Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

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Bioengineering

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Summary

Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben.

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Miller, J., Dalm, D., Koyfman, A. Y., Grushin, K., Stoilova-McPhie, S. Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes. J. Vis. Exp. (88), e51254, doi:10.3791/51254 (2014).

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Abstract

Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) 1 ist ein leistungsfähiges Konzept für die funktionale Struktur von Proteinen und Komplexen in einem hydratisierten Zustand und 2 Membranumgebung zu untersuchen.

Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) 3 ist ein Multi-Domain-Blutplasma-Glykoprotein. Defekt oder Mangel an FVIII ist die Ursache für Hämophilie Typ A - eine schwere Blutgerinnungsstörung. Nach der proteolytischen Aktivierung bindet FVIII an den Serin-Protease Faktor IXa auf der negativ geladenen Plättchenmembran, die entscheidend für die normale Blutgerinnung 4 ist. Trotz der zentralen Rolle spielt in FVIII-Koagulation, Strukturinformationen für die Membran-gebundenen Zustand ist unvollständig 5. Rekombinanten FVIII-Konzentrat ist das wirksamste Medikament gegen Hämophilie Typ A und im Handel erhältlichen FVIII als menschliche oder Schweine, beide bildende funktionelle Komplexe mit menschlichem Faktor IXa 6,7 ausgedrückt.

"> In dieser Studie stellen wir eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), angewandte Nanotechnologie Lipid-und Strukturanalyse, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen:. Mensch und Schwein Die in unserem Labor entwickelte Methodik schraubenförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT) beschrieben. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass unser Ansatz ist empfindlich genug, um die Unterschiede in der Schrauben Organisation zwischen den beiden hoch homolog in Folge (86% Sequenzidentität zu definieren )-Proteine. Detaillierte Protokolle für die Schrauben Organisation Kryo-EM und Elektronentomographie (ET) Datenerfassung werden. Die zweidimensionale (2D angegeben) und dreidimensionale (3D) Struktur-Analyse angewendet, um die 3D-Rekonstruktionen von Mensch und Schwein erhalten FVIII-LNT wird diskutiert. Die vorgestellten Mensch und Schwein FVIII-LNT Strukturen zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Methodik zur kalkulierte die funktionale, membrangebundene Organisation von Blutgerinnungsfaktor VIII bei hoher Auflösung.

Introduction

Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) ist ein großes Glykoprotein von 2.332 Aminosäuren in sechs Bereiche unterteilt: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Thrombin nach Aktivierung FVIII wirkt als Cofaktor, Faktor IXa in der Membran-gebundenen Tenasekomplex. Die Bindung von FVIII aktiviert (FVIIIa) zu FIXa in einer Membran-je nach Art und Weise verbessert FIXa proteolytischen Effizienz von mehr als 10 5-fache, die entscheidend für die effiziente Blutgerinnung 4 ist. Trotz der wichtigen Rolle FVIII spielt bei der Koagulation und der Tenasekomplexes Bildung, noch die funktionelle Membran-gebundenen FVIII-Struktur gelöst werden.

Um dies zu beheben, haben einzelne Lipid-Doppelschicht-Nanoröhren (LNT) reich an Phosphatidylserin (PS), die zur Bindung FVIII mit hoher Affinität 8, 9 und die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnlich entwickelt worden 10. Aufeinanderfolgende spiralförmigen Organisation von FVIII zu LNT gebunden ist erwiesen, wirkungs zu seinve für die Strukturbestimmung von FVIII-Membran-gebundenen Zustand von Cryo-EM-5. Funktionalisierten LNT sind ein ideales System, um Protein-Protein-und Protein-Membran-Wechselwirkungen von spiralförmig organisierten Membran-assoziierten Proteinen, die durch Kryo-EM 11, 12 zu untersuchen. Kryo-EM hat den Vorteil gegenüber herkömmlichen Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie und NMR, als die Probe in der Nähe des physiologischen Umgebung (Puffer, Membran-pH-Wert) erhalten, ohne Additive und Isotope. Im Fall von FVIII, die Untersuchung der Membran-gebundenen Struktur mit dieser Technik ist noch physiologisch relevant, da die LNT ähneln eng durch Größe, Form und Zusammensetzung der Pseudopodien der aktivierten Thrombozyten, wo die Komplexe Tenase Zusammenbau in vivo.

Mängel und Mangel an FVIII Ursache Hämophilie A, einer Erkrankung, die schwere Blutungen 1 in 5.000 Männern der menschlichen Bevölkerung 4, 6. Die meisten Eirksame Therapie für Hämophilie A ist lebenslange Verabreichung von rekombinantem humanem FVIII (hFVIII). Eine signifikante Komplikation des rekombinanten FVIII-Hämophilie-A-Therapie ist die Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern gegen den menschlichen Form, die bei etwa 30% der Patienten mit Hämophilie A 13. In diesem Fall wird Schweine-FVIII (pFVIII) Konzentrat verwendet, wie Schweine-FVIII-Displays geringe Kreuzreaktivität mit inhibitorische Antikörper gegen menschliches FVIII und Formen funktionalen Komplexen mit menschlichen FIXa 7. Gründung der membrangebundene Organisation von sowohl Schweine-und Menschen FVIII Formen ist wichtig, die strukturelle Basis von FVIII-Cofaktor-Funktion und Auswirkungen auf Blut Blutstillung zu verstehen.

