقم 6
الرقم 6. وتظهر المقارنة بين اعادة البناء 3D حلزونية والتصوير المقطعي. إن الإنسان FVIII-LNT (A) والخنازير FVIII-LNT (C) اعادة البناء 3D حلزونية perpendicular على محور حلزونية. كل خلية وحدة واللوالب الفردية هي كما في الشكل مرمزة 5. B. وD. هي تمثيلات كثافة اعادة البناء المقطعي 3D، شوهدت عمودي على محور حلزونية. يظهر شعرية 2D تعكس الترتيب حلزونية من الجزيئات FVIII مع خطوط خضراء.

عينات cLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
الميكروسكوب الأولية 61 474 542
مجموعات الجسيمات الأولية 29113 60395 64665
يزيل التباؤر (نانومتر) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1،086
مجموعات الجسيمات المتوسطة 25907 27305 22773
مجموعات الجسيمات النهائية 25907 10،455 10،430

الجدول 1. تحليل الإحصاءات 2D التالية الخوارزمية المعروضة في المخطط الانسيابي على الشكل 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل ويقدم منهجية للتمييز بين اثنين غشاء محدد المنظمات البروتينات مثلي للغاية: FVIII الإنسان والخنازير على الأنابيب النانوية الدهون في الظروف التي واجهتها في الجسم البشري الذاتي تجميعها.

في الإجراء وصفها، وتنظم الإنسان وFVIII الخنازير بنجاح حلزوني على الأنابيب النانوية الدهون، والتي هي الخطوة الأكثر أهمية. الخطوة الحاسمة المقبلة هو الحفاظ على العينة في الجليد غير متبلور رقيقة من قبل فلاش تجميد في القريب السائل N 2 درجة الحرارة. الحفاظ على العينة في درجة حرارة الجليد وغير متبلور LN2 تحافظ على أنابيب حلزونية رطب والمجالس البروتين الدهني الجزيئات النشطة من الناحية الفسيولوجية. الخطوة الحاسمة النهائية والحصول على بيانات البرد EM من كمية ونوعية تكفيان لهيكل 3D عالية الدقة في درجة الحرارة بالقرب LN2. جمع البيانات في درجة حرارة قريبة من LN2 مزيد يمنع جفاف العينة في الخامس عاليةacuum المجهر والإشعاع الضرر من شعاع الالكترون.

لحساب هيكل غشاء محدد من FVIII الخطوة الحاسمة الأولى هي الحصول على جسيمات متجانسة (شرائح حلزونية) مجموعات بتطبيق إشارة 2D تصنيف حرة والجمع بين الجسيمات من الطبقات مع نفس القطر ودرجة من النظام. الخطوة الحاسمة الثانية هو فرض حجم الحق الأولي والمعلمات حلزونية (الارتفاع وزاوية السمتي) لإعادة الإعمار حلزونية. الخطوة الحاسمة الثالثة والأخيرة هي للتحقق من صحة بنية حلزونية من خلال مقارنة الخرائط 3D التي حصل عليها المقطعي الحلزوني والإلكترون (بدون التماثل المفروضة) اعادة البناء من نفس العينة.

المنهجية المعروضة هي فريدة من نوعها في قدرتها على حل الهيكل الوظيفي من البروتينات المرتبطة الغشاء في الظروف الفسيولوجية القريب. وLNT وضعت في المختبر لدينا يمكن أن يكوناستخدمت بنجاح كمنصة لمنظمة حلزونية من عوامل التخثر في الدم وظيفية غشاء محدد وتحقيق أفضل قرار من لFVIII نظمت في بلورات 2D غشاء محدد وكما جزيئات واحدة. هدفنا هو مواصلة زيادة دقة من اعادة البناء حلزونية لدينا من خلال تحسين التجانس والجودة من مجموعات الجسيمات النهائية. وجمع أكثر الميكروسكوب البرد EM في أفضل الظروف البرد EM (بندقية الانبعاثات الميدان، مرشح الطاقة، DE كشف عن الكاميرا) من FVIII-LNT خيوط حلزونية وبالتالي بما في ذلك مجموعات الجسيمات الأولية أكبر لإعادة إعمار 2D تحقيق ذلك. سوف تحسين التجمع حلزونية FVIII-LNT والخوارزميات إعادة الإعمار 3D تسمح لنا الحصول نانومتر الفرعية وبالقرب من القرار الذرية، والتي ستحدد بشكل لا لبس فيه المنظمة غشاء محدد من هذا الحرج للبروتين التخثر في الدم.

تنظيم أشكال FVIII مثلي حلزوني يعطينا أيضا فرستاي لوصف كيفية الاختلاف في تسلسل يمكن ربط الاختلافات في البنية والوظيفة. يمكن حل هياكل غشاء محدد FVIII الإنسان والخنازير وفقا للأساليب الموضحة في هذه المقالة مساعدة في التعرف على تسلسل، والتي عندما المعدلة وتحسين وظيفة FVIII المؤتلف. هذه المعرفة سوف تكون لها آثار سريرية كبيرة لاكتشاف المخدرات في كلا الحقلين التخثر والإرقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أن لديهم أي مصلحة مالية المتنافسة والتي يمكن الاتصال مباشرة فيما يتعلق بأي من الإجراءات التي نشرت في هذا المخطوط.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل من خلال منحة تنمية ساينتست الوطني من جمعية القلب الأمريكية: 10SDG3500034 وUTMB-الأهلي بدء الأموال إلى SSM. يعترف الكتاب المرافق البرد EM والحوسبة العلمية في مركز سيلي لعلم الأحياء الهيكلي في UTMB ( www.scsb.utmb.edu )، وكذلك الدكاترة. ستيف ووتك إد Egelman للمساعدة في الخوارزميات إعادة الإعمار حلزونية 2D و 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics