Helical Organisation av koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorör

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi presenterar en kombination av Cryo-elektronmikroskopi, lipid nanoteknik, och strukturanalys tillämpas för att lösa membranbundna strukturen av två mycket homologa FVIII former: mänskliga och svin. Den metod som utvecklats i vårt laboratorium för att spiral organisera de två funktionella rekombinanta FVIII formulär på negativt laddade lipid nanorör (LNT) beskrivs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) 1 är en kraftfull metod för att undersöka den funktionella strukturen hos proteiner och komplex i ett hydratiserat tillstånd och membranmiljö 2.

Koagulationsfaktor VIII (FVIII) 3 är en multi-domän blodplasma glykoprotein. Defekt eller brist på faktor VIII är orsaken för hemofili typ A - en allvarlig blödning sjukdom. Efter proteolytisk aktivering, binds FVIII till serinproteaset faktor IXa på den negativt laddade plättmembranet, som är kritisk för normal blodkoagulation 4. Trots den centrala roll FVIII spelar i koagulation, är strukturinformation för dess membranbundna tillstånd ofullständig 5. Rekombinant FVIII-koncentrat är det mest effektiva läkemedel mot hemofili typ A och kommersiellt tillgänglig FVIII kan uttryckas såsom human eller porcin, båda som bildar funktionella komplex med human Faktor IXa 6,7.

"> I denna studie presenterar vi en kombination av Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), appliceras lipid nanoteknologi och strukturanalys för att lösa membranbunden struktur av två starkt homologa FVIII former:. Human och porcin Den metod som utvecklats i vårt laboratorium att spiral organisera de två funktionella rekombinanta FVIII formulär på negativt laddade lipid nanorör (LNT) beskrivs. De representativa resultat visar att vår strategi är tillräckligt känslig för att definiera skillnaderna i den spiralformade organisationen mellan de två mycket homolog i sekvens (86% sekvensidentitet ) proteiner. Detaljerade protokoll för spiral organisation, Cryo-EM och elektron tomografi (ET) datainsamling ges. Den tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) struktur analys tillämpas för att erhålla de 3D-rekonstruktioner av människa och svin FVIII-LNT diskuteras. De presenterade humana och svin FVIII-LNT strukturer visar potentialen i den föreslagna metoden för beräkninge den funktionella, membranbunden organisationen av koagulationsfaktor VIII med hög upplösning.

Introduction

Koagulationsfaktor VIII (FVIII) är ett stort glykoprotein av 2332 aminosyror är organiserade i sex områden: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Upon Trombinaktive FVIII fungerar som kofaktor till faktor IXa i den membranbundna Tenase komplex. Bindning av aktiverad faktor VIII (FVIIIa) till FIXa i ett membran-beroende sätt förbättrar FIXa proteolytiska effektiviteten mer än 10 5 gånger, vilket är avgörande för en effektiv blodkoagulering 4. Trots den viktiga roll FVIII spelar i koagulation och Tenase komplexbildning, är det funktionellt membranbundna FVIII struktur ännu inte har lösts.

För att åtgärda detta, har enstaka lipiddubbelskikts nanorör (LNT) rika på fosfatidylserin (PS), som kan binda FVIII med hög affinitet 8, 9 och liknar ytan aktiverade trombocyter utvecklats 10. Löpande spiral organisation av FVIII bundet till LNT har visat sig vara effective för strukturbestämning av FVIII membranbundet tillstånd av Cryo-EM 5. Funktionaliserad LNT är ett idealiskt system för att studera protein-protein och protein-membran interaktioner av spiralformigt organiserade membranassocierade proteiner genom Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM har den fördelen framför traditionella strukturella metoder såsom röntgenkristallografi och NMR, som provet är bevarad vid närmast den fysiologiska miljön (buffert, membran, pH), utan tillsatser och isotoper. I fallet med FVIII, studera membranbundna strukturen med denna teknik är ännu mer fysiologiskt relevant, eftersom LNT liknar tätt efter storlek, form och sammansättning av pseudopodia av de aktiverade trombocyterna där Tenase komplex samlas in vivo.

Fel och brist på FVIII orsakar Hemofili A, en allvarlig blödning sjukdom som påverkar 1 i 5.000 män i den mänskliga befolkningen 4, 6. Den mest effective terapi för hemofili A är livslång behandling med rekombinant human faktor VIII (hFVIII). En betydande komplikation av den rekombinanta FVIII Hemofili A-behandling är utvecklingen av hämmande antikroppar mot den mänskliga formen som drabbar ungefär 30% av hemofili A-patienter, 13. I detta fall är porcin FVIII (pFVIII) koncentrat används, såsom porcina FVIII displayer låg korsreaktivitet med hämmande antikroppar mot human faktor VIII och bildar funktionella komplex med humant FIXa 7. Inrättande av membranbundna organisation av både svin och mänskliga FVIII former är viktigt att förstå den strukturella grunden för FVIII kofaktor funktion och konsekvenser för blod hemostas.

I denna studie beskriver vi en kombination av lipid nanoteknik, Cryo-EM, och strukturanalys som syftar till att lösa membranbundna organisation av två mycket homologa FVIII former. De presenterade Cryo-EM data och 3D-strukturer för spiral organiserad Porcine och mänsklig FVIII på negativt laddade LNT visar potentialen i den föreslagna nanoteknik som bas för strukturbestämning av FVIII och membranbundna koagulationsfaktorer och komplex i en fysiologisk membranmiljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provberedning

  1. Buffert utbyte human FVIII-BDD 14 och porcin faktor VIII-BDD 15 mot HBS-Ca-buffert (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7,4) och koncentrera till 1,2 mg / ml. Håll proteinlösningen vid -80 ° C.
  2. Förbered lipid nanorör (LNT) genom blandning av galaktosylceramid (GC) och fosfatidylserin (PS) vid 01:04 vikt / vikt-förhållande i kloroform. Indunsta kloroformen under argon och solubiliserar lipiderna i HBS-buffert till 1 mg / ml. Förvara LNT lösningen vid 4 ° C.

2. Cryo-elektronmikroskopi av FVIII-LNT

  1. Cryo-EM Provberedning
    1. Glow urladdning på 300 mesh Quantifoil R2 / 2 koppargaller (kol sidan upp) i en blandning av O2 och H2-gas i 10 sekunder vid 50 W.
    2. Blanda FVIII och LNT lösningar i HBS-Ca-buffert vid 01:01 vikt / vikt-förhållande och inkubera under 15 min vid rumstemperatur.
    3. Applicera en droppe 2,5 plav faktor VIII-LNT prov till den hydrofila elektronmikroskopi rutnät i Vitrobot Mark IV fuktkammare (100% luftfuktighet).
    4. Blot och blixt frysa rutnätet (en plump för 3,5 sek, blot kraft 1) i flytande C 2 H 6, kyls ned med flytande N2 för att erhålla amorf is.
    5. Förvara galler i förvaringslådor under flytande N2 (LN2).
  2. Cryo-EM datainsamling
    OBS: JEM2100-LaB6 (år 2010) är utrustad med en TEMCON operativsystem som består av en dator som är ansluten till ett elektronmikroskop, en skärm med fönster läsning vakuumsystemet, belysningssystem, HT, lins strömmar och så vidare, och två paneler till höger och vänster, placerade på båda sidor av pelaren. Strålen skift X, Y-rattarna (SHIFT Y, sikta Y) och den multifunktionella (DEF / STIG) rattar finns på båda panelerna. På den vänstra panelen är belysningen (BRIGTHNESS) ratt. På den högra panelen är: förstoringen (MAG / CAM LÄNGD) och fokus (FOCUS) rattar och tre imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) och diffraktion (DIFF) lägen knapparna. Vi förvärvar våra data i MAG1 på alfa 2. Minimi dos belysningsförhållanden (MDS) som krävs för Cryo-EM datainsamling ställs in med tangenterna F1 till F6 knappar, översta raden på högra panelen. I detta protokoll de generiska inställningar används: F1 - höja / sänka skärmen, F2 - SEARCH, F3 - FOCUS läge, F4 - FOTO läge, F5 - MDS AV / PÅ och F6 - balkämne, som används för att skydda provet från strålning skada genom att böja strålen.
    1. Placera Cryo-hållaren i kryo-stationen och fylla Dewar i hållaren och kryo-station med LN2. När temperaturen når -192 ° C, öppen slutare på hållaren spets, plats tidigare frysta Cryo-EM rutnät på anvisad plats och säkra med en ringklämma.
    2. Sätt i Cryo-hållaren i elektronmikroskop. Fyll på Dewar av Cryo-hållaren och anti contaminator kammare med LN2. Vänta tills innehavaren att stabiliseras under 30-60 min. Tryck på F6 om ochvända filamentet på. När glödtråden är mättad, trycker du på F6 och öppna slutaren på innehavaren att visa rutnätet.
    3. Tryck på Låg Mag / alfa 1 (inställd på 200X mag) och lokalisera områden med tunn is på nätet.
    4. Byt till MAG 1/alpha 2 för att ställa in minsta dos (MDS) läge och förvärva Cryo-EM uppgifter vid låga elektron doser, utan att skada provet.
      1. Tryck på F2 för att ställa in sökläget. Ställ in förstoringen på 40.000 x. Förstora balk med brigtness vredet till minimal elektron dos ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Tryck DIFF att växla till diffraktion läge. Ställ kamerans längd till 120 cm med MAG / CAM LÄNGD ratten. Leta områden på nätet inom de förvalda områdena i LOWMAG som har lipid nanotuber i hålen i kolfilmen.
      2. Tryck F4 för att ställa in läget Foto vid 40.000 X förstoring och sätta belysning med BRIGHTNESS knopp vid doser om 16-25 e - / A 2-s. Tryck på Standard Focus för att ställa in fokus förhållanden justera Z-höjdav provet med Z UPP / NER (HÖGER kontrollpanelen). Ställ defocus mellan -1,5 och -2,5 um.
      3. Rikta SEARCH och PHOTO-läge genom att rita en kvadrat på direktvisningsfönstret på den digitala kamerans monitor i SEARCH-läge som motsvarar det område som ska avbildas i fotoläge.
      4. Tryck på F3 för att ställa in fokusläge vid 100.000 gångers förstoring. Fokus belysning för att täcka CCD-chip (~ 4-5 cm radie) och av axeln att inte bestråla det område som ska avbildas i fotoläge. Justera defocus till ~ -1,5 och -2,5 um med FOCUS-ratten och korrigera för astigmatism av bilden med DEF / STIG rattar.
    5. Välj FVIII-LNT att avbildas i SEARCH-läge genom att förvärva livebilder på direktvisningsfönstret på den digitala kamerans monitor. Centrera FVIII-LNT på torget dras på LIVE VIEW fönstret.
    6. Spela in en digital bild på CCD-kamera vid 52.000 X effektiv förstoring och 0,5 sek exponering genom att växla till läget Foto och klicka på förvärE-knappen på den digitala mikroskop kamerans monitor. De bildförvärvs villkor anges såsom balk tomt (SHUT) öppen endast när bilden förvärvas i FOTO-läge.
    7. Kontrollera kvaliteten och minskad fokus på den förvärvade bilden genom att trycka på Ctrl-F för att få en Fast Fourier Transform (FFT).

3. 3D-rekonstruktion

OBS: bildanalys programvara som används för 2D-och 3D-analys: EMAN2 och IHRSR är fritt tillgängliga. EMAN2 kan laddas ner från http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Den IHRSR programvara kan erhållas från professor Egelman: egelman@virginia.edu. De slutliga IHRSR förbättringar körs på Texas Advanced Computing centerkluster: http://www.tacc.utexas.edu/ vid University of Texas, Austin. 3D-rekonstruktion algoritmen visas i figur 1 består av två steg: Först väljer en homogen uppsättning spiralformade segment (partiklar) med 2D referens fri alignment (RFA) algoritmer implementeras i EMAN 2, andra uppnå en 3D-rekonstruktion bygger på de spiralformade parametrar och back projektion algoritmer som ingår i IHRSR. Det första steget utnyttjar de program som utvecklats för att välja homogena partikelmängder för 3D-rekonstruktion med Single Particle SPA (algoritmer) för vilka EMAN2 har särskilt utvecklats och distribueras: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Detta steg har anpassats till Cryo-EM uppgifter. Det andra steget uppnås med IHRSR algoritmen, som är speciellt utformad för den typ av spiralformade aggregat som erhållits med de rekombinanta Faktor VIII former. Denna algoritm har dokumenterats utförligt igenom den vetenskapliga litteraturen 12.

  1. Utför 2D bildanalys med EMAN2 vetenskapliga bildbehandlings svit: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 att välja homogen partikel (spiralformade segment) satser för spiral rekonstruktion.
    1. Välj Cryo-EM mikrografer med straight och välorganiserad spiralformade rör med den digitala kameran mjukvara och visualiseringsverktyg.
    2. Invert, normalisera och filtrera för röntgen pixlar i e2workflow.py GUI, enda partikel rekonstruktion (SPR) alternativ: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Importerar de inverterade, normaliserade och röntgen pixel filtrerade bilderna i e2helixboxer.py GUI. Välj FVIII-LNT spiralformade rör och segment på 256 x 256 pixlar (2,9 Å / pix) med 90% överlappning med: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Utvärdera minskad fokus från den ursprungliga mikrofotografier och tillämpa kontrastöverföringsfunktionen (CTF) korrektion (endast fas korrigering) till de spiralformade segment från samma mikrofotografier med e2ctf.py alternativet ingår i e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Generera initiala partiklar (spiralformade segment) sätter i e2workflow.py GUI - SPR alternativ: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Beräkna 2D genomsnitt klass med e2refine2d.py algoritmen tillämpa referens gratis k-mean klassificering för att välja homogena datamängder med LNT och graden av spiral ordning (Figur 2) samma diameter, efter manus: "e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - input = INPUT.hdf - NCLS = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fas - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = medelvärde - normproj-classkeepsig ", ändra NCLS värdet därefter.
      1. Klassificera de ursprungliga datamängden i 150 klassers NCLS = 151 'över 8 iterationer med' classkeep = 0,8 ', vilket innebär att partiklar med mindre än 80% likhet med den genomsnittliga klassen ingår inte i den givna klassen. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Slå ihop partiklar från medelvärden klassmed uttalad spiral diffraktion i e2display.py att skapa mellan datamängd.
      3. Klassificera de mellanliggande datamängden i 50 klassers NCLS = 51 "för att skilja klasser med samma diameter och grad av ordning.
      4. Slå ihop partiklar från klasser med samma diameter och grad av ordning i e2display.py att skapa den slutliga datauppsättning för den tredimensionella rekonstruktionen: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Utför spiralformig rekonstruktion med Iterativ Helical Real Space återuppbyggnad (IHRSR) algoritm, såsom beskrivits i Egelman 17, 18.
    1. Uppskatta uppgång, Az (Å) av faktor VIII-LNT helix från den kombinerade Fouriertransformen av partiklarna i den slutliga datamängden.
    2. Definiera azimutvinkeln ΔΦ (º) genom att köra parallella IHRSR finesser med en konstant Az, ökar ΔΦ från 576; till 60 ° i steg om 5 °.
    3. Springa 100 konsekutiva IHRSR cykler för varje finaldatauppsättning med en odefinierbar cylinder som en första volym och de första spiral parametrarna Az och ΔΦ enligt definitionen i 3.2.1. och 3.2.2.
    4. Inspektera de slutliga volymerna för konvergens av de spiralformade parametrar och korrespondens mellan klassgenomsnitt från 2D-klassificeringen av den slutliga datamängden och prognoserna från den slutliga IHRSR rekonstruktion.
    5. Införa symmetri av den slutliga 3D rekonstruktioner, som motsvarar den asymmetriska enheten fördelning observerades i de slutliga asymmetriska 3D-volymer: 4-faldig för den humana faktor VIII-LNT och 5-faldig för den porcina faktor VIII-LNT. Kör ytterligare 100 förfining cykler för att skapa en slutlig symmetrized 3D-rekonstruktion.
    6. Beräkna Fourier Shell Korrelation kurvan för båda volymerna den genom att först separera motsvarande uppgifter som i udda och jämna: "e2proc2d.py <infile> <outfile> - split = 2 '. Kör sedan 100 IHRSR förfiningar i följd som beskrivs i 3.2.3. Beräkna FSC av 3D-volymer som skapas från de udda och jämna dataset: "e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc '.
  3. Visualisera och Segment de FVIII-LNT volymer i UCSF chimär.
    1. Öppna de slutliga volymerna från steg 3.2.5. i UCSF Chimera och ställa konturen nivån till 0,005 i TOOLS> VOLYM DATA> Volume Viewer alternativ.
    2. I VERKTYG> VOLYM DATA> SEGMENT MAP väljer volym i SEGMENT kartfliken och klicka på segment till segment volymen.
    3. Koncernens segment som motsvarar en enhet cell genom att välja med CTRL + SKIFT och klicka grupp.
    4. Färglägg segmenten av enhetscell och helix med ÅTGÄRDER> COLOR möjlighet att betona de strukturella drag.