In dieser Studie beschreiben wir eine Kombination von Lipid Nanotechnologie, Cryo-EM-und Strukturanalyse entwickelt, um die membrangebundene Organisation von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen. Die vorgestellten Cryo-EM-Daten und 3D-Strukturen für spiralförmig organisiert porcine und Menschen FVIII auf negativ geladenen LNT zeigen das Potenzial der vorgeschlagenen Nanotechnologie als Grundlage für die Strukturbestimmung von FVIII und Membran-gebundenen Gerinnungsfaktoren und Komplexe in einer physiologischen Membranumgebung.

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Protocol

1. Probenvorbereitung

  1. Pufferaustausch menschlichen FVIII-BDD 14 und Schweine-FVIII BDD 15 gegen HBS-Ca-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH = 7,4) und konzentriert, um 1,2 mg / ml. Halten der Proteinlösung bei -80 ° C.
  2. Vorbereitung Lipidnanotubes (LNT) durch Mischen Galactosylceramid (GC) und Phosphatidylserin (PS) bei 1.04 w / w-Verhältnis in Chloroform. Verdampfe das Chloroform unter Argon und Solubilisierung der Lipide in HBS-Puffer auf 1 mg / ml. Halten Sie die LNT-Lösung bei 4 ° C

2. Kryo-Elektronenmikroskopie von FVIII-LNT

  1. Cryo-EM Probenvorbereitung
    1. Glimmentladung das 300 mesh Quantifoil R2 / 2 Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W.
    2. Mischen der FVIII und LNT Lösungen in HBS-Ca-Puffer im Verhältnis 1:1 w / w-Verhältnis und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
    3. Geben Sie einen Tropfen 2,5 ulFVIII-LNT Probe auf die hydrophilen Rasterelektronenmikroskopie im Vitrobot Mark IV befeuchteten Kammer (100% Luftfeuchtigkeit).
    4. Blot und Flash einfrieren das Raster (ein Blot für 3,5 sec, tupfen Kraft 1) in flüssiger C 2 H 6, abgekühlt durch flüssige N 2 zu amorphem Eis zu erhalten.
    5. Shop Netze in Lagerboxen unter flüssigem N 2 (LN2).
  2. Cryo-EM Data Collection
    HINWEIS: Die JEM2100-LaB6 (Jahr 2010) wird mit einem TemCon Betriebssystem, bestehend aus einem Computer mit dem Elektronenmikroskop, einem Bildschirm mit Fenstern Lesen der Vakuumanlage, Beleuchtungssystem, HT, Linsenströme und so weiter, und zwei miteinander verbundene ausgestattet Platten: links und rechts, auf beiden Seiten der Säule befindet. Die Strahlverschiebung X-, Y-Knöpfe (SHIFT Y, Y SIFT) und das Multifunktionsgerät (DEF / STIG) Knöpfe sind auf beiden Platten. Auf der linken Seite ist die Beleuchtung (Brigthness) Knopf. Auf der rechten Seite sind: die Vergrößerung (MAG / CAM-Länge) und Fokus (FOCUS) und die drei Knöpfe imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) und ein Beugungs Modi-Tasten (DIFF). Wir erwerben unsere Daten in MAG1 bei alpha 2. Die Mindestdosis Beleuchtungsbedingungen (MDS) für Kryo-EM Datenerfassung erforderlich sind mit F1 bis F6-Tasten, obere Reihe auf der RECHTEN Bedienfeld einstellen. In diesem Protokoll die allgemeinen Einstellungen werden verwendet: F1 - heben / senken Bildschirm, F2 - SEARCH-Modus, F3 - FOCUS Modus F4 - FOTO-Modus F5 - MDS OFF / ON und F6 - BEAM BLANK, verwendet, um die Probe von der Strahlung abschirmen Schäden, die durch Ablenken des Strahls.
    1. Legen Sie die Kryo-Halter in die Kryo-Station und füllen Sie den Dewar des Halters und der Kryo-Station mit LN2. Wenn die Temperatur erreicht -192 ° C, offener Blende am Halter Spitze, Platz vorher eingefroren Cryo-EM Gitter in die vorgesehene Stelle und mit einem Klemmring.
    2. Legen Sie die Kryo-Halter in das Elektronenmikroskop. Füllen Sie den Dewar der Kryo-Halter und dem Anti-contaminator Kammer mit LN2. Warten Sie, bis der Halter für 30-60 min zu stabilisieren. Drücken Sie F6 auf unddrehen Sie den Faden auf. Wenn der Faden gesättigt ist, drücken Sie F6 aus und offener Blende auf Halter, um das Raster zu sehen.
    3. Presse Low Mag / alpha 1 (bei 200X mag eingestellt), und suchen Bereiche mit dünnen Eis auf dem Netz.
    4. Wechseln Sie zu MAG 1/alpha 2 bis Mindestdosis (MDS) eingestellt und Cryo-EM-Daten zu erwerben bei niedrigen Elektronendosen, ohne Beschädigung der Probe.
      1. Drücken Sie F2, um den Suchmodus eingestellt. Stellen Vergrößerung bei 40.000 x. Vergrößern Strahl mit brigtness Knopf, um minimale Elektronendosis ~ 0,04 E - / Å 2 · s. Presse DIFF zu Beugungsmodus zu wechseln. Stellen Sie die Kamera auf 120 cm Länge mit MAG / CAM LÄNGE Knopf. Suchen Flächen auf dem Gitter in den vorgewählten Bereichen in LOWMAG die Lipid-Nanoröhren in den Löchern des Kohlenstofffilms haben.
      2. Drücken Sie F4, Foto-Modus bei 40.000-facher Vergrößerung eingestellt und stellen Sie Beleuchtung mit Helligkeitsknopf in Dosen von 16 bis 25 E - / Å 2 · s. Standard-Fokus-Taste drücken, um den Fokus Bedingungen eingestellt Einstellung der Z-Höheder Probe mit der Z-UP / DOWN-Tasten (rechts-Bedienung). Unschärfe-Set zwischen -1.5 und -2.5 um.
      3. Richten Sie SEARCH und Fotomodus, indem ein Platz in der LIVE-VIEW-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor im Suchmodus entsprechend den in PHOTO-Modus abgebildet werden.
      4. Drücken Sie F3, um Fokusmodus bei 100.000-facher Vergrößerung eingestellt. Fokus Beleuchtung, um die CCD-Chips decken (ca. 4 - 5 cm Radius) und von der Achse, um die Gegend in PHOTO-Modus abgebildet werden nicht bestrahlen. Stellen Defokus auf ~ -1.5 -2.5 und um mit dem FOCUS-Knopf und korrigieren Astigmatismus des Bildes mit DEF / STIG Knöpfe.
    5. Wählen Sie das FVIII-LNT im SEARCH-Modus durch den Erwerb von Live-Bildern in der Liveansicht-Fenster auf dem Digitalkamera-Monitor abgebildet werden. Zentrieren Sie die FVIII-LNT auf dem Platz auf der Live-View-Fenster gezogen.
    6. Nehmen Sie ein digitales Bild auf der CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung und 0,5 sec Belichtungs durch Umschalten in den Fotomodus und auf die AcquirE-Taste auf der digitalen Kamera-Aufnahme-Monitor. Die Bildaufnahmebedingungen sind wie die Beam-Blank (TERS) öffnen sich nur, wenn das Bild im Foto-Modus erworben gesetzt.
    7. Prüfen Sie die Qualität und Defokussierung des aufgenommenen Bildes durch Drücken von STRG-F zu erhalten, eine Fast-Fourier-Transformation (FFT).

3. 3D-Rekonstruktion

HINWEIS: Die Bildanalyse-Software für die 2D-und 3D-Analyse verwendet: EMAN2 IHRSR und sind frei verfügbar. EMAN2 aus http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install heruntergeladen werden. Egelman@virginia.edu: Die IHRSR Software kann von Professor Egelman erhalten werden. Die endgültigen IHRSR Weiterbildungen sind auf der Texas Advanced Computing Center laufen Cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ an der Universität von Texas, Austin. Die in Fig. 1 dargestellte 3D-Rekonstruktionsalgorithmus besteht aus zwei Schritten: zuerst einen homogenen Satz von helikalen Segmenten (Partikel) mit dem 2D-freien Referenz alignmein EMAN 2 nt (RFA) Algorithmen implementiert, die zweite Erreichen einer 3D-Rekonstruktion auf der Grundlage der Wendel Parameter und Rückprojektionsalgorithmen in IHRSR eingebaut. Der erste Schritt für die Auswahl nutzt die homogene Partikelmengen für die 3D-Rekonstruktion mit Single Particle SPA (Algorithmen), für die EMAN2 wurde speziell entwickelt und vertrieben entwickelten Programme: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Dieser Schritt wurde den Cryo-EM-Daten angepasst. Der zweite Schritt wird mit dem IHRSR Algorithmus, der spezifisch für die Art der Schraubenanordnungen mit den rekombinanten Faktor VIII-Formen erhalten gestaltet erreicht. Dieser Algorithmus ist weitgehend durch die wissenschaftliche Literatur 12 dokumentiert.

  1. Führen 2D-Bildanalyse mit dem EMAN2 wissenschaftliche Bildverarbeitungssuite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 bis homogene Partikel (Wendelsegment) Sätze für Wendel Rekonstruktion auswählen.
    1. Wählen Cryo-EM mikroskopischen Aufnahmen mit straigmit der Digitalkamera-Software-und Visualisierungstools ht und gut organisierte Wendelrohre.
    2. Umkehren, normalisieren und Filter für Röntgenbildpunkte in der GUI e2workflow.py, Einzelpartikel Rekonstruktion (spr) Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. Importieren der invertierten normierten und Röntgen gefilterten Pixelbilder in der e2helixboxer.py GUI. Wählen FVIII-LNT Wendelrohre und Segment bei 256 x 256 Pixel (2,9 Å / pix) mit 90% Überdeckung mit: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Bewerten Sie die Unschärfe-mikroskopische Aufnahmen von den ursprünglichen und gelten Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Korrektur (nur Phasenkorrektur) auf die spiralförmige Segmente aus den gleichen Mikroaufnahmen mit der e2ctf.py Option in der e2workflow.py eingebaut: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. Generieren ersten Partikel (Wendelsegmente) setzt in der e2workflow.py GUI - SPR Option: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Berechnen 2D-Klasse mit Durchschnittswerten der Referenz e2refine2d.py Algorithmus Anwendung kostenlos k-Mittelwert Klassifizierung für einheitliche Datensätze mit dem gleichen Durchmesser LNT und der Grad der spiralförmigen Ordnung (Abbildung 2) zu wählen, nach dem Skript: "e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Eingang = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = Phase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = Mittelwert - normproj-classkeepsig ', die Änderung der NCL-Wert entsprechend.
      1. Klassifizieren Sie die Anfangsdaten in 150 Klassen NCLs = 151 'über 8 Iterationen mit' classkeep = 0,8 'gesetzt, was bedeutet, dass Partikel mit weniger als 80% Ähnlichkeit zu dem Klassendurchschnitt werden aus der gegebenen Klasse ausgeschlossen. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Merge-Partikel aus der Klasse Mittelwertemit ausgeprägten spiralförmigen Beugungs in e2display.py Zwischendatensatz zu erstellen.
      3. Klassifizieren Sie die Zwischendaten in 50 Klassen NCLs = 51 'gesetzt, um Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung zu unterscheiden.
      4. Merge Partikel aus Klassen mit gleichem Durchmesser und Grad der Ordnung in e2display.py, um die endgültige Datensatz für die dreidimensionale Rekonstruktion zu erstellen: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
  2. Führen Sie mit dem spiralförmigen Wiederaufbau Iterative Helical Real Space Wiederaufbau (IHRSR)-Algorithmus, wie in Egelman 17, 18 beschrieben.
    1. Schätzung der Anstieg &Dgr; z (Å) des FVIII-LNT Helix aus dem kombinierten Fourier-Transformation der Teilchen in dem endgültigen Datensatz.
    2. Definieren Sie den Azimutwinkel ΔΦ (º) durch mit einem konstanten Az parallel IHRSR Verfeinerungen, die Erhöhung von 5 ΔΦ76; bis 60 ° in 5 °-Schritten.
    3. Führen Sie 100 aufeinanderfolgenden Zyklen IHRSR für jeweils endgültige Daten mit einer gesichtslosen Zylinder als ein Anfangsvolumen und den ersten Wendel Parameter Az und ΔΦ wie in 3.2.1 definiert ist. und 3.2.2.
    4. Überprüfen Sie die letzten Bände für die Konvergenz der Schraubenparameter und Korrespondenz zwischen Klassendurchschnittswerte aus dem 2D-Klassifizierung des Datenkörpers und die Vorsprünge aus der letzten IHRSR Wiederaufbau.
    5. Symmetrie aufzuerlegen, um den endgültigen 3D-Rekonstruktionen, die der asymmetrischen Einheit in der endgültigen Verteilung asymmetrisch 3D-Volumen beobachtet: 4-fach für den menschlichen FVIII-LNT und 5-fach für Schweine-FVIII LNT. Führen Sie weitere 100 Verfeinerung Zyklen, um eine endgültige symmetrisierten 3D-Rekonstruktion zu erzeugen.
    6. Berechnen Sie die Fourier Shell Correlation-Kurve für beide Mengen, indem man zuerst die entsprechenden Daten in gerade und ungerade gesetzt: "e2proc2d.py <infile> <outfile> - split = 2 '. Dann führen Sie in Folge 100 IHRSR Verfeinerungen wie in 3.2.3 beschrieben. Berechnen Sie die FSC der 3D-Volumen aus den geraden und ungeraden Datensätze erstellt: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc.
  3. Visualisieren und Segment die FVIII-LNT Volumen in UCSF Schimäre.
    1. Öffnen Sie die letzten Bände von Schritt 3.2.5. in UCSF Chimera und stellen Sie die Kontur Ebene zu 0,005 in der TOOLS> VOLUME DATA> Volume Viewer-Option.
    2. In TOOLS> VOLUME DATA> SEGMENT MAP, wählen Volumen in SEGMENT Registerkarte MAP und klicken Sie auf Segment zu Segment ist die Lautstärke.
    3. Konzernsegmente, die einer Einheitszelle, indem Sie mit STRG + SHIFT und Klicken-Gruppe.
    4. Farbe der Segmente durch Elementarzelle und Helix mit AKTIONEN> COLOR Option, um die Strukturmerkmale betonen.

4. Elektronentomographie

  1. Negativ gefärbten FVIII-LNT Probenvorbereitung
      <li> Bereiten FVIII-LNT Proben wie für die Cryo-EM Experimenten.
    1. Glimmentladungen kohlenstoffbeschichtete 300-Mesh-Kupfergitter (Kohlenstoff Seite nach oben) in einem Gemisch aus O 2 und H 2-Gas für 10 s bei 50 W für Kryo-EM-Experimenten.
    2. Geben Sie einen Tropfen 2,5 ul FVIII-LNT Suspension mit 6-nm kolloidalem Gold-Nanopartikel in das Netz, trocknen Sie die überschüssige Flüssigkeit und negativ, indem 5 ul 1% Uranylacetat-Lösung für 2 min färben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit und Luft trocknen das Raster.
  2. Elektronentomographie Data Collection
    1. Übertragen Sie das Gitter in den einzelnen Kipphalter.
    2. Übertragen des Halters in dem Elektronenmikroskop.
    3. Sammeln Kippserie automatisch mit der Software SerialEM 19 bei 2 °-Schritten in einem Winkelbereich von -60 ° bis +60 ° und die Aufnahme von Bildern mit einer CCD-Kamera auf 52.000 X effektive Vergrößerung, -6 bis -10 um-Unschärfe und Elektronendosis von 150 - 170 electrons / Å 2 · s pro Schnittbild.
  3. Elektronentomographie Rekonstruktion der FVIII-LNT
    Hinweis: Rekonstruieren Sie das pFVIII-LNT LNT-und hFVIII gekippt Serie in 4.2 erworben. mit der Möglichkeit, die Software IMOD ETomo nach dem Tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. Mit einem Terminal-Fenster, öffnen Sie das Schnittbild in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin das Tomogramm von 4 mit dem IMOD BINVOL Befehl, um die Größe des Schnittbildes zu verringern.
    3. Wählen Sie den richtigen Winkel, um den Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse in der klassierten Schnittbild mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL drehen.
    4. Drehen Sie den vollen Schichtaufnahme mit dem Befehl IMOD ROTATEVOL.
    5. Schneiden Sie das ausgewählte Lipidnanoröhre entlang der Y-Achse mit der CLIP RESIZE Befehl IMOD orientiert.
    6. Öffnen Sie das zugeschnittene Unterschichtbild mit 3DMOD.
    7. Klicken Tomogramms, die Anordnung der Faktor VIII-Moleküle entlang visualisierendie Schichten in Z-Achse und entlang der Y-Achse in der Sub-Tomogramm Volumen.

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Representative Results

Rekombinante humane FVIII und Schweine wurden erfolgreich spiralförmig organisiert negativ auf einzelne Doppelschicht LNT erhoben, die aktivierte Thrombozytenoberfläche ähnelt. Die spiralförmige Organisation der Mensch und Schwein FVIII-LNT war konsistent durch die gesammelten digitalen Aufnahmen (Abbildung 2). Die Steuerung und der LNT Mensch und Schwein FVIII-LNT Wendelrohre wurden ausgewählt und mit der GUI und e2helixboxer.py anfänglichen Datensätze mit dem e2workflow.py GUI-, Options-Einzelpartikel (Tabelle 1) erstellt segmentiert.

Die Schrauben Ordnung der membrangebundenen Human-und Schweine-FVIII-LNT wurde aus der Fourier-Transformation untersucht der Klassenmittelwerte mit dem e2display.py GUI (EMAN2) (Abbildung 3). Die Lipid-Doppelschicht in den besten Steuer LNT 2D-Klasse Mittelwerte ist gut definiert. Die innere und äußere Seite und eine geringere Dichte der Membran hydrophoben Kern deutlich sichtbar sind ( (3B und 3C). Je ausgeprägter Torsion für den menschlichen FVIII-LNT Wendelrohre zeigt, dass die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen benachbarten Membran-gebundenen FVIII-Moleküle sind durchweg für die beiden Formen FVIII (3B und 3C). Partikel aus der Klasse, die gute Durchschnittswerte Wendel Organisation (Wendelbeugungsmuster) wurden in der e2display.py GUI zusammengeführt, um eine Zwischenpartikelsatz (Tabelle 1) zu bilden. Die Teilchen von den Zwischenpartikelmengen wurden erneut in 50 Klassen mit den gleichen Einschränkungen eingestuft. Die Teilchen aus der Klasse Mittelwerte mit dem gleichen Durchmesser wurden in der endgültigen Daten zusammengeführtSätzen (Tabelle 1).

