Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l'attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Neuroscience

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Summary

Forniamo un protocollo dettagliato per l'induzione del potenziamento a lungo termine nella regione CA1 dell'ippocampo e il successivo isolamento di frazioni arricchite nucleari dalla zona tetanized della fetta. Questo approccio può essere utilizzato per determinare l'attività dipendente di importazione proteina nucleare in modelli cellulari di apprendimento e memoria.

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Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins. J. Vis. Exp. (90), e51310, doi:10.3791/51310 (2014).

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Abstract

Studiare attività di espressione della proteina dipendente, traslocazione subcellulare, o fosforilazione è essenziale per comprendere i meccanismi cellulari alla base della plasticità sinaptica. Il potenziamento a lungo termine (LTP) e depressione a lungo termine (LTD) indotta in fettine di ippocampo acute sono ampiamente accettati come modelli cellulari di apprendimento e memoria. Ci sono numerosi studi che utilizzano approcci di imaging cellulare o immunoistochimica dal vivo per visualizzare l'attività dinamica delle proteine ​​dipendenti. Tuttavia questi metodi si basano sulla idoneità degli anticorpi per immunoistochimica o sovraespressione di proteine ​​fluorescenza-tagged in singoli neuroni. Immunoblotting di proteine ​​è un metodo alternativo che fornisce una conferma indipendente dei risultati. Il primo fattore limitante nella preparazione di frazioni subcellulari di singoli fettine di ippocampo tetanized è la bassa quantità di materiale. In secondo luogo, la procedura di gestione è fondamentale perché manipolazioni, anche molto brevi e minori di living fette potrebbe indurre l'attivazione di alcune cascate di segnalazione. Qui si descrive un flusso di lavoro ottimizzato al fine di ottenere un quantitativo sufficiente della frazione arricchita nucleare di purezza sufficiente dalla regione CA1 di fettine di ippocampo acute di cervello di ratto. Come esempio rappresentativo mostriamo che la ERK1 / 2 forma fosforilata della proteina messaggero Synapto-nucleare Jacob trasloca attivamente al nucleo dopo induzione di LTP e può essere rilevato in una frazione arricchita nucleare dai neuroni CA1.

Introduction

Synaptic N-metil-D-aspartato-recettori (NMDARs) svolgono un ruolo cruciale nella plasticità sinaptica e la sopravvivenza delle cellule di segnalazione, mentre l'attivazione di NMDARs extrasinaptica può innescare neurodegenerazione e la morte cellulare. Questi cambiamenti dipendono da / attività regolamentata espressione genica dipendente strettamente controllata e, quindi, richiedono una costante comunicazione tra sinapsi e dendriti attivati ​​e il nucleo 7. Il MAP chinasi ERK1 / 2 sono effettori a valle di NMDARs sinaptiche segnalazione e sono coinvolti nella espressione genica NMDAR-attivazione-indotta, considerando che la segnalazione via NMDAR extrasinaptica non ha o un effetto inibitorio sulla ERK1 / 2 attività di 8,11.

Ci sono certo numero di proteine ​​che hanno dimostrato di navetta tra dendriti distali e il nucleo. Molte di queste proteine ​​contengono un segnale di localizzazione nucleare e sono attivamente trasportati lungo microtubuli in un dineina e modo importina-dipendente al nucleo 6,9. Interestingly, alcuni di questi messaggeri solo transito al nucleo in risposta a specifici stimoli sinaptici. Ad esempio, il trasporto retrogrado di ciclico elemento di risposta AMP binding protein 2 (CREB2) è indotta da LTD chimica, ma non LTP 12. Stimolazione sinaptica NMDAR-dipendente localizzata guida coactivator trascrizionale CREB-regolata (CRTC1) nel nucleo, un processo di traslocazione, che è coinvolto nel lungo termine plasticità ippocampale 4. E 'stato recentemente dimostrato che la proteina messaggero Giacobbe trasloca al nucleo dopo che entrambi, l'attivazione NMDAR sinaptica e extrasinaptica e regola gene CREB dipendente trascrizione 5. L'origine sinaptica o extrasinaptica del segnale è codificato in una modificazione post-traslazionale di Giacobbe. Attività sinaptica induce ERK1 / 2 fosforilazione dipendente di Giacobbe a serina cruciale alla posizione 180 (pJacobS 180), che è un requisito per la successiva traslocazione al nucleo nella cultura ippocampale primaria. Inoltre, in CA1 neuroni di acuta fettine di ippocampo pJacobS 180 trasloca nel nucleo dopo Schaffer collaterale LTP ma non LTD 1,10. pS180 Jacob porta ad un aumento dell'espressione dei geni legati plasticità e l'espressione genica feed torna alla funzione sinaptica. In netto contrasto, Giacobbe che trasloca nel nucleo dopo l'attivazione NMDARs extrasinaptica non è fosforilata in Ser180 e può essere associata a complesso proteico diverso nel nucleo causando 'CREB spento' e una ritrattazione di contatti sinaptici 10.

Maggior parte degli studi pubblicati sulla importazione nucleare di Synapto-nucleare proteina messenger sono stati condotti in colture primarie neuronali dissociate. Pertanto, sarebbe interessante vedere se questi risultati possono essere riprodotti in fisiologicamente più rilevanti condizioni con fettine di ippocampo in cui la connettività e la funzione neuronale sono molto meglio conservati. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per la valutazione LTP-dependent traslocazione nucleare di messaggeri della proteina mediante immunoblotting. Questo metodo è adatto per analizzare l'attività dipendente fosforilazione di proteine ​​in una frazione nucleare rudimentale anche. In particolare, l'attuale protocollo prevede la preparazione di acuta fettine di ippocampo CA1, induzione, e la registrazione di LTP. Avanti, regione CA1 viene sezionato al microscopio per isolare la regione stimolata. Abbiamo combinato e modificato il protocollo per l'isolamento nucleare fornito da CellLytic nucleare Extraction Kit con le modifiche introdotte dal Zhao e colleghi 17. La procedura di ottimizzazione comprende la lisi delle regioni CA1 sezionati in tampone ipotonico permettendo rigonfiamento delle cellule e il rilascio di nuclei. Lisi cellulare e la morfologia nuclei possono essere determinati mediante esame microscopico. Arricchimento nucleare viene raggiunto da una breve fase di centrifugazione. Immunoblotting con anticorpi contro NeuN e NSE2, marcatori specifici delle frazioni nucleari e citosoliche, indica che questo approccio può essere utilizzato come un velocee il protocollo riproducibile per isolare queste frazioni subcellulari e studiare molto labili modificazioni post-traduzionali come fosforilazione proteica. Inoltre, questo metodo è vantaggioso per piccoli campioni di tessuto provenienti da regioni CA1 sezionati di fettine ippocampali e può essere usato in combinazione per immunoistochimica di fettine ippocampali.

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Protocol

1 Preparazione di acuta fettine di ippocampo di adulti Rat Brain

  1. Anestetizzare ratti con isoflurano. ATTENZIONE: Eseguire la procedura utilizzando un exicator chiuso, non inalare isoflurano. Assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato.
  2. Decapitare il ratto, rapidamente isolare il cervello, e immergerlo in precarbonated (95% O 2/5% di CO miscela di gas 2) ghiacciata soluzione Gey (composizione in mM: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6H 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucosio · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7.32) per 30 min 1,2,10,16.
  3. Rimuovere il cervelletto e la parte della corteccia entorinale. Separare gli emisferi corticali con un taglio medio-sagittale, quindi posizionare ciascun emisfero in giù sulla sua superficie mediale. Successivamente farea 50-70 ° taglio (50-70 ° trasversale) lungo il bordo dorsale di ogni emisfero 13,14.
  4. Colla ciascun emisfero con la superficie appena tagliata sulla piattaforma affettatura del sistema di sezionamento. La piattaforma dovrebbe essere coperto da una soluzione di Gey ghiacciata precarbogenated.
  5. Tagliare 350 micron 50-70 ° fette trasversali da anteriore a posteriore lato utilizzando un vibratome regolata per ridurre al minimo z oscillazione. La formazione dell'ippocampo, corteccia entorinale e subicular, così come le cortecce che si trovano dorsolaterale all'ippocampo faranno parte delle fette utilizzati per esperimenti 13,14.
  6. Trasferimento fettine di ippocampo a forma di U e sommerse tipo incubatrice e incubare per almeno 2 ore a 32 ° C con carbogenated liquido cerebrospinale artificiale (ACSF contenente, in mM: 110 NaCl, 2.5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glucosio · H 2O, 27.4 NaHCO 3, pH 7,3) 1,2,10,16.

2 Posizionamento Elettrodi, Baseline registrazione, e induzione di LTP

  1. Trasferire la fetta dell'ippocampo di una camera di registrazione di tipo sommerso montato sotto un microscopio. Profumato (6-7 ml / min) con ACSF carbogenated per almeno 30 minuti a 32 ° C.
  2. Preparare microelettrodi capillare di vetro riempito con ACSF (resistenza di punta è di 3-5 MW).
  3. Mettere a microelettrodi di vetro riempito con ACSF nelle fibre CA1 Schaffer-collaterali per la stimolazione e nel radiatum CA1 strato per fEPSP registrazione 1,2,10 (Figura 2). La distanza tra gli elettrodi deve essere di circa 300 micron.
  4. Evoke campo eccitatori postsinaptici Potenziali (fEPSPs) dalla stimolazione delle fibre Schaffer-collaterali con impulsi di corrente rettangolari bifasici (200 msec / polarità) in una gamma di 3-4 V.
  5. Eseguire il test di stimolazione massima misurando la inprapporto ut-uscita e definire la forza di stimolazione come il 40% dei valori massimi fEPSP-pendenza ottenuti e mantenerla costante durante l'esperimento.
  6. Iniziare la registrazione di base per almeno 15 minuti dopo il test di stimolazione massima. Misurare le risposte a stimoli testare ogni minuto tutto l'esperimento. Eseguire registrazioni di base con la stimolazione a bassa frequenza.
  7. Registrare la linea di base per almeno 30 min.
  8. Per l'induzione tardo-LTP applicare ad alta frequenza 100 Hz tetanization composto da tre treni di stimolo 1 sec a 100 Hz con un intervallo di intertrain 5 min. Per aumentare il campo di stimolazione all'interno CA1 regione 5 micron bicucullina può essere lavato in 2 minuti prima tetanization e devono essere lavati subito dopo l'ultimo tetanization.

3 Raccolta di fette dopo induzione di LTP e Snap congelamento

  1. Arresto LTP registrazione 2 min o 30 min dopo tre treni di stimolazione tetanica inducono tardo-LTP.
  2. Raccogliere ogni fetta in una provetta da 1,5 ml e conservare a -80 ° C.

4 Isolamento di frazioni nucleari arricchiti dalla regione CA1 dell'ippocampo

  1. Prendere 1,5 ml provette Eppendorf con le fette congelate da -80 ° C e tenerli su ghiaccio.
  2. Aggiungere 0,5 ml di fresco freddo TBS tampone contenente proteasi (PI) e fosfatasi (PS) inibitori, nel tubo. Incubare per 2-3 minuti e trasferire ad uno stereomicroscopio. ATTENZIONE: Usare guanti protettivi e un camice da laboratorio mentre si lavora con PI e PS.
  3. Sezionare la regione CA1 strato piramidale dell'ippocampo con due aghi. Utilizzare un ago per tenere la fetta con lo stereomicroscopio e il secondo ago per tagliare l'area CA1.
  4. Raccogliere il CA sezionato1 Le regioni da 5 fette (per ogni gruppo) in una nuova provetta da 1,5 ml contenente 50 ml di tampone di lisi (1X tampone di lisi ipotonico contenente, in mM: 10 HEPES, 1.5 MgCl2, 10 KCl, pH 7.9, con PI e PS). Si noti che questa quantità di materiale sarà sufficiente per eseguire 2-3 immunoblot.
  5. Omogeneizzare i tessuti raccolti da un'attenta pipettando su e giù. Utilizzare una pipetta 200 microlitri. Incubare il lisato in ghiaccio per 5-7 minuti per consentire alle cellule a gonfiarsi.
  6. Prendete 2 ml di lisato, goccia su un vetrino microscopico, e visualizzare il gonfiore delle cellule al microscopio in campo chiaro. Con una corretta gonfiore delle cellule nuclei appaiono come rotondo strutture intatte.
  7. Raccogliere 20 ml di campione in una nuova provetta da 1,5 ml come 'frazione omogeneizzato'. Aggiungere 8 ml di denaturazione 4x tampone campione SDS.
  8. Centrifugare i restanti lisati a 11.000 rpm per 1 min.
  9. Raccogliere con cautela il surnatante dalla cima ('frazione citosolica'), transfer in un nuovo tubo e aggiungere 20 ml di tampone campione 4x.
  10. Risospendere il pellet in 60 ml di tampone ipotonico e aggiungere 20 ml di tampone campione 4x. Questa frazione è indicato come un 'frazione arricchita nucleare'.
  11. Omogenato, citosolico, e le frazioni arricchite nucleari possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C per immunoblotting tardi.

5. Immunoblotting semiquantitativa di proteine ​​Synapto-nucleari

  1. Scongelare i campioni e farli bollire per 5 min a 95 ° C.
  2. Prendere 5 ml di ogni frazione e determinare la concentrazione di proteine ​​da amido di prova nero o prova BCA.
  3. Carico pari quantità di campioni di proteine ​​da omogenato, frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari su SDS-PAGE. I campioni di controllo e fette LTP devono essere posizionati sullo stesso gel per il confronto diretto.
  4. Eseguire una procedura di western-blotting standard (trasferimento umido è consigliato).
  5. Sonda le membrane con tegli anticorpi di scelta. Successivamente le stesse macchie (o gli stessi campioni eseguiti in parallelo) possono essere sondati con un pennarello citoplasmatica - enolase2 neurone specifica (NSE2) e marcatore nucleare - NeuN e un anticorpo actina come controllo di caricamento.

Analisi 6. Dati

  1. L'efficienza di induzione di LTP può essere analizzato dal software Clampfit. La pendenza media di registrazioni di base è stato confrontato con le piste dopo tetanization utilizzando ANOVA a due vie, p <0.05 è stato considerato significativamente differenti. I valori di pendenza fEPSP sono stati rappresentati nei diagrammi come media ± SEM
  2. Per la quantificazione di immunoblot, scanditi il ​​film autoradiografica e analizzare la densità integrata delle bande proteiche da ImageJ o bande di fluorescenza con un sistema di Licor. I valori delle bande immunoreattive devono essere normalizzati per il controllo di carico e assorbente. Per il confronto del controllo e gruppi di LTP può essere utilizzato un nonparametrical Mann-Whitney U-test.
Nome del buffer Reagente Concentrazione (mM) Quantità Commenti / Descrizione
Di Gey soluzione (pH: 7.3 ~ 7.4) NaCl 130 7.6 g filtrazione sterile
1.000 ml KCl 4.9 0.37 g
CaCl 2 · 2H 2 O 1.5 0.22 g
MgSO 4 · 2H 2 O 0.3 0,0739 g
MgCl 2 · 6H 2 O 11 2.24 g
KH 2 PO 4 0.23 0,0313 g
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.8 0,2145 g
Glucosio · H 2 O 5 0,9909 g
HEPES 25 5.96 g
NaHCO3 22 1.85 g
ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) NaCl 110 6,428 g filtrazione sterile
1.000 ml KCl 2.5 0,1865 g
CaCl 2 · 2H 2 O 2.5 0,368 g
MgSO 4 · 2H 2 O 1.5 0,370 g
KH 2 PO 4 1.24 0,169 g
Glucosio · H 2 O 10 1,9817 g
NaHCO3 27.4 2.3 g
1x ipotonico tampone (pH: 7,9) HEPES 10 0.23 g
100 ml MgCl 2 · 6H 2 O 1.5 0,0304 g
KCl 10 0,07455 g

Tabella 1 Buffer.

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Representative Results

Abbiamo precedentemente dimostrato che la Synapto-nucleare proteina messenger Giacobbe si accumula nel nucleo dopo l'induzione di LTP, ma non LTD 1. Inoltre, traslocazione di Giacobbe dopo stimolazione sinaptica richiede l'attivazione di MAPK ERK1 / 2 e la fosforilazione di Giacobbe a Ser180 (Figura 1). Fosforilata Jacob trasloca al nucleo in modo importina-dipendente e lo stato fosforilato può essere conservato per lunghi periodi di tempo prolungati per associazione con il filamento intermedio αinternexin 15 (Figura 1). Il fosfo-stato di Giacobbe è importante per l'espressione di geni di attività-dipendente e la sopravvivenza cellulare. È interessante notare che, attivazione di NMDARs extrasinaptica spinge anche Jacob nel nucleo, ma in questo caso Giacobbe non è fosforilata in Ser180 e l'accumulo nucleare induce CREB 'spento' 5,10. I risultati sopra descritti sono stati ottenuti da Protocols stabiliti nel nostro recente studio (vedi Karpova et al. 10 per una descrizione dettagliata del modello).

Per dimostrare che Giacobbe trasloca nel nucleo dopo induzione di LTP, abbiamo indotto e misurato l'induzione di Schaffer collaterale fEPSP potenziamento in fettine di ippocampo acute e successivamente isolati nuclei neuronali da neuroni CA1 (figure 2 e 3). Abbiamo confrontato due diversi punti di tempo dopo l'applicazione della stimolazione ad alta frequenza (2 min e 30 min) e registrato l'induzione di LTP per ogni fetta che è stata successivamente trattati per l'isolamento nucleare e Western blotting (figure 2 e 3). Arricchimento del marcatore nucleare neuronale NeuN può essere visto nella frazione arricchita nucleare preparata dalla regione CA1 sezionato, mentre citosolica marcatore enolase2 neurone specifica (NSE) è presente soprattutto nella frazione surnatante ottenuto dopo centrifugazione del lisato cells (Figura 4A). La specificità di anticorpi pS180 Jacob è stato caratterizzato in precedenza (per i dettagli vedi Karpova et al. 10). livelli pS180 Jacob è rimasto inalterato in totale omogenati di proteine ​​CA1 e nel arricchito frazione di 2 min nucleare dopo tetanization (Figura 4B), ma abbiamo trovato un aumento significativo pJacobS 180 immunoreattività 30 minuti dopo l'induzione di LTP (Figura 4C), confermando che Jacob translocating al nucleo in questo modello plasticità cellulare è fosforilata in Ser180.

Figura 1
Figura 1 Jacob fosforilata in S180 codifica all'origine sinaptica di segnali NMDARs. Stimolazione tetanica delle fibre collaterali di Schaffer dell'ippocampo risultati in attivazione di NMDARs sinaptiche e la successiva attivazione di MAPKERK1 / 2 cascata di segnalazione. Attivato ERK1 / 2 si lega e fosforila Giacobbe a serina 180 e Jacob-ERK1 complesso / 2 trasloca nel nucleo e questo correla con l'attività CREB maggiore e l'attivazione della plasticità legati espressione genica.