4. Elektrontomografi

  1. Negativt färgad FVIII-LNT Provberedning
      <li> Förbered FVIII-LNT prover för Cryo-EM experiment.
    1. Glow urladdar 300-mesh koppargaller kolbelagda (kol sidan uppåt) i en blandning av O2 och H2-gas under 10 sek vid 50 W som för Cryo-EM experiment.
    2. Applicera en droppe av 2,5 pl FVIII-LNT fjädring med 6 nm kolloidalt guld nanopartiklar till nätet, blot överflödig vätska och negativt fläckar genom att tillämpa 5 l 1% AUC acetat lösning i 2 min. Blot överskott av vätska och lufttorka rutnätet.
  2. Elektrontomografi datainsamling
    1. För över gallret i den inre tilthållaren.
    2. För över hållaren i elektronmikroskop.
    3. Samla lutning serien automatiskt med SerialEM programvara 19 vid 2 ° steg över ett vinkelområde på -60 ° till +60 ° och spela in bilder med en CCD-kamera på 52.000 X effektiv förstoring, -6 till -10 um defocus och elektron dos av 150 - 170 electrons / Å 2 · s per tomogram.
  3. Elektrontomografi Rekonstruktion av FVIII-LNT
    Notera: Rekonstruera pFVIII-LNT och hFVIII-LNT lutas serien förvärvas 4.2. med möjlighet för IMOD programvara ETomo efter handledningen: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Med hjälp av ett terminalfönster, öppna tomogram i 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin den tomogram med 4 med IMOD BINVOL kommandot för att minska storleken på tomogram.
    3. Välj korrekt vinkel för att rotera lipid nanorör längs Y-axeln i binned tomogram med kommandot IMOD ROTATEVOL.
    4. Rotera fullständig tomogram med kommandot IMOD ROTATEVOL.
    5. Crop utvald lipid nanotube orienterade längs Y-axeln med IMOD CLIP ÄNDR kommandot.
    6. Öppna den beskurna under tomogram med 3DMOD.
    7. Klicka på tomogram att visualisera placeringen av faktor VIII-molekyler tillsammansskivorna i Z-axeln och längs Y-axeln i sub-tomogram volym.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rekombinant humant och svin FVIII framgångsrikt organiserade spiral på negativt laddade enda dubbelskikts LNT, liknar ytan aktiverade trombocyter. Helix organisation av det mänskliga och svin FVIII-LNT var konsekvent genom de insamlade digitala mikrofotografier (Figur 2). Kontroll LNT och människan och svin FVIII-LNT spiralformade rör valdes ut och segmente med e2helixboxer.py GUI och initiala datamängder som skapas med e2workflow.py GUI, alternativet Single partikel (Tabell 1).

Den spiralformade ordningen för membranbunden human och porcin faktor VIII-LNT utvärderades från Fouriertransformen av klass medelvärden med e2display.py GUI (EMAN2) (Figur 3). Membranet i bästa kontroll LNT genomsnitt 2D-klass är väl definierad. Den inre och den yttre bipacksedel och lägre densitet av membranet hydrofob kärna är klart synliga ( (fig. 3B och 3C). Ju mer uttalad vridning för de humana FVIII-LNT spiralformade rören indikerar att protein-proteininteraktioner mellan intilliggande membranbundna FVIII-molekyler är konsekvent olika för de två FVIII-former (fig. 3B och 3C). Partiklar från klassgenomsnitt visar god spiral organisation (spiral diffraktionsmönster) slogs samman i e2display.py GUI för att bilda en intermediär partikel set (Tabell 1). Partiklarna från de mellanliggande partikel sätter åter klassificeras i 50 klasser med samma begränsningar. Partiklarna från medelvärden klass med samma diameter slogs samman i den slutliga uppgifteruppsättningar (tabell 1).

De första 3D-rekonstruktioner för människa och svin FVIII-LNT fördes med 1.000 representativa partiklar från sista människa och svin FVIII-LNT datamängder. Hundra konsekutiva IHRSR iterationer kördes för varje 3D-rekonstruktion med en odefinierbar cylinder (160 Å inre och 500 Å ytterdiameter), som ursprungliga volymen. Den axiella uppgång (Az) beräknas utifrån den sammanlagda Fouriertransformen av de spiralformade segment (partiklar som) är lika med 41 Å för human FVIII-LNT och 36 Å för svin FVIII-LNT (figur 4A och 4B). Den initiala azimutvinkel (ΔΦ) definieras från iterativ uppskattas till 40,0 ° för den mänskliga faktor VIII-LNT och vid 35,0 ° för svin FVIII-LNT. De slutliga volymerna inspekteras för konvergens av de spiralformade parametrar och korrespondens mellan klassgenomsnitt och prognoser från den slutliga Reconstruktion, även efter de kriterier som beskrivs i 5. De valda 3D rekonstruktioner och motsvarande spiral parametrar införs som initiala volymer och initiala spiral parametrar för en andra IHRSR förfining av 100 cykler som konvergerade till en fyra-start spiral organisation för mänskliga FVIII-LNT med Az = 41,1 Å och ΔΦ = 42,0 ° och en fem-start spiral organisation för svin FVIII-LNT med Az = 35,5 Å och ΔΦ = 34,8 °. En sista 100 IHRSR iterationer införande av en 4-faldig och en 5-faldig spiral symmetri för människan och svin FVIII-LNT rekonstruktioner respektive genomförs med inledande volymer och motsvarande spiral parametrar från de sista asymmetriska IHRSR förbättringar (figur 4C och 4D). De slutliga volymerna visar 8 human FVIII och 10 svin FVIII membranbundna molekyler som organiseras kring spiralaxeln (Figur 5A). Varje mänskligFVIII-molekylen translateras 41,2 Å och roteras 42,0 ° från den föregående och varje porcin FVIII-molekylen translateras 35,9 Å och roteras 35,2 ° från den tidigare, som motsvarar de spiralformade parametrar från de färdiga 3D rekonstruktioner (figur 5B).

De rekonstruerade elektron tomogram bekräftar skillnaden i den spiralformade organisationen mellan människa och svin FVIII-LNT inhämtats under samma försöksbetingelser. Jämförelse av de bästa utsikt från rekonstruerade tomogram och 3D-volymer från den spiralformade rekonstruktion ses i riktning vinkelrätt mot spiralaxeln, validerar vidare riktigheten av de 3D-rekonstruktioner raffinerade med IHRSR spiral parametrarna (Figur 6). De asymmetriska 2D enhetscelldimensioner för den humana faktor VIII-LNT 3D-rekonstruktion är följande: a = 17,8 nm, b = 8,2, γ = 84 ° och för den porcina faktor VIII-LNT 3D-rekonstruktion: a =18,4, b = 7,2 och γ = 70 ° (Figur 6). De enhetscelldimensioner av human FVIII anordnas i membranbundna 2D kristaller är: a = 8,1, b = 7,0 och γ = 67 °, vilket motsvarar den yta som täcks av en FVIII-molekyl sedda mot membranytan 20. Jämföra enhetscelldimensioner mellan FVIII organiserade i 2D och spiralformade kristaller visar att både människa och svin FVIII molekyler bildar dimerer när spiral organiseras på LNT ytan.

Figur 1
Figur 1. Strukturanalys flödesschema. Stegen följde för klassificering analys 2D baserad på referens gratis inriktningsalgoritmer som genomförts i EMAN2 16 är inringade i blått. De steg följas för 3D-analys som genomförts med den iterativa spiral real space rekonstruktionsalgoritmer (IHRSR) är inringad i rött. Den iterativa IHRSR cykler betecknas med streckade pilar.

Figur 2
Figur 2. Cryo-EM digitala mikrofotografier. (4096 x 4096 pixlar, 2,9 Å / pix) av lipid nanorör (LNT) med och utan bunden FVIII. A. Kontroll LNT. B. Human FVIII-LNT. C. Svin FVIII-LNT . I kanten av hålet i kolfilmen där FVIII-LNT suspenderas i amorf is indikeras med en vit stjärna. De protein och lipid tätheter är i svart. Den förstorade vyer (sätter in) av 512 x 512 beskurna områden (vitt streckad fyrkant) visar skillnaden i den spiralformade organisationen av human och porcin faktor VIII, respektive. Skalan bar är 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Representant 2D klass medelvärden (övre raden) och motsvarande Fouriertransformer (nedre raden) från mellanpartikelmängder (tabell 1) indelas i 50 klasser. A. Kontroll LNT B. Human FVIII-LNT C. Svin FVIII-LNT. Klassnummer och antalet partiklar som ingår i varje klass anges. Skillnaden i spiral ordning mellan det mänskliga och svin FVIII syns tydligt på bilderna och bekräftats av diffraktionsmönstren erhållits från Fouriertransformer av dessa bilder. Klicka här för att se enstörre version av denna figur.

Figur 4
Figur 4. 3D spiral rekonstruktioner av mänskliga och svin FVIII-LNT. A. Kombinerad Fouriertransform från 1.000 spiralformade segment. Den första och andra lagret linje är centrerade vid 1/82 A -1 och 1/41 A -1 för human FVIII-LNT, och vid 1/72 A -1 och 1/36 A -1 för svin FVIII-LNT (vit pilar). B. Yta representation av människa i rosa (Az = 41,1 Å, ΔΦ = 42,0 º) och svin i blått (Az = 35,9 Å, ΔΦ = 35.2 º) FVIII-LNT 3D spiral rekonstruktioner. Båda volymerna presenteras på 0,005 konturnivå (minsta densitet är 0 och maximal densitet 0,02, beräknat i UCSF Chimera, Volume Viewer alternativ 21). Längden på FVIII-LNT röret är 256 pixlar på 2,9 Å / pix. C. Fourier Shell Korrelation (FSC) tomter för människa och svin FVIII-LNT visar en upplösning på 20,5 Å på FSC = 0,5.

Figur 5
Figur 5. Spiral organisation av människor och svin FVIII-LNT. Segmenterad yta representation av mänskliga och svin FVIII-LNT spiral rekonstruktioner, som visas i figur 4B. Volymerna segmenteras efter att införa 4-faldig symmetri till den mänskliga faktor VIII-LNT och 5-faldig symmetri till svin FVIII-LNT. De asymmetriska enheter är färgkodade gul-röd för den mänskliga faktor VIII-LNT och blågröna för svin FVIII-LNT. A. vyer längs spiralaxeln indikeras med en fyrkant för människan och somen femhörning för den porcina faktor VIII-LNT. Den mänskliga faktor VIII-LNT struktur visar 8 molekyler organiseras runt den yttre LNT membranet och svin FVIII strukturen visar 10 molekyler organiseras runt den yttre LNT membranet, anges med siffror. B. Utsikt vinkelrätt mot spiralaxeln. Den mänskliga faktor VIII-LNT är en 4-start spiralstrukturen och svin FVIII-LNT är en 5-start spiralstruktur. De individuella en start helixar är indikerade med siffror och färgkodade. Vi har betonat en av spiralerna från varje struktur med en (*) och gröna linjer. Skalan bar är 20 nm.

Figur 6
Figur 6. Jämförelse mellan de spiralformade och tomografi 3D rekonstruktioner. Den mänskliga faktor VIII-LNT (A) och svin FVIII-LNT (C) spiral 3D rekonstruktioner visas gärningsmanndicular till den spiralformade axeln. Varje enhet cell och enskilda helixar är färgkodade enligt figur 5. B. och D. är densitets representationer av 3D-tomografi rekonstruktioner, sett vinkelrätt mot spiralaxeln. 2D-gitter som återspeglar den spiralformade arrangemanget av FVIII molekylerna visas med gröna linjer.