Erste 3D-Rekonstruktionen für die Human-und Schweine-FVIII-LNT wurden mit 1.000 repräsentativ Partikel aus dem letzten Mensch und Schwein FVIII-LNT Datensätzen durchgeführt. Hundert Folge IHRSR Iterationen wurden für jeden 3D-Rekonstruktion mit einem gesichtslosen Zylinder (160 Å und 500 Å inneren Außendurchmesser) als Anfangsvolumen führen. Die axiale Anstieg (Az) von der kombinierten Fourier-Transformation berechnet der Spiralsegmente (Partikel eingestellt) gleich 41 Å für den menschlichen FVIII-LNT und 36 Å für Schweine FVIII-LNT (4A und 4B). Die anfängliche Azimutwinkel (ΔΦ) von der iterative Suche definiert ist mit 40,0 ° für den menschlichen FVIII-LNT und 35,0 ° für die Schweine-FVIII-LNT geschätzt. Die letzten Bände sind für die Konvergenz der Schraubenparameter und die Korrespondenz zwischen Klassenmittelwerte und Prognosen aus dem letzten Rekonstr geprüftuction, auch im Anschluss an die in 5 beschriebenen Kriterien. Die ausgewählten 3D-Rekonstruktionen und entsprechende Wendel Parameter werden als Ausgangsvolumina und erste Wendel Parameter für eine zweite IHRSR Verfeinerung von 100 Zyklen, die zu einem vier starten Wendel Organisation für den menschlichen FVIII-LNT mit Az = 41,1 Å und ΔΦ konvergierte auferlegt = 42,0 ° und ein Fünf-Start Wendelorganisation für die Schweine FVIII-LNT mit Az = 35,5 Å und ΔΦ = 34,8 °. Ein abschließendes 100 IHRSR Iterationen Einführung eines 4-fach und 5-fach spiralförmige Symmetrie für die Human-und Schweine-FVIII-LNT Rekonstruktionen sind jeweils mit Ausgangsvolumina und entsprechende Wendel Parameter aus den letzten asymmetrischen IHRSR Verfeinerungen (4C und 4D) durchgeführt. Die letzten Bände 8 anzeigen menschlichen FVIII und 10 Schweine-FVIII-Membran-gebundene Moleküle um die Helixachse (5A) organisiert. Jedes menschlicheFVIII-Molekül translatiert 41,2 Å und von der vorherigen gedreht 42,0 ° und jedes Schwein FVIII-Molekül translatiert 35,9 Å und 35,2 º gedreht von der vorhergehenden, die den Schrauben Parameter der endgültigen 3D-Rekonstruktionen (5B).

Die rekonstruierten Schichtbilder Elektronen bestätigen die Differenz in der schraubenförmigen Organisation zwischen dem menschlichen und Schweine-FVIII-LNT bei den gleichen experimentellen Bedingungen erhalten. Vergleich der Top-Blick von der rekonstruierten Schnittbilder und 3D-Volumen aus der spiralförmigen Wiederaufbau in der Richtung senkrecht zur Schraubenachse, eine weitere Bestätigung für die Richtigkeit der 3D-Rekonstruktionen mit den spiralförmigen IHRSR Parameter (Abbildung 6) verfeinert. Die asymmetrischen 2D-Einheitszelle Abmessungen für den menschlichen FVIII-LNT 3D-Rekonstruktion sind: a = 17,8 nm, b = 8.2, γ = 84 ° und für die Schweine-FVIII-LNT 3D-Rekonstruktion: a =18,4, b = 7,2 und γ = 70 ° (Fig. 6). Die Abmessungen der Elementarzelle der menschlichen FVIII in membrangebundenen 2D-Kristalle organisiert sind: a = 8,1, b = 7,0 und γ = 67 º, die an der Oberfläche durch ein FVIII-Molekül zu der Membran-Oberfläche 20 gesehen abgedeckt entspricht. Vergleicht man die Einheitszelle Abmessungen zwischen FVIII in 2D-und spiralförmigen Kristalle organisiert zeigt an, dass sowohl Mensch und Schwein FVIII-Moleküle bilden Dimere, wenn spiralförmig auf der Oberfläche LNT organisiert.

Figur 1
Abbildung 1. Strukturanalyse Flussdiagramm. Die Schritte folgten für das 2D-Klassifikationsanalyse auf Basis von Referenz kostenlos in EMAN2 16 implementierte Ausrichtung Algorithmen sind in blau eingekreist. Die Schritte, die für die 3D-Analyse durchgeführt, mit der iterativen Wendelecht Raum Rekonstruktionsalgorithmen (IHRSR) sind rot eingekreist. Die iterative IHRSR Zyklen mit gestrichelten Pfeile angegeben.

Figur 2
2. Kryo-EM Digitalmikroaufnahmen. (4.096 x 4.096 Pixel, 2,9 Å / pix) von Lipid-Nanotubes (LNT) mit und ohne gebundene FVIII. A. Kontrolle LNT. B. menschliche FVIII-LNT. C. Porcine FVIII-LNT . Der Rand des Lochs in der Kohlenstoffschicht, in der der FVIII-LNT in amorphes Eis suspendiert wird mit einem weißen Stern gekennzeichnet. Die Protein-und Lipiddichten sind in schwarz. Die vergrößerte Ansichten (Einlagen) von 512 x 512 abgeschnitten Bereiche (weiß gestrichelten Quadrat) veranschaulichen den Unterschied in der spiralförmigen Organisation des menschlichen FVIII und Schweinen auf. Der Maßstab beträgt 100 nm.ig2highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
Abbildung 3. Repräsentative 2D-Klasse-Mittelwerte (obere Reihe) und die entsprechenden Fourier-Transformationen (untere Reihe) von den Zwischenpartikelmengen (Tabelle 1) in 50 Klassen. A. Kontrolle LNT B. Menschen FVIII-LNT C Porcine FVIII-LNT eingestuft. Die Klassenzahl und die Anzahl der in jeder Klasse enthalten Partikel werden angezeigt. Der Unterschied in der Wendel Reihenfolge zwischen dem Mensch und Schwein FVIII ist deutlich auf den Bildern gesehen und durch die Beugungsmuster von der Fourier-Transformationen der Bilder bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine zu sehenGrößere Version der Figur.

Fig. 4
Abbildung 4. 3D-Rekonstruktionen von Wendel Mensch und Schwein FVIII-LNT. A. Kombinierte Fourier-Transformation von 1.000 Wendelsegmente. Die erste und zweite Schicht Linie bei 1/82 A zentriert -1 und 1/41 A -1 für menschliches FVIII-LNT, und bei 1/72 A -1 und 1/36 Å -1 für Schweine-FVIII-LNT (white Pfeile). B. Oberflächendarstellung der Menschen in pink (Az = 41,1 Å, ΔΦ = 42,0 º) und Schweine in blau (Az = 35,9 Å, ΔΦ = 35,2 º) FVIII-LNT 3D Wendel Rekonstruktionen. Beide Bände sind bei 0,005 Kontur Niveau präsentiert (minimale Dichte 0 und maximale Dichte von 0,02, wie in UCSF Chime berechnetra, Volume Viewer-Option 21). Die Länge der FVIII-LNT Rohr 256 Pixel bei 2,9 Å / pix. C. Fourier Shell Correlation (FSC)-Plots für Mensch und Schwein FVIII-LNT, die eine Auflösung von 20,5 Å auf FSC = 0,5.

Figur 5
Abbildung 5. Helical Organisation von Mensch und Schwein FVIII-LNT. Segmentierten Oberflächendarstellung von Mensch und Schwein FVIII-LNT Wendel Rekonstruktionen in 4B gezeigt. Die Bände sind nach dem imposanten 4-zählige Symmetrie auf den menschlichen FVIII-LNT und 5-zählige Symmetrie auf die Schweine-FVIII-LNT segmentiert. Die asymmetrischen Einheiten sind farblich codiert gelb-rot für den menschlichen FVIII-LNT und blau-grün für die Schweine-FVIII-LNT. A. Ansichten entlang der mit einem Platz für den menschlichen angegeben Helixachse und alsein Fünfeck für die Schweine-FVIII-LNT. Der menschliche FVIII-LNT Struktur zeigt 8-Moleküle um den äußeren Membran LNT organisiert und die Schweine FVIII Struktur zeigt 10 Molekülen um die äußere Membran LNT organisiert, angegeben mit Zahlen. B. Ansichten senkrecht zur Helixachse. Der menschliche FVIII-LNT ist ein 4-Helixstruktur beginnen und die Schweine-FVIII-LNT ist ein 5-Start-Helix-Struktur. Die einzelnen eine Start Helices sind mit Zahlen angegeben und farbcodiert. Wir haben eine der Helices von jeder Struktur mit einem (*) und grünen Linien hervorgehoben. Der Maßstab ist 20 nm beträgt.

Fig. 6
6. Vergleich zwischen den schraubenförmigen und Tomographie 3D-Rekonstruktionen. Das menschliche FVIII-LNT (A) und Schweine-FVIII-LNT (C) spiralförmige 3D-Rekonstruktionen gezeigt Perpendicular zur Schraubenachse. Jede Einheitszelle und einzelne Helices sind farbcodiert, wie in 5. B. und D. Dichte sind Darstellungen der 3D-Tomographie Rekonstruktionen, die senkrecht zur Schraubenachse gesehen. Das 2D-Gitter reflektiert die spiralförmige Anordnung der FVIII-Moleküle ist mit grünen Linien dargestellt.

PROBEN clnt hFVIII-LNT pFVIII-LNT
Initial Schliffbilder 61 474 542
Initial Particle-Sets 29113 60395 64665
Unscharf (nm) -4051 ± 502 -3643 ± 737 -3.443 ± 1.086
Zwischenpartikelmengen 25907 27305 22773
Schluss Particle-Sets 25907 10455 10430

Tabelle 1. 2D-Analyse-Statistiken nach dem Algorithmus, der in dem Flussdiagramm in Abbildung 3 dargestellt.

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Discussion

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um zwischen zwei Membrangebundene von hochhomologen Proteinen unterscheiden: Human-und Schweine-FVIII selbstorganisierten auf den Lipidstoffnanoröhren in die Bedingungen im menschlichen Körper auftreten.

