कैंसर सेल आक्रमण करने के लिए आवेदन के साथ ट्यूमर Stromal microenvironment के ऊतक इंजीनियरिंग

1Division of Cancer Research, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee, 2Institute of Medical Biology, A*Star, Singapore
Bioengineering

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Summary

ऊतक इंजीनियर fibroblast व्युत्पन्न देशी मैट्रिक्स उपकला सेल प्रसार और भेदभाव का समर्थन करता है जो एक स्ट्रोमल सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए एक उभरते उपकरण है. यहाँ ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान पर अलग stromal सेल प्रकार के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस पद्धति को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

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Ng, Y. Z., South, A. P. Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion. J. Vis. Exp. (85), e51321, doi:10.3791/51321 (2014).

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Abstract

Mesenchymal कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड एक मैट्रिक्स पर उपकला कोशिकाओं के 3 डी organotypic संस्कृतियों व्यापक रूप से उपकला सेल भेदभाव और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. मैं कोलेजन और / या Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं से व्युत्पन्न मैट्रिक्स पारंपरिक रूप से mesenchymal कोशिकाओं (आमतौर पर fibroblasts) बसा रहे हैं जिसमें मैट्रिक्स या stromal microenvironment मॉडल पर substrates के रूप में नियोजित किया गया है चूहे की पूंछ प्रकार. ऐसे matrices का उपयोग कर प्रयोगों बहुत जानकारीपूर्ण रहे हैं, यह तर्क दिया जा सकता है कि कारण (इस प्रकार मैं कोलेजन के रूप में) एक प्रोटीन या तहखाने झिल्ली घटकों और माउस से व्युत्पन्न मैट्रिक्स में के रूप में वृद्धि कारकों (के एक उच्च सामग्री की एक अधिभावी उपस्थिति को सार्कोमा कोशिकाओं), इन substrates सबसे अच्छा stromal कोशिकाओं को खुद के द्वारा किए गए मैट्रिक्स संरचना करने के लिए योगदान को प्रतिबिंबित नहीं करते. एक ट्यूमर होने का खतरा, आनुवंशिक blistering विकार (हटने dystrophic साथ रोगियों से अलग प्राथमिक त्वचीय fibroblasts द्वारा उत्पादित देशी matrices का अध्ययन करने के लिएबाह्यत्वचालयन bullosa), हम ट्यूमर सेल आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक मौजूदा देशी मैट्रिक्स प्रोटोकॉल ढाल लिया है. Fibroblasts संस्कृति में एक लम्बी अवधि में अपने स्वयं के मैट्रिक्स का उत्पादन करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. यह देशी मैट्रिक्स तो संस्कृति पकवान से अलग है और पूरे coculture हवा तरल इंटरफेस के लिए उठाया है पहले उपकला कोशिकाओं पर यह वरीयता प्राप्त हैं. सेलुलर भेदभाव और / या आक्रमण तो समय पर मूल्यांकन किया जा सकता है. इस तकनीक को ही नुकसान देशी मैट्रिक्स का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय की लंबी अवधि होने के साथ एक कृत्रिम या विदेशी मैट्रिक्स के लिए आवश्यकता के बिना एक 3 डी की स्थापना में उपकला-mesenchymal सेल बातचीत का आकलन करने की क्षमता प्रदान करता है. यहाँ हम ट्यूमर सेल आक्रमण को बाधित करने fibroblasts द्वारा व्यक्त एक अणु की क्षमता, प्रकार सातवीं कोलेजन, का आकलन करने के लिए इस तकनीक का आवेदन का वर्णन.

Introduction

3 डी टिशू कल्चर में biomaterial का उपयोग 2D आसंजन और एक प्लास्टिक सब्सट्रेट के साथ recapitulated एक की तुलना में एक vivo में पर्यावरण के सदृश शारीरिक शर्तों के तहत प्रयोगशाला में कोशिका व्यवहार का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है. विशेष रूप से, काफी प्रगति आगे हवा तरल इंटरफेस 1-4 पर 3 डी संस्कृति तरीकों को अपनाने के साथ स्तरीकृत epithelia मॉडलिंग में किया गया है. इस तरह की तकनीक ईमानदारी keratinocyte भेदभाव और इन प्रक्रियाओं का अध्ययन के लिए शोधकर्ताओं ने अधिक से अधिक लचीलापन और निष्ठा को सक्षम करने के ट्यूमर सेल आक्रमण की नकल. स्ट्रोमल पर्यावरण नकल करने biomaterial सब्सट्रेट का चुनाव मुख्य रूप से मैं कोलेजन टाइप, Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स और de-epidermized डर्मिस का उपयोग शामिल किया गया है. उदाहरण के लिए, कैंसर से जुड़े fibroblasts स्ट्रोमल उपकला बातचीत 6,7 के माध्यम से कैंसर आक्रमण 5, दीक्षा, और प्रगति की ओर योगदान दिखाया गया है when इस तरह substrates में उगाई.

त्वचा में stromal वातावरण नकल उतार के लिए सोने के मानक, इस तरह की तकनीक का उपयोग सबसे बड़े और सबसे व्यापक रूप से अध्ययन स्तरीकृत epithelia, मानव डर्मिस (DED) de-epidermized माना जाता है. Ded के तैयारी मानव शव त्वचा 3,4 से trypsinization या शारीरिक विसंघटन के माध्यम से epidermis के हटाने शामिल है. हालांकि, इस तरह के त्वचा के लिए उपयोग चिकित्सीय संस्थानों के साथ जुड़ा नहीं की प्रयोगशालाओं के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है, और रोगग्रस्त डर्मिस प्राप्त करने के लिए लगभग असंभव है. एक विकल्प के रूप में, प्रयोगशालाओं अक्सर मैं कोलेजन (चूहे की पूंछ से अलग) और / या Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स प्रकार का एक संयोजन का उपयोग करें.

कि कोलेजन 8 Nageotte द्वारा 1927 में खोज की आसानी एसिटिक एसिड और नमक वर्षा का उपयोग कर अलग किया जा सकता है के बाद, टिशू कल्चर के लिए अपने आवेदन बाद में Huzel ने बीड़ा उठायाला और उनके सहयोगियों ने 9. कोलेजन कोटिंग EHRMANN और Gey 9 से पूछताछ के रूप में 29 उपभेदों और ऊतक explants के सेल संस्कृति के लिए कांच से बेहतर साबित हुई. वर्तमान में, टिशू कल्चर में इस्तेमाल किया कोलेजन के प्रमुख प्रकार चूहा पूंछ tendons से अलग है, और आमतौर पर वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा है. हालांकि, वफादार सब्सट्रेट आवृत्ति के लिए दोष चूहे की पूंछ कोलेजन मानव कोलेजन, या प्रकार मैं और III कोलेजन प्रमुख घटक के रूप में मौजूद हैं, जहां मानव डर्मिस, के समान नहीं है, और अलग चूहे की पूंछ कोलेजन सदा ही खंडित है.

Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स सुसंस्कृत Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं 10 से स्रावित एक पतला प्रोटीन मिश्रण है. प्रमुख घटक laminin, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, हेपरिन सल्फेट proteoglycan, entactin और nidogen हैं और इन प्रोटीनों का सही अनुपात बैच से बैच के लिए अलग अलग होंगे. एक तरफ संरचनात्मक समर्थक सेteins, इस मैट्रिक्स भी इस तरह के विकास का पहलू β, epidermal वृद्धि कारक, इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर 1, गोजातीय fibroblast वृद्धि कारक, और सेलुलर व्यवहार 11,12 बदल जाएगा जो प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक बदलने के रूप में वृद्धि कारकों के महत्वपूर्ण स्तर होते हैं. Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स का सरासर जटिलता की ओर इशारा करते हुए, 1,851 प्रोटीन की कुल हाल ही में एक प्रोटिओमिक अध्ययन 13 में पहचान की गई. व्याख्या और यह 11 के उपयोग के साथ विभिन्न प्रयोगों की तुलना करते समय इस मैट्रिक्स के अमीर और जटिल प्रकृति के प्रकाश में, सावधानी की सलाह दी गई है.

हमारी प्रयोगशालाओं आनुवंशिक त्वचा रोग, त्वचा संबंधी स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (CSCC) 14 के विकास के लिए एक गड़बड़ी के साथ विशेष रूप से उन लोगों में गहरी रुचि है. पीछे हटने dystrophic बाह्यत्वचालयन bullosa (RDEB), COL7A1 जीन में germline परिवर्तन के साथ एक गंभीर blistering रोग के मामले में 18 को बढ़ावा देने के ट्यूमर है कि निर्धारित किया है. इस अध्ययन के दौरान हम कोलेजन के भीतर मैं / Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा मैट्रिक्स एम्बेडेड और कोशिकाओं 'दम, देशी मैट्रिक्स का आकलन करने के तरीकों की जांच की त्वचीय fibroblasts के गुणों को बढ़ावा देने के ट्यूमर का आकलन करने में असमर्थ थे. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हम मानव त्वचा पर काम 19,20 समकक्ष लूसी जर्मेन की प्रयोगशाला से पिछले एक तकनीक संशोधित. जर्मेन की तकनीक एक सिंथेटिक या शव का पाड़ के अभाव में प्राथमिक मानव keratinocyte और fibroblast संस्कृतियों का उपयोग अच्छी तरह से संगठित तहखाने झिल्ली के साथ मानव त्वचा को फिर से संगठित करने में सक्षम था.

इस पत्र में त्वचीय ट्यूमर stromal microenvironment (देशी मैट्रिक्स) पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया कदम विट्रो में प्राथमिक stromal fibroblasts से सीधे प्राप्त 18 से वर्णित हैं. निवासी matrices पीfibroblasts की लंबी अवधि संस्कृति से roduced CSCC सेल आक्रमण के लिए परख के बराबर एक चमड़े के रूप में इस्तेमाल किया गया. हम (प्रकार सातवीं कोलेजन (सी 7) में कमी) RDEB fibroblasts द्वारा या retrovirally ट्यूमर पर एक भी कोलेजन का गहरा प्रभाव का निर्माण और प्रदर्शन को व्यक्त एक प्रकार सातवीं कोलेजन के साथ transduced RDEB fibroblasts से स्रावित बाह्य मैट्रिक्स या तो से व्युत्पन्न देशी मैट्रिक्स का उपयोग कर डेटा पेश सेल आक्रमण.

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Protocol

इस अध्ययन हेलसिंकी सिद्धांतों की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया और उचित आचार समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट शेयर की 200x की तैयारी
    1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) समाधान के 5 मिलीलीटर प्रति एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट के 29 मिलीग्राम भंग और 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से फिल्टर. स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस में 0.25 मिलीलीटर बाँझ aliquots के रूप में
    2. एल के 0.1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए आवश्यक है, दिन पर fibroblast मीडिया (1% एल glutamine और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ DMEM) के हर 50 मिलीलीटर के लिए 200x एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट शेयर के 0.25 एमएल विभाज्य जोड़ें ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट.
  2. Keratinocyte वृद्धि मीडिया की तैयारी
    1. प्राथमिक एससीसी keratinocytes के अलगाव और संस्कृति में पहले 21 में वर्णित किया गया है. Keratinocyte वृद्धि मीडिया की तैयारी में वर्णित हैउसमें भी.
    2. के रूप में निम्नानुसार संक्षेप में, मीडिया को तैयार:
      DMEM के 300 मिलीग्राम और 10% FBS के साथ पूरक हाम एफ 12 की 100 मिलीलीटर
      0.4 मिलीग्राम / एमएल hydrocortisone
      5 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन
      10 एनजी / एमएल EGF
      5 मिलीग्राम / एमएल transferrin
      8.4 एनजी / एमएल हैजा विष
      13 एनजी / एमएल liothyronine
      1x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान

2. एल Ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट पूरक मीडिया में Fibroblast व्युत्पन्न निवासी मैट्रिक्स की इन विट्रो निर्माण में

  1. 6 अच्छी तरह प्लेटें एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट के साथ पूरक fibroblast मीडिया में (20,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) में अच्छी तरह से प्रति बीज 200,000 fibroblasts. मीडिया की 2-5 मिलीलीटर के साथ हर 2-3 दिनों Refeed. (नोट: refeeding आवृत्ति और मात्रा अलग कक्षों की व्यक्तिगत आवश्यकताओं के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है "चर्चा" देखें.).
  2. बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेडेड कोशिकाओं की एक मोटी परत नग्न आंखों को दिखाई 6 सप्ताह, (के अंत में बनेगी
  3. देशी मैट्रिक्स नाव और हर 2-3 दिनों मीडिया से बदल रहा है, 5 दिनों के लिए फिर से तैयार. कारण तन्य शक्ति और मैट्रिक्स के भीतर आंतरिक remodeling के लिए, मैट्रिक्स काफी अनुबंध और एक छोटे, लेकिन मोटा देशी मैट्रिक्स के लिए कम हो जाते हैं, और आक्रमण परख के लिए उपयोग किया जा करने के लिए तैयार है होगा.

3. ट्यूमर एससीसी Keratinocytes साथ आक्रमण परख

  1. कुंद संदंश के साथ धीरे देशी मैट्रिक्स उठाओ और नायलॉन शुद्ध करने के लिए स्थानांतरण. एक बार नायलॉन नेट पर, एक 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग संभव के रूप में फ्लैट झूठ धीरे मैट्रिक्स फैलटिप और कुंद संदंश.
  2. एक छोर पर बाँझ वैसलीन की एक छोटी राशि smearing द्वारा बाँझ प्रतिरूप सिलेंडरों तैयार करें.
  3. नीचे वैसलीन पक्ष के साथ, देशी मैट्रिक्स पर प्रतिरूप सिलेंडरों रखें. यह देशी मैट्रिक्स और प्रतिरूप के छल्ले के बीच एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए है.
  4. क्लोनल सिलेंडर (keratinocyte विकास मीडिया के 100 μl में 250,000 कोशिकाओं) को CSCC कोशिकाओं जोड़ें.
  5. CSCC कोशिकाओं देशी मैट्रिक्स पर नीचे बसे है जब 6 घंटे के बाद प्रतिरूप सिलेंडरों निकालें.
  6. तुला स्टेनलेस स्टील वायर जाल समर्थन पर हवा तरल इंटरफेस का निवासी मैट्रिक्स और CSCC कोशिकाओं के साथ नायलॉन नेट उठा.
  7. मीडिया स्तर देशी मैट्रिक्स के नीचे छू तक एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक keratinocyte विकास मीडिया जोड़ें.
  8. 7 पर हर 2-3 दिन और फसल मीडिया को बदलें और CSCC कोशिकाओं के 14 दिनों के बाद बोने.

4. 3 डी संस्कृतियों की कटाई और प्रोटोकॉल के लिए तैयार

  1. 4% बराबर में फिक्सकमरे के तापमान पर aformaldehyde रातोंरात.
  2. कटौती की सतह के बाहर का सामना करना पड़ के साथ formalin-तय आयल एम्बेडेड ब्लॉकों के लिए मोम में नमूने और एम्बेड, द्विविभाजित.
  3. वैकल्पिक रूप से, अक्टूबर में bisected नमूने एम्बेड और तस्वीर फ्रीज तुरंत ताजा जमे हुए ऊतक ब्लाकों के लिए तरल नाइट्रोजन में.
  4. सूक्ष्म और dewax पर 4 माइक्रोन वर्गों (यदि आवश्यक हो तो) में कटौती. मानक haematoxylin और eosin का उपयोग दाग. CSCC कोशिकाओं कल्पना, केरातिन 14 के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (LL001, घर में) immunohistology धुंधला में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

इस तकनीक का परीक्षण और विभिन्न 3 डी स्ट्रोमल वातावरण के तहत इस मामले (CSCC में) ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार की तुलना की संभावना को खोलता है. इस तकनीक का उपयोग करना, RDEB चमड़े का वातावरण recapitulated कि C7 की कमी देशी matrices न केवल उत्पन्न, लेकिन यह भी आनुवंशिक रूप से अधिक व्यक्त सी 7 से 18 इंजीनियर किया गया है कि अतिरिक्त matrices किया जा सकता है. चित्रा 2 में देखा, RDEB CSCC keratinocytes के आक्रमण C7 की कमी RDEB नियंत्रण की तुलना में C7-overexpressing देशी matrices में काफी मंद था. इस आक्रमण जैल, फिक्स्ड तेल ब्लॉकों में एम्बेडेड और फिर sectioned और immunostained गया जहां मानक histological तरीकों के माध्यम से कल्पना की है. धुंधला के लिए उपयोग करने का सुझाव दिया एंटीबॉडी CSCC कोशिकाओं और fibroblasts के लिए विरोधी vimentin (v9) के लिए विरोधी केरातिन 14 (LL001) कर रहे हैं.