PROVER CLNT hFVIII-LNT pFVIII-LNT
Initiala Micrographs 61 474 542
Initiala Partikel uppsättningar 29113 60395 64665
Defocus (nm) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3443 ± 1086
Mellanliggande Partikel uppsättningar 25907 27305 22773
Slutliga partikelmängder 25907 10455 10430

Tabell 1. 2D analysstatistik följande algoritmen presenteras i flödesschemat i figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete en metod presenteras för att skilja mellan två membranbundna organisationer av mycket homologa proteiner: mänskliga och svin FVIII själv monterade på lipid nanotuber i villkoren som uppstått i den mänskliga kroppen.

I det beskrivna förfarandet, är mänsklig och svin FVIII framgångsrikt organiserat spiral på lipid nanorör, som är det mest kritiska steget. Nästa viktiga steg är att bevara provet i tunn amorf is genom snabb frysning på nära flytande N 2 temperatur. Bevara provet i amorf is och LN2 temperaturen håller spiralrören hydrerad och protein-lipid makromolekylära församlingar fysiologiskt aktiv. Den sista kritiska steget förvärvar Cryo-EM uppgifter av tillräcklig kvantitet och kvalitet för en högupplöst 3D-struktur vid nära LN2 temperatur. Samla in data vid nära LN2 temperaturen ytterligare förhindrar uttorkning av provet i hög vacuum av mikroskopet och strålningsskada från elektronstrålen.

För att beräkna den membranbundna strukturen av FVIII det första kritiska steget är att erhålla homogena partiklar (spiralformiga segment) uppsättningar genom att applicera 2D referens fri klassificering och kombinera partiklar från klasser med samma diameter och grad av ordning. Det andra viktiga steget är att införa rätt ursprungliga volymen och spiral parametrar (uppgång och azimutvinkel) för spiraluppbyggnaden. Den tredje och sista kritiska steget är att validera den spiralformade strukturen genom att jämföra 3D-kartor som erhållits genom den spiralformade och elektron tomografi (utan åläggs symmetri) rekonstruktioner av samma prov.

Den presenterade metoden är unik i sin förmåga att lösa den funktionella strukturen hos membranassocierade proteiner vid nära fysiologiska betingelser. Den LNT utvecklats i vårt laboratorium kan varaframgångsrikt använts som en plattform för spiral organisation av funktionella membranbundna blodkoagulationsfaktorer och uppnå bättre upplösning än för FVIII organiserade i membranbundna 2D-kristaller och som enskilda partiklar. Vårt mål är att ytterligare öka upplösningen på våra spiral rekonstruktioner genom att förbättra homogeniteten och kvaliteten på den slutliga partikelmängder. Samla fler Cryo-EM mikrofotografier på bättre Cryo-EM villkor (fältemissions pistol, energi-filter, DE kameradetektorer) av faktor VIII-LNT spiralformade filament och därmed även större initiala partikelmängder för 2D uppbyggnaden kommer att uppnå detta. Förbättring av FVIII-LNT spiral montering och 3D-rekonstruktion algoritmer ger oss möjlighet att få sub-nanometer och nära atomär upplösning, som entydigt definierar membranbundna organisation av denna kritiska för blodkoagulering protein.

Organisera spiral homologa FVIII former ger oss också möjligheterty för att karakterisera hur skillnaden i sekvens kan korrelerar till skillnader i struktur och funktion. Att lösa de mänskliga och svin FVIII membranbundna strukturer genom de metoder som beskrivs i den här artikeln kan hjälpa till att identifiera de sekvenser, som då ändrade förbättrar rekombinanta faktor VIII-funktionen. Denna kunskap kommer att få betydande kliniska implikationer för läkemedelsutveckling både Trombos och hemostas fält.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har något att konkurrera ekonomiskt intresse och de kan kontaktas direkt om någon av åtgärderna som publiceras i detta manuskript.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av ett bidrag från American Heart Association National Scientist utveckling: 10SDG3500034 och UTMB-NCB starta fonder till SSM. Författarna erkänner de Cryo-EM och beräkningsvetenskap faciliteter på Sealy Centrum för strukturbiologi vid UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), samt Dr. Steve Ludtke och Ed Egelman om hjälp med 2D-och 3D spiralrekonstruktionsalgoritmer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics