कतरनी तनाव के मानव यकृत Sinusoidal अन्तःस्तर जिन स्थितियों को Leucocyte भर्ती अध्ययन के लिए एक फ्लो आसंजन परख

Immunology and Infection
 

Summary

जिगर के श्वेतकोशिका भर्ती अनूठा यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं से तैयार कर रहे हैं जो यकृत sinusoids की विशेष चैनलों के भीतर होता है. शारीरिक कतरनी तनाव की शर्तों के तहत मानव यकृत sinusoidal अन्तःचूचुक भर श्वेतकोशिका भर्ती के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी इस प्रक्रिया कायम करना जो आणविक तंत्र की व्याख्या कर सकते हैं सुविधा.

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Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. J. Vis. Exp. (85), e51330, doi:10.3791/51330 (2014).

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Abstract

मानव यकृत के ऊतकों में श्वेतकोशिका घुसपैठ सभी वयस्क भड़काऊ यकृत रोगों में एक सामान्य प्रक्रिया है. क्रोनिक घुसपैठ सिरोसिस को फाइब्रोसिस और प्रगति के विकास ड्राइव कर सकते हैं. जिगर के श्वेतकोशिका भर्ती मध्यस्थता कि आणविक तंत्र को समझना जिगर की बीमारी के लिए महत्वपूर्ण चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान कर सकता है. श्वेतकोशिका भर्ती के दौरान कुंजी बातचीत कतरनी तनाव की शर्तों के तहत अन्तःचूचुक साथ भड़काऊ कोशिकाओं की है. जिगर में भर्ती यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं (HSEC) द्वारा तैयार कर रहे हैं जो यकृत sinusoids की कम कतरनी चैनलों के भीतर होता है. यकृत sinusoids भीतर स्थितियां विशिष्ट प्रवाह दरों पर मानव HSEC monolayers से अटे चैनलों के माध्यम से ल्यूकोसाइट perfusing द्वारा recapitulated किया जा सकता है. इन परिस्थितियों में ल्यूकोसाइट endothelial भर में एक रेंगने कदम और बाद स्थानांतरगमन द्वारा पीछा सक्रियण और फर्म आसंजन के बाद एक संक्षिप्त tethering कदम से गुजरनापरत. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, इस 'आसंजन झरना' के हर कदम कल्पना और ऑफ़लाइन विश्लेषण के बाद दर्ज किया जा सकता है. Endothelial कोशिकाओं या ल्यूकोसाइट इस प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए inhibitors के साथ pretreated किया जा सकता है.

Introduction

अब यह अच्छी तरह से सामान्य रूप में श्वेतकोशिका भर्ती multistep आसंजन झरना 1 का प्रतिमान है कि इस प्रकार की स्थापना की है. इस पोत दीवार अस्तर endothelial कोशिकाओं द्वारा रक्त बहने से ल्यूकोसाइट का कब्जा शामिल है. प्रारंभ में, ल्यूकोसाइट रिसेप्टर्स या इम्युनोग्लोबुलिन superfamily के सदस्यों selectin द्वारा मध्यस्थता है जो एक रोलिंग कदम से गुजरना. यह जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) endothelial glycocalyx पर प्रस्तुत chemokines से सक्रिय हो श्वेतकोशिका सतह पर व्यक्त की अनुमति देता है. इस श्वेतकोशिका सतह पर एक 'उच्च आत्मीयता' राज्य के लिए integrin पुष्टि की परिवर्तन की ओर जाता है और गिरफ्तारी और endothelium के लिए फर्म आसंजन. फर्म आसंजन तब पोत पर श्वेतकोशिका का आकार परिवर्तन और रेंगने द्वारा पीछा किया जाता है. अंतिम चरण paracellular या transcellular मार्गों के माध्यम से हो सकता है, जो endothelial monolayer, के माध्यम से पुनर्जन्म है.

Multistep आसंजन झरना का वर्णन करते समयशरीर के भीतर श्वेतकोशिका भर्ती की सामान्य प्रक्रिया अंग विशिष्ट मतभेद हैं. जिगर में श्वेतकोशिका भर्ती के बहुमत भर्ती आम तौर पर बाद केशिका venules 2 के भीतर होता है, जहां अन्य अंगों के विपरीत यकृत sinusoids के भीतर होता है. यकृत sinusoids एक कम कतरनी वातावरण हैं और ल्यूकोसाइट स्वतंत्र 2 selectin है जो आसंजन दृढ़ करने से पहले एक संक्षिप्त tethering कदम से गुजरना. ये चैनल टूटनेवाला है और fenestrae, व्यास में खुले pores 100-200 एनएम होता है जो यकृत sinusoidal अन्तःचूचुक से लाइन में खड़ा है, और एक तहखाने झिल्ली 3 कमी कर रहे हैं. मानव यकृत sinusoidal अन्तःचूचुक भर श्वेतकोशिका भर्ती मध्यस्थता कि आणविक तंत्र elucidating अंग सूजन यकृत रोगों के लिए विशेष चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान कर सकता है.

फ्लो आसंजन assays श्वेतकोशिका भर्ती का अध्ययन करने में आवश्यक उपकरण हैं. वे अनुमति श्वेतकोशिका recru का पुनर्निर्माणअच्छी तरह से परिभाषित बलों के तहत आसंजन का विश्लेषण करने के लिए कतरनी तनाव की उपस्थिति में itment. परख के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल सुसंस्कृत endothelial monolayers या शुद्ध substrates के लिए अध्ययन श्वेतकोशिका आसंजन है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह कक्षों दो फ्लैट सतहों के बीच लामिना का प्रवाह की शर्तों के तहत कोशिकाओं छिड़कना और फिर एक माइक्रोस्कोप 4 पर आसंजन की गतिशील प्रक्रिया कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. पिछला समूहों कुछ चिपकने वाली बातचीत केवल प्रवाह के तहत जगह ले दिखा दिया है कि और स्थिर assays 5,6 में अध्ययन नहीं किया जा सकता.

हम यकृत sinusoids पुनरावृत्ति और कम कतरनी तनाव की शर्तों के तहत श्वेतकोशिका भर्ती अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. प्राथमिक मानव HSEC microslides और ल्यूकोसाइट में सुसंस्कृत हैं तो यकृत sinusoids भीतर कतरनी तनाव को पुन: पेश करने के लिए गणना प्रवाह की दर पर इस monolayer अधिक perfused किया जा सकता है. कतरनी तनाव OPP के रूप में एक सतह के समानांतर या स्पर्शरेखा लागू किया जाता है कि एक तनाव हैसीधा है, जो सामान्य तनाव को osed. एक सीमा के साथ बढ़ रहा है कि कोई भी तरल पदार्थ है कि सीमा पर एक कतरनी तनाव लागू होगा. कतरनी तनाव लिम्फोसाइट स्थानांतरगमन 7 का एक अनिवार्य घटक होना दिखाया गया है. इन शर्तों के तहत आसंजन झरना के प्रत्येक चरण चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं. यह विधि पारंपरिक आसंजन अणुओं 8 के अध्ययन, chemokines और केमोकाइन रिसेप्टर्स 9-11 की भूमिका, और संवहनी आसंजन प्रोटीन -1 (VAP-1 के रूप में असामान्य आसंजन अणुओं सहित जिगर के भीतर ल्यूकोसाइट की भर्ती में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की अनुमति दी है ) 8,12 और आम लसीका और संवहनी endothelial रिसेप्टर 1 (चालाक -1) 13. इस परख हमारे समूह के प्रकाशनों के कई में उल्लेख किया गया है, whilst अपने विवरण संक्षिप्त किया गया है और हम समस्या निवारण में मदद मिलेगी और तकनीकी त्रुटियों को रोकने के लिए कदम गाइड द्वारा एक विस्तृत कदम प्रदान करने के लिए इस अवसर ले लिया है जब प्रयासपरख रही है. इसके अलावा, हम हाल ही में कतरनी तनाव में सही परिवर्तन की अनुमति देता है जो microslide कक्षों की सोर्सिंग को बदल दिया है. हम यह अन्य endothelial और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परख की प्रयोज्यता broadens विश्वास करते हैं. निम्न विधि मानव यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं और परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों के साथ एक प्रवाह आधारित आसंजन परख से बाहर ले जाने के लिए तैयार करने और तकनीक का वर्णन है.

Protocol

1. Microslide तैयारी

  1. PRECOAT चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार मैं (220 माइक्रोग्राम / एमएल के एक काम के कमजोर पड़ने देने पीबीएस 1:100 में पतला आरटीसी) के साथ एक छह चैनल microslide. यह सीधे चैनलों में पतला आरटीसी समाधान के 30 μl इंजेक्शन लगाने और पीबीएस के साथ तीन washes के द्वारा पीछा 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए incubating द्वारा किया जाता है.

2. Microslides में सीडिंग प्रकोष्ठों

  1. Trypsin-EDTA में (पहले 13 में वर्णित के रूप में जिगर ऊतक से अलग) सुसंस्कृत मानव यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं का एक मिला हुआ T75 फ्लास्क (HSEC) अलग कर देना, पूरा मीडिया (मानव endothelial में 3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पीबीएस में धोने, और resuspend बेसल मीडिया 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% गर्मी निष्क्रिय अटल बिहारी मानव सीरम, संवहनी endothelial वृद्धि कारक के 10 एनजी / एमएल और hepatocyte वृद्धि कारक के 10 एनजी / एमएल) के साथ पूरक. सख्त सेल निलंबन के 30 μl इंजेक्षनctly प्रत्येक चैनल में.
  2. कोशिकाओं 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए पालन करने के लिए छोड़ दो एक स्लाइड रैक पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ सी °. कोशिकाओं पूरा मध्यम (चित्रा 1) के साथ प्रत्येक चैनल के दोनों तरफ बंदरगाहों को भरने के पालन करने की अनुमति के बाद.

