从海马CA1区片核富含分的分离,研究突触核信使蛋白质的活性依赖进口核

Neuroscience

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Summary

我们提供了用于诱导的长时程增强,在海马CA1区和核富集级分的从片的tetanized区域的随后分离的详细协议。这种方法可以被用来确定活性依赖的核蛋白质导入在学习和记忆的细胞模型。

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Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins. J. Vis. Exp. (90), e51310, doi:10.3791/51310 (2014).

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Abstract

学活性依赖的蛋白表达,细胞内转位,或磷酸化是必不可少的理解突触可塑性的潜在的细胞机制。长时程增强(LTP)和诱导的急性海马长时程抑制(LTD)被广泛地接受为学习和记忆的细胞模型。有迹象表明,使用活细胞成像和免疫组化的方法来可视化活动相关的蛋白质动力学大量的研究。然而,这些方法依赖于抗体的免疫细胞化学在单个神经元的荧光标记蛋白或过表达的适宜性。蛋白质的免疫印迹是一种替代方法提供的结果,独立确认。在制备由个别tetanized海马切片的亚细胞级分的第一限制因素是材料的低量。二,处理程序是至关重要的,因为升甚至很短,小的操作艾尔文片可能会引起一定的激活信号级联。在这里,我们描述,以便获得足够纯度的核浓缩部分的足够量的从大鼠脑急性海马切片的CA1区的优化工作流程。作为一个代表性的例子中,我们表明,突触核蛋白质的信使的ERK1 / 2磷酸化形式雅各积极进入细胞核后,诱导LTP,并且可以从CA1区神经元核浓缩部分进行检测。

Introduction

突触N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)发挥在突触可塑性和细胞存活信号而激活突触外NMDA受体的可触发的神经变性和细胞死亡的关键作用。这些变化依赖于严密控制/受规管活动相关的基因表达,因此需要激活突触或树突和细胞核7之间不断的沟通。在MAP激酶ERK1 / 2的突触NMDA受体的信号的下游效应,并参与NMDA受体活化诱导的基因表达,而经由突触外NMDA受体信号没有或ERK1 / 2的活性8,11的抑制作用。

有迹象表明,已经显示出远端树突和细胞核之间穿梭蛋白的数量。许多这些蛋白质含有核定位信号,并正在积极沿着在动力蛋白和importin依赖性微管运输到核6,9。 InterestinglY,一些使者只是过境到细胞核针对特定突触的刺激。例如,环AMP应答元件结合蛋白2(CREB2)的逆行运输,通过化学股份有限公司但不LTP 12诱导。本地化的NMDA受体依赖的突触刺激驱动CREB调节转录共激活因子(CRTC1)进入细胞核,易位过程,其涉及在长期海马可塑性4。它最近的研究表明,该蛋白信使雅各布转位到后两个核,突触和突触外NMDA受体的激活和调节CREB依赖性基因转录的5。信号的突触和突触外原点编码雅各的翻译后修饰。突触活动引起雅各ERK1 / 2磷酸化依赖于在位置180(pJacobS 180)的一个关键丝氨酸这是一个必要的后续易位初级海马文化的核心。此外,我n个急性海马pJacobS 180转位到谢弗抵押LTP后核CA1区神经元而不是公司 。 pS180雅各导致的可塑性相关的基因表达增加,这基因表达反馈到突触功能。形成鲜明对比,雅各布该易位至细胞核后突触外NMDA受体活化不磷酸化在Ser180和可能具有不同的蛋白复合物有关在核中引起“CREB切断”和突触触头10回缩。

对突触核蛋白质的信使核进口的大多数已发表的研究中分离的神经细胞原代培养工作已经完成。因此,这将是有趣的,如果这样的调查结果可以复制使用海马生理更多的相关条件下神经元的连接和功能更好的保存。在这里,我们提出了一个优化的协议,以评估LTP-DE通过免疫印迹侧基的蛋白质信使核转。这个方法也适合于分析中的粗核级分的蛋白质的活性依赖的磷酸化。具体来说,目前的协议包括制备急性海马CA1区片,感应和记录的LTP。接着,CA1区用显微镜解剖,分离出刺激的区域。我们结合和修饰赵和他的同事17引入的更改提供CellLytic核抽提试剂盒的协议核隔离。优化过程包括解剖海马CA1区的低渗缓冲液裂解使细胞肿胀,核释放。细胞裂解和细胞核形态可以通过显微镜检查来确定。铀浓缩是一个短离心步骤来实现的。免疫印迹分析用抗体的NeuN和NSE2,核或细胞质级分的特异性标记物,表明该方法可以被用作快速和可重复的协议来隔离这些亚细胞组分,并研究样蛋白的磷酸化非常不稳定的翻译后修饰。此外,此方法是有利的,对于小的组织样本来自海马切片的CA1区解剖区域导出,并且可以组合使用,以海马切片的免疫组化分析。