Bei dem beschriebenen Verfahren, Mensch und Schwein FVIII erfolgreich schraubenförmig auf Lipid-Nanoröhren organisiert, was der wichtigste Schritt ist. Der nächste kritische Schritt ist, um die Probe in dünnen amorphen Eis durch Schockgefrieren in flüssigem N 2 in der Nähe von Temperatur zu bewahren. Die Erhaltung der Probe in amorphes Eis und LN2 Temperatur hält die Wendelrohre mit Feuchtigkeit versorgt und die Protein-Lipid-makromolekularen Anordnungen physiologisch aktiv. Der letzte entscheidende Schritt erwirbt Cryo-EM-Daten in ausreichender Menge und Qualität für eine hochauflösende 3D-Struktur in der Nähe von LN2 Temperatur. Sammeln von Daten in der Nähe von LN2 Temperatur weiter verhindert das Austrocknen der Probe im Hoch vacuum des Mikroskops und Strahlenschäden der Elektronenstrahl.

Zur Berechnung der Membran-gebundenen Struktur des FVIII der erste kritische Schritt ist, um homogene Partikel (Wendelsegmente) Sätze, indem 2D-Referenz kostenlos Klassifizierung und kombinieren Partikel von Klassen mit dem gleichen Durchmesser und Grad der Ordnung zu erhalten. Der zweite Schritt ist entscheidend, die richtige anfängliche Volumen und Schraubenparameter (Anstiegs-und Azimutwinkel) für die Schrauben Rekonstruktion verhängen. Der dritte und letzte Schritt ist entscheidend, um die helikale Struktur durch Vergleich der 3D-Karten durch die Schrauben und Elektronentomographie (ohne auferlegten Symmetrie) Rekonstruktionen der gleichen Probe erhaltenen validieren.

Die vorgestellte Methode ist in seiner Fähigkeit, das die Funktionsstruktur der Membran-assoziierten Proteine ​​bei nahezu physiologischen Bedingungen aufzulösen einzigartig. Die in unserem Labor entwickelt LNT kannerfolgreich als Plattform für spiralförmige Organisation der funktionellen membrangebundenen Blutgerinnungsfaktoren und eine bessere Auflösung als für FVIII in membrangebundene 2D-Kristallen und als einzelne Partikel organisiert. Unser Ziel ist es, die Auflösung unserer spiralförmigen Rekonstruktionen weiter zu erhöhen durch die Verbesserung der Homogenität und Qualität des fertigen Partikel Sets. Sammeln mehr Cryo-EM mikroskopischen Aufnahmen zu besseren Cryo-EM Bedingungen (Feldemissionskanone, Energiefilter, DE-Kamera-Detektoren) des FVIII-LNT spiralförmigen Filamente und damit auch größere Partikel Anfangssätze für die 2D-Rekonstruktion wird dies zu erreichen. Die Verbesserung der FVIII-LNT Wendel Montage-und 3D-Rekonstruktionsalgorithmen wird es uns ermöglichen Sub-Nanometer und in der Nähe von atomarer Auflösung, die die Membran-gebundene Organisation dieser kritischen für die Blutgerinnung Protein eindeutig zu definieren wird erhalten.

Organisieren spiralförmig homologe FVIII Formen gibt uns auch die Chancenty zu charakterisieren, wie Differenz Sequenz kann auf Unterschiede in Struktur und Funktion zu korrelieren. Die Lösung der Mensch und Schwein FVIII Membran-gebundenen Strukturen durch die in diesem Artikel beschriebenen Methoden können helfen, die Sequenzen, die, wenn die modifizierten rekombinanten FVIII-Funktion zu verbessern. Dieses Wissen wird erhebliche klinische Implikationen für die Wirkstoffforschung in beiden Bereichen Thrombose und Hämostase.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Konkurrenz finanzielles Interesse und sie können direkt über eine der in dieser Handschrift veröffentlichten Verfahren kontaktiert werden.

Acknowledgments

10SDG3500034 und UTMB-NZB-Start-up-Fonds zu SSM: Diese Arbeit wird durch einen Nationalen Entwicklungs Scientist Zuschuss von der American Heart Association unterstützt. Die Autoren erkennen die Cryo-EM und Wissenschaftliches Rechnen Einrichtungen des Sealy Zentrum für Strukturbiologie am UTMB ( www.scsb.utmb.edu ) sowie Drs. Steve Lüdtke und Ed Egelman Hilfe zu den 2D-und 3D-Wendelrekonstruktionsalgorithmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEM2100 with LaB6 JEOL Ltd. JEM-2100 operated at 200 kV
with TEMCON software JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder Gatan, Inc. 626.DH cooled to -175 °C
with temperature controler unit Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera Gatan, Inc. US4000 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV FEI
Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid Ted Pella 01821 plasma cleaned for 10 sec on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh Electron Microscopy Sciences Q225-CR2 Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes 
Uranyl acetate dihydrate Ted Pella 19481 1% solution, filtered
Galactosyl ceramide Avanti Polar Lipids Inc. 860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids Inc. 840035
EM software Digital Micrograph Gatan, Inc. http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN free download http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
EM software Spider free download http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR free download Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD) free download http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
EM software (SerialEM) free download ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera free download http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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