Figura 2
Figura 2 Attrezzature e strumenti utilizzati per l'induzione LTP e sezionare la regione CA1 di fettine di ippocampo. A) Vibratome usato per la preparazione di fettine di ippocampo acute (1 - Vibratome) B1-2) Elettrofisiologia e configurazione di imaging (2 - microscopio; 3 - Micromanipolatore e sistema di perfusione; 4 - elettrodi Ricodifica; 5 - elettrodo di stimolazione; 6 - Acqua lente obiettiva ; 7 - Fetta supporto con fetta dell'ippocampo) C) Impianti utilizzati per la dissezione della regione CA1 di fettine di ippocampo (8 Stereomicroscope; 9 - Siringa con aghi; 10 - Piccole forbici chirurgiche; 11 - bisturi; 12 - plastica pipetta Pasteur, 13 - spatola sottile; 14-100 mm piatto cultura di plastica riempito di ghiaccio-acqua, e 40 millimetri piatto cultura plastica utilizzata per la dissezione di fette.

Figura 3
Figura 3 Cartoon dimostrare la procedura sperimentale. Numeri indicano passi nel protocollo. 2,1-2,8) Una fetta dell'ippocampo acuta nella camera sommersa con elettrodi di vetro posizionati nella radiatum falda per il potenziamento di Schaffer collaterale-CA1 Sinapsi. L'inserto rappresenta le tracce analogiche campione fEPSP, la barra orizzontale indica 5 msec e la barra verticale indica 0,5 mV. 3.3) Le fette sono stati raccolti in provette da 1,5 ml dopoRegistrazione LTP e Snap congelato. 4.3) Dissezione della regione CA1 da adulti fettine di ippocampo di ratto. 4,4-4,5) regioni CA1 omogeneizzati in tampone di lisi ipotonica, che causa rigonfiamento osmotico delle cellule e il rilascio di nuclei. 4.8) Centrifugazione di lisati a 11.000 rpm per 1 min. 4.10) Raccolta delle frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari per immunoblotting. 5.3) Caricamento di frazioni arricchite citoplasmatici e nucleari su SDS-PAGE e successiva occidentale-blotting standard.

Figura 4
Figura 4 induzione di LTP CA1 porta all'accumulo di pJacS180 nel nucleo. A) immunoblot per omogenato, citosolica e frazioni arricchite nucleari di CA1 lisato sondato con citosolica e marcatori nucleari. B) immunoblot analisi del livello di pJac-S180 in omogenato 2 min e 30 min dopo induction di tetanization. C) immunoblot analisi del livello pJacS180 nel nucleare arricchito frazione 2 min e min dopo tetanization. Questi risultati fanno parte del grafico quantificazione pubblicato nella Karpova et al 10. Questi immunoblot rappresentativi non sono incluse nel alla pubblicazione originale.

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Discussion

I passi descritti nel protocollo di cui sopra forniscono una guida come preparare ippocampale acuta affettato da giovani o adulti ratti, induce e registrare LTP, rapidamente sezionare zona stimolata di slice, e preparare frazione arricchita nucleare per lo studio di attività dinamica delle proteine ​​dipendenti. Questo approccio deriva dalla combinazione di diversi metodi utilizzati indipendentemente l'uno dall'altro. Abbiamo ottimizzato il flusso di lavoro e fornire sufficienti dettagli per il principiante di creare i propri esperimenti per studiare la ridistribuzione subcellulare delle proteine ​​dopo induzione di LTP. Come esempio dimostriamo che il tardiva forma di LTP induce l'accumulo nucleare di S180 fosforilata Giacobbe. Per distinguere tra la fosforilazione di una piscina nucleare preesistente di una data proteina e la traslocazione della sua forma fosforilata dopo l'attività sinaptica, questo approccio può essere combinato con il controllo per il livello totale di proteina di interesse nella frazione arricchita nucleare. Inoltre, testicampioni ng più diversi punti di tempo dopo induzione di LTP possono essere molto perspicace per studiare andamento temporale della proteina di attivazione / inattivazione o fatturato nucleare.