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चित्रा 1. Fibroblast व्युत्पन्न देशी मैट्रिक्स और ट्यूमर आक्रमण परख की पीढ़ी के कार्यप्रवाह. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. C7 में fibroblast कमी नियंत्रण RDEB से व्युत्पन्न देशी मैट्रिक्स में CSCC आक्रमण की केरातिन 14 (LL001) धुंधला (एअर इंडिया और बीआई), या RDEB fibroblasts में अधिक व्यक्त पूर्ण लंबाई C7 अभिव्यक्ति (वो और BII), स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि फिर से अभिव्यक्ति बाह्य मैट्रिक्स में सी 7 की CSCC keratinocyte आक्रमण धीमा कर सकते हैं. नाभिक (नीला) में DAPI के साथ दाग रहे थे और द्वि और BII में (हरे रंग में) vimentin साथ fibroblasts.

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Discussion

इस वजह से यह प्रयोग की प्रकृति के पूरा होने के लिए आवश्यक कुल समय दो महीने तक किया जा सकता है. इस समय के दौरान, अत्यंत सावधानी और बाँझ टिशू कल्चर प्रथाओं माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए.

एक तरफ हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन और कोलेजन की hydroxylysine के संश्लेषण में एक cofactor के रूप में अपनी भूमिका से, एस्कॉर्बिक एसिड fibroblasts 22 में कोलेजन विशिष्ट mRNA अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है. यहां चुनाव के एस्कॉर्बिक एसिड अधिक स्थिर एल ascorbic एसिड 2 फॉस्फेट 23 है. Refeeding सप्ताह में तीन बार की सलाह दी है, लेकिन यह हमेशा अध्ययन किया जा रहा कोशिकाओं पर निर्भर हो जाएगा. सप्ताह बीत जाने के रूप में प्रारंभिक fibroblast संस्कृतियों अधिक पोषक तत्वों की खपत होगी, और बड़े मीडिया संस्करणों के साथ अधिक लगातार refeeding सलाह दी जा सकती. यह बदलते मीडिया और देखभाल देशी मैट्रिक्स उत्पादन के दौरान सेल परत को गड़बड़ी को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए जब कोमल होना जरूरी है.

मैट्रिक्स विशेष रूप से अच्छी तरह से की परिधि के चारों ओर, आम तौर पर 2 सप्ताह के बाद दिखाई देने लगते हैं चाहिए. कभी कभी, मैट्रिक्स कोई यांत्रिक व्यवधान के बिना ही मुक्त होगा. यह अंदर की ओर मैट्रिक्स खींचती है जो मैट्रिक्स और तन्य शक्ति, के आंतरिक remodeling के एक प्रतिबिंब है, लेकिन यह भी देशी मैट्रिक्स की परिधि मीडिया परिवर्तन के दौरान परेशान थी कि एक संकेत हो सकता है.

जारी है और थाली से मैट्रिक्स सेल परत को मुक्त करते हैं, एक मैट्रिक्स के माध्यम से छेद प्रहार करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. लघु कुंद सेल स्क्रेपर्स भी 1 मिलीलीटर micropipette सुझावों के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक नायलॉन पर जारी की देशी मैट्रिक्स के प्लेसमेंट (फ्लैट देशी मैट्रिक्स रखना करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा) हवा तरल इंटरफेस बहुत आसान हैंडलिंग और बाद में उठाने के लिए बनाता पहली जाल.

इस प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सबसे पहले हैअधिक सटीक और physiologically प्रासंगिक डेटा प्राप्त करने के क्रम में ट्यूमर सेल assays में microenvironment मॉडल पर एक चमड़े का सब्सट्रेट के रूप में देशी fibroblast मैट्रिक्स का उपयोग.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

ए पी एस Debra अंतर्राष्ट्रीय और ब्रिटिश त्वचा फाउंडेशन द्वारा समर्थित है. डंडी भागीदारी पीएचडी कार्यक्रम के विश्वविद्यालय - YZN ए स्टार * द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate Life Technologies 11995-073
100x Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15070
Vaseline VWR PROL28908.290
Clonal cylinders Sigma Z370789
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk Millipore NY1H02500
Bent stainless steel wire mesh support Made in house Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates

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References

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