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Protocol

从成年大鼠脑1。制备急性海马脑片

  1. 麻醉大鼠异氟醚。注意:执行使用封闭exicator的过程中,不要吸入异氟醚。确保动物完全麻醉。
  2. 杀头的大鼠,迅速 ​​隔离大脑,并沉浸在precarbonated(95%O 2/5%CO 2的混合气体)冰冷Gey中的溶液(组成MM:130氯化钠,4.9氯化钾,1.5氯化钙2·2H 2 O ,0.3硫酸镁4·2H 2 O,11氯化镁2·6H 2 O,0.23 KH 2 PO 4,0.8的Na 2 HPO 4·7H 2 O,5个葡萄糖·H 2 O,25 HEPES,22 碳酸氢钠 ,pH值7.32) 30分钟1,2,10,16。
  3. 取下内嗅皮层,小脑和组成部分。与正中矢状切分出皮质半球,然后将每个半球倒在其内侧表面。此后使50-70°切割(50-70°横向)沿着每个半球13,14的背缘。
  4. 胶水每个半球的切片系统的切片平台上的新鲜切割面。该平台应涵盖precarbogenated冰冷Gey中的解决方案。
  5. 切350微米50-70°横切片由前至后一边用调整,以减少Z轴振荡àvibratome。海马结构,subicular和内嗅皮质,以及它们位于背侧海马的皮层将用于实验13,14的条带的一部分。
  6. 转移海马为马蹄形,并浸没式孵化器和孵化至少2小时,在32℃,carbogenated人工脑脊液(学联含MM:110氯化钠,氯化钾2.5,2.5氯化钙2·2H 2 O,1.5硫酸镁4·2H 2 O,1.24 KH 2 PO 4,10葡萄糖·H 2O,27.4 碳酸氢钠 ,pH值7.3),1,2,10,16。

2,定位电极的基线记录,和LTP的诱导

  1. 海马切片传送到​​安装在显微镜下浸没式录音室。灌注(6-7毫升/分钟)与carbogenated ACSF中至少30分钟,在32℃下。
  2. 准备玻璃毛细管微电极填充学联(尖阻力为3-5MΩ)。
  3. 放置一个玻璃微电极填充ACSF中的CA1谢弗抵押纤维的刺激和在海马CA1辐射层为fEPSP记录1,2,10( 图2)。电极之间的距离应为大约300微米。
  4. 由谢弗抵押纤维与双相方波电流脉冲(200毫秒/极性)的刺激的范围3-4五唤起场兴奋性突触后电位(fEPSPs)加强
  5. 通过测量INP执行的最大刺激试验UT输出关系和定义的刺激强度作为获得最大fEPSP斜率值的40%,并保持它在整个实验常数。
  6. 开始基线记录的最大刺激试验后至少15分钟。测量的响应来测试刺激整个实验过程中,每分钟。执行基线记录用低频刺激。
  7. 记录基线为至少30分钟。
  8. 对于晚期LTP的诱导采用高频100赫兹强直电刺激由三个1秒刺激的列车在100赫兹有5分钟intertrain间隔。为了增加在CA1区5微米荷包牡丹碱刺激的字段可以洗2分钟强直电刺激之前和最后强直电刺激后,应立即被淘汰。

3,收集片的LTP和快速冷冻的诱导后

  1. 停止LTP记录2分钟或强直性刺激的三列火车诱发晚期LTP后30分钟。
  2. 收集在1.5ml试管和存储每片在-80℃。

从海马CA1区4​​核的分离富集馏分

  1. 取1.5毫升的Eppendorf管中冷冻切片从-80℃并保持在冰上。
  2. 加入0.5ml的新鲜冷的TBS缓冲液含有蛋白酶(PI)和磷酸酶(PS)的抑制剂,进入管毫升。孵育2-3分钟,并传输到立体。注意:使用防护手套和实验室外套,同时采用PI和PS工作。
  3. 解剖用两针的海马CA1锥体层区域。用一针,用于保持在体视显微镜和第二针用于切割CA1区下的切片。
  4. 收集解剖CA1区域从5片(每组)到新的1.5毫升试管中含有50μl的裂解缓冲液(1×含以mM低渗裂解缓冲液:10 HEPES,1.5的MgCl 2,10的KCl,pH值7.9,用PI和PS)。请注意,此材料用量将足以运行2-3免疫印迹。
  5. 均质化通过小心移液上下收集的组织。用200微升吸管。在冰上孵育的裂解液为5-7分钟以使细胞溶胀。
  6. 取2微升的裂解液,滴在显微镜载玻片,并可视化明视场显微镜下的细胞的肿胀。与细胞的正常肿胀的细胞核显示为圆形完整结构。
  7. 收集20微升样品到新的1.5 ml管的“匀浆分数”。添加8微升变性4×SDS上样缓冲液中。
  8. 离心剩余的溶胞产物在11000 rpm离心1分钟。
  9. 小心地从顶部('胞浆部分“)收集上清液,TRansfer到一个新的管中,加入20微升的4倍上样缓冲液。
  10. 悬浮颗粒在60微升低渗缓冲液加入20μl4X采样缓冲区。该馏分被称为一个“核浓缩部分'。
  11. 匀浆,胞浆和核富含分可以储存在-20℃或-80℃,以后免疫。

5,半定量免疫印迹的突触核蛋白质

  1. 解冻的样品和在95℃下煮沸5分钟。
  2. 采取从每个级分5微升,并确定由氨基黑测试或BCA测试中的蛋白质浓度。
  3. 装载于SDS-PAGE电泳从匀浆等量的蛋白样品,细胞质和细胞核富集馏分。从控制和LTP切片样品应放置在同一凝胶的直接比较。
  4. 执行标准的西方印迹程序(湿传递推荐)。
  5. 探索与T膜他抗体的选择。随后,同样的印迹(或并行运行同一样品)可以探测与细胞质标记 - 神经元特异性enolase2(NSE2)和核标志 - 的NeuN和肌动蛋白抗体作为内参。

6,数据分析

  1. LTP的诱导效率可以通过Clampfit软件进行分析。基线记录的平均坡度使用强直电刺激后的山坡上双因素方差分析,P比较<0.05为差异有显著不同。该fEPSP斜率值在图中表示为均值±标准差
  2. 对于免疫印迹定量,无论是扫描的放射自显影胶片和分析蛋白条带通过的ImageJ或荧光带集成密度与LICOR系统。免疫反应性条带的数值应被归一化的负载和印迹控制。对于控制的比较和LTP的用户组nonparametrical采用Mann-Whitney U检验可能使用。
缓冲区的命名 试剂 浓度(mM) 金额 评论/说明
Gey中的溶液 (pH值:7.3〜7.4) 氯化钠 130 7.6克无菌过滤
千毫升氯化钾 4.9 0.37克
氯化钙2·2H 2 O 1.5 0.22克
硫酸镁4·2H 2 O 0.3 0.0739克
氯化镁2·6H 2 O 11 2.24克
KH 2 PO 4 0.23 0.0313克
的Na 2 HPO 4·7H 2 O 0.8 0.2145克
葡萄糖·H 2 O 5 0.9909克
HEPES 25 5.96克
碳酸氢钠 22 1.85克
学联 (pH值:7.3〜7.4) 氯化钠 110 6.428克无菌过滤
千毫升氯化钾 2.5 0.1865克
氯化钙2·2H 2 O 2.5 0.368克
硫酸镁4·2H 2 O 1.5 0.370克
KH 2 PO 4 1.24 0.169克
葡萄糖·H 2 O 10 1.9817克
碳酸氢钠 27.4 2.3克
1X低渗缓冲液 (pH值:7.9) HEPES 10 0.23克
百毫升氯化镁2·6H 2 O 1.5 0.0304克
氯化钾 10 0.07455克

表1缓冲器。

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Representative Results

之前我们已经表明,突触核蛋白质的信使雅各下诱导LTP,但不有限公司1个聚集在细胞核内。此外,刺激突触后转雅各需要激活蛋白激酶ERK1 / 2磷酸化雅各在Ser180( 图1)。磷酸雅各易位至细胞核中的importin依赖性和磷酸化状态可以被保存在延长的时间周期由协会与中间丝αinternexin15( 图1)。雅各的磷酸化状态是对的活性依赖性基因和细胞存活的表达很重要。有趣的是,激活的突触外NMDA受体的还驱动雅各到细胞核中,但在这种情况下雅各不是磷酸化在Ser180和其核积累引起CREB'切断'5,10。上述的结果是由protoco得到建立在我们最近的研究LS(参见Karpova 等人 10对模型的详细描述)。

证明雅各易位入诱导LTP的后细胞核内,我们诱导和测量的Schaffer侧fEPSP增强作用的诱导急性海马切片,随后分离出的神经元的核从CA1区神经元( 图23)。我们比较了应用的高频刺激(2分钟和30分钟)后,两个不同的时间点,并记录LTP的诱导为随后进行处理的核分离和Western印迹每个切片( 图23)。神经元核标记物的NeuN的富集可以看出,在从解剖CA1区中制备的核浓缩部分,而胞质标记神经元特异性enolase2(NSE)是主要存在于裂解的c离心后得到的上清液部分ELLS( 图4A)。 pS180雅各抗体的特异性已被以前的特点(详见Karpova 10)。 pS180雅各水平保持不变的总CA1蛋白匀浆和强直电刺激( 图4B)后,核浓缩部分2分,但我们发现长时程增强( 图4C)诱导后30分钟在pJacobS 180免疫à显著增加,确认雅各布转运至该细胞塑性模型的核心是磷酸化在Ser180。

图1
图1雅各磷酸化在S180编码NMDA受体信号的突触原点。的海马Schaffer侧纤维结果强直刺激活化突触NMDA受体和MAPK随后激活ERK1 / 2信号传导级联。激活ERK1 / 2的结合并磷酸化雅各在丝氨酸180和雅各布-ERK1 / 2的复转位到细胞核并此关联具有增强CREB活性和活化的可塑性相关基因的表达。

图2
图2:设备和用于诱导LTP和海马解剖CA1区的工具。 A)Vibratome用于制备急性海马脑片(1 - Vibratome)B1-2)电生理和影像设置(2 -显微镜; 3 -微操作和灌注系统; 4 -重新编码电极; 5 -刺激电极,6 -水物镜7 -与海马切片切片持有人)C)用于从海马CA1区清扫设备(8 STEReomicroscope; 9 - 胰岛素注射器针头; 10 -小外科剪刀11 -手术刀; 12 -塑料巴斯德吸管13 -薄刮刀; 14-100毫米的塑料培养皿中充满了冰-水,和40毫米的塑料培养皿中用于切片的清扫。

图3
图3卡通展示的实验步骤。数字表示在该协议的步骤。 2.1-2.8),在水下室与放置在辐射层的谢弗抵押CA1区突触的增强作用的玻璃电极的急性海马切片。插图代表样品fEPSP模拟走线,水平条表示5毫秒,竖线表示0.5毫伏。 3.3)的切片收集到1.5毫升管后LTP的记录和快速冷冻。 4.3)从成年大鼠海马CA1区的解剖。 4.4-4.5)CA1区域匀浆在低渗裂解缓冲液中,从而导致细胞和细胞核中释放的渗透膨胀。裂解物的4.8)离心11000 rpm离心1分钟。 4.10)收集的细胞质和核富含分的免疫印迹。 5.3)装在SDS-PAGE和后续标准的西方墨点法细胞质和核富含分的。

图4
图4诱导CA1区的LTP导致pJacS180在细胞核中积累。 A)用于免疫印迹匀浆,胞浆和CA1细胞裂解液核富含分后INDU探测与细胞质和细胞核标记。 二)pJac-S180水平匀浆2分钟,免疫印迹分析和30分钟强直电刺激。 的C ction)的核浓缩部分2分钟,分钟强直电刺激后pJacS180级免疫印迹分析。这些结果发表在Karpova 10定量图的一部分。这些代表性的免疫印迹中不包含原始出版物。