Durante la preparazione di frazioni arricchite nucleari da fette stimolati ci sono diverse questioni metodologiche che devono essere affrontate. In primo luogo, per aumentare il numero di neuroni stimolati nella regione CA1 e la quantità di materiale per immunoblotting, applichiamo 5 mM di antagonista del recettore GABAA biccuculine durante tetanization. Biccuculine ha dimostrato di migliorare potenziali postsinaptici eccitatori 3.

In secondo luogo, la conservazione di fette dopo induzione di LTP da congelamento rapido è un passo fondamentale per esperimenti di successo per la movimentazione meccanica di fette potrebbe indurre diversi tipi di attività che correlano direttamente con i cambiamenti nella modifica di proteine. Per abbreviare la procedura, per quanto possibile, usiamo una barra di metallo posto in ghiaccio secco. Fettas può essere trasferito in una goccia di ACSF utilizzando una pipetta Pasteur di plastica e di essere congelate entro pochissimi secondi, quando sono immessi sul metallo prechilled.

Il terzo passo critico è l'arricchimento dei nuclei in lisati CA1. Si consiglia di monitorare il gonfiore delle cellule sotto il microscopio e per trovare il punto di tempo più ottimale. A volte, quando omogeneizzazione del tessuto non è stato fatto correttamente, detriti cellulari rimane ancora nei campioni. Poi il pellet nucleare può essere risospeso in tampone di lisi di nuovo, lavato per pochi minuti, e poi centrifugato per ottenere una frazione nucleare pura.

Nel complesso questo protocollo può aiutare a esploratore ulteriormente il ruolo di diverse proteine ​​messenger Synapto-nucleare nella plasticità sinaptica. La stessa procedura può essere applicata non solo ad una stimolazione indotta LTP ad alta frequenza, ma tutte le altre forme di plasticità sinaptica come LTD, modelli di plasticità a breve termine theta-burst LTP, e altri.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
CED 1401 AD/DA converter Cambridge Electronics Design, UK
Stereomicroscope Leica S4E, Germany
Vibrotome Leica VT1000S, Germany
Isolated pulse stimulator A-M Systems, USA Model 2100
Centrifuge Thermo Scientific
SDS-PAGE system Biorad
Cooler Julabo
Bright field Microscope Nikon Eclipse TS100
Cell culture incubator Thermo Electron Corporation
Micromanipulator Luigs & Neumann, SM-5, Germany
Blotting chamber and electric power supplier Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA
Submerged type recording chamber custom made
U-shape and submerged type incubator  custom made
Small surgical scissors
Scalpel
Thin spatula
Plastic Pasteur pipette
Plastic culture dish 
Bunsen beaker
Syringe
Reagents
NaCl Roth Art.-Nr.3957.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
KCl Roth Art.-Nr.6781.1 ≥99.5%, p.a., ACS, ISO
CaCl2·2H2O Merck 1.02382.0500 pro analysis
MgSO4·2H2O Merck 5886.05 pro analysis
MgCl2·6H2O AppliChem CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 for molecular biology
KH2PO4 Merck 12034.025 for molecular biology
Na2HPO4·2H2O Merck 1.06574.1000 extra pure
Glucose·H2O Roth Art.-Nr.6887.1 for molecular biology
HEPES Roth Art.-Nr.9105.4 PUFFERAN, ≥99.5%, p.a.
NaHCO3 Merck 1.06329.1000 pro analysis
Protease inhibitor cocktail Roche
Phosphostop Roche
Bicuculline Tocris Bioscience
Isoflurane Baxter
Antibodies
Primary antibodies Company Catalog Number Species
pJac-s180 Biogenes rabbit (diluted 1:100)
NeuN Milipore MAB377 mouse (diluted 1:1,000)
NSE Cell Signaling D20H2 rabbit (diluted 1:1,000)
Beta-actin Sigma A-5441 mouse (diluted 1:5,000)
Secondary antibodies Company Catalog Number Species
IgG HRP conjugated DAKO goat anti-mouse (1:5,000)
IgG HRP conjugated NEB goat anti-rabbit (1:5,000)

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References

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