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Discussion

在上述协议中所述的步骤提供指导如何准备从青年或成年大鼠海马急性切片,诱导和记录LTP,迅速解剖切片的刺激区域,并准备核浓缩部分的研究活动相关的蛋白质动力学。这种方法源于对彼此独立地使用几种不同的方法组合。我们优化的工作流程,并为初学者建立自己的实验后,LTP的诱导,研究蛋白质的亚细胞再分配提供足够的细节。作为一个例子,我们证明了LTP的晚期形式诱导S180的核积累磷酸化雅各。给定蛋白质的预先存在的核池的磷酸化和其磷酸化形式的突触活动后易位区分,这种方法可与控制中的核浓缩部分兴趣蛋白质的总含量相结合。此外,TESTING样品在LTP的诱导后不同时间点可能是非常有见地的研究蛋白质的活化/钝化或核成交时程。

在从刺激切片准备核富含分的有一些需要解决的几个方法问题。首先,为了增加刺激的神经元在海马CA1区域的数量和材料的免疫印迹的量,我们应用5μM的GABAA受体阻滞剂biccuculine强直电刺激过程中。 Biccuculine已经显示出增强的兴奋性突触后电位3。

二,保存LTP的诱导通过快速冷冻后切片是实验成功的关键一步,因为机械装卸片可能会引起不同类型的活动,改变蛋白质的修饰直接关联。缩短尽可能的过程中,我们使用金属棒置于干冰上。片s的用塑料巴斯德吸管转移的下降学联,当放置在预冷的金属内极少数第二个被冻结。

第三个关键步骤是核海马CA1裂解液的浓缩。我们建议以监测细胞在显微镜下溶胀并找到最优化的时间点。有时,当没有正确完成组织的均质化,细胞碎片仍然在样品中。然后将细胞核沉淀可以再次重新悬浮在裂解缓冲液中,用了几分钟,然后离心以获得更纯的细胞核部分。

总体来说,这一协议有助于进一步探险家不同的突触核信使蛋白在突触可塑性中的作用。相同的过程可以不仅适用于高频刺激诱导LTP但所有其他形式的突触可塑性像LTD时θ突发LTP,短期可塑性模型,以及其他。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
CED 1401 AD/DA converter Cambridge Electronics Design, UK
Stereomicroscope Leica S4E, Germany
Vibrotome Leica VT1000S, Germany
Isolated pulse stimulator A-M Systems, USA Model 2100
Centrifuge Thermo Scientific
SDS-PAGE system Biorad
Cooler Julabo
Bright field Microscope Nikon Eclipse TS100
Cell culture incubator Thermo Electron Corporation
Micromanipulator Luigs & Neumann, SM-5, Germany
Blotting chamber and electric power supplier Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA
Submerged type recording chamber custom made
U-shape and submerged type incubator  custom made
Small surgical scissors
Scalpel
Thin spatula
Plastic Pasteur pipette
Plastic culture dish 
Bunsen beaker
Syringe
Reagents
NaCl Roth Art.-Nr.3957.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
KCl Roth Art.-Nr.6781.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
CaCl2·2H2O Merck 1.02382.0500 pro analysis
MgSO4·2H2O Merck 5886.05 pro analysis
MgCl2·6H2O AppliChem CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 for molecular biology
KH2PO4 Merck 12034.025 for molecular biology
Na2HPO4·2H2O Merck 1.06574.1000 extra pure
Glucose·H2O Roth Art.-Nr.6887.1 for molecular biology
HEPES Roth Art.-Nr.9105.4 PUFFERAN, ≥99.5%, p.a.
NaHCO3 Merck 1.06329.1000 pro analysis
Protease inhibitor cocktail Roche
Phosphostop Roche
Bicuculline Tocris Bioscience
Isoflurane Baxter
Antibodies
Primary antibodies Company Catalog Number Species
pJac-s180 Biogenes rabbit (diluted 1:100)
NeuN Milipore MAB377 mouse (diluted 1:1,000)
NSE Cell Signaling D20H2 rabbit (diluted 1:1,000)
Beta-actin Sigma A-5441 mouse (diluted 1:5,000)
Secondary antibodies Company Catalog Number Species
IgG HRP conjugated DAKO goat anti-mouse (1:5,000)
IgG HRP conjugated NEB goat anti-rabbit (1:5,000)

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References

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