3. प्रकोष्ठों की साइटोकाइन उत्तेजना

  1. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को छोड़ दें. एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग सेल के विकास का आकलन करें. पूर्व आसंजन परख के लिए 24 घंटा, ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा और इंटरफेरॉन गामा के पूरक पूरा मीडिया, 10 एनजी / एमएल पर दोनों के साथ विकास मीडिया की जगह से साइटोकाइन साथ endothelial monolayers को प्रोत्साहित.

4. परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों का अलगाव

  1. शुरू में 800 में 25 मिनट के लिए एक उपयुक्त सेल जुदाई centrifugation मीडिया पर घनत्व ढाल centrifugation द्वारा मोनोन्यूक्लियर अंश सफ़ाई से पूरे रक्त से परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों पृथकएक्स जी. Monocytes के पालन की अनुमति के लिए 1 घंटे के लिए प्लास्टिक पर कोशिकाओं को सेते हैं.
  2. प्लास्टिक महाप्राण के पालन के बाद लिम्फोसाइट सतह पर तैरनेवाला समृद्ध. लिम्फोसाइटों धो और प्रवाह के माध्यम में (आमतौर पर 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल (endothelial बेसल मीडिया 0.1% से युक्त (v / v) गोजातीय सीरम albumin (BSA)) उन्हें resuspend.

5. Inhibitors के साथ अन्तःस्तर या ल्यूकोसाइट की pretreatment

  1. Endothelial media/0.1% (v / v) BSA में समारोह अवरुद्ध एंटीबॉडी या छोटे अणु inhibitors की सिफारिश की dilutions तैयार. 30 मिनट पूर्व परख प्रवाह करने के लिए चुना microslide चैनल में एंटीबॉडी / अवरोध करनेवाला अवरुद्ध समाधान के साथ पूरा मध्यम बदलें.
  2. लिम्फोसाइटों पर केमोकाइन रिसेप्टर्स की pretreatment की योजना बनाई है कहां, (v / v) बीएसए 0.1% से युक्त RPMI समाधान में पृथक ल्यूकोसाइट resuspend और केमोकाइन रिसेप्टर्स की जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर गतिविधि को ब्लॉक करने के लिए पर्टुसिस विष के 200 एनजी / एमएल के साथ सेते हैं, वैकल्पिक रूप से विशिष्ट पतला समारोहसिफारिश की कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी या केमोकाइन रिसेप्टर्स के छोटे अणु inhibitors अवरुद्ध. तब प्रवाह माध्यम में धो और resuspend, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ल्यूकोसाइट सेते हैं.

6. फ्लो परख प्रणाली की स्थापना

  1. 37 को एक thermostatically नियंत्रित पारदर्शी चैम्बर Prewarm डिग्री सेल्सियस चैम्बर वस्तुतः कोई मृत मात्रा के साथ कोशिकाओं और मीडिया के बीच स्विचिंग सक्षम बनाता है कि एक इलेक्ट्रॉनिक solenoid वाल्व के लिए सिलिकॉन टयूबिंग और इलेक्ट्रॉनिक आपूर्ति की प्रविष्टि के लिए बंदरगाहों होना चाहिए. चैम्बर की अनुमति के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी. चित्रा 2 खुर्दबीन मंच पर रखा प्रवाह परख कक्ष और माइक्रोस्कोप और microslide दर्शाता है.
  2. बाँझ आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के साथ एक luer ताला के साथ एक 50 मिलीलीटर गिलास सिरिंज भरें और सिरिंज बंदरगाह के लिए 25 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग की लंबाई देते हैं. एक सिरिंज पंप में डालें. के अनुसार सिरिंज पंप की वापसी की दर में परिवर्तन0.05 पेंसिल्वेनिया (0.5 डाएन / 2 सेमी, चित्रा 3) की एक कतरनी तनाव बनाए रखने के लिए microslide निर्माता के निर्देशों का.
  3. , दो 5 मिलीलीटर सीरिंज ले लो plungers त्यागने और सिलिकॉन टयूबिंग का उपयोग कर एक इलेक्ट्रॉनिक solenoid वाल्व में से दो में प्रवाह बंदरगाहों के लिए बैरल देते हैं.
    1. बाहर प्रवाह वाल्व के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के 12 सेमी देते हैं. वाल्व एक कोशिका मुक्त धोने बफर (endothelial media/0.1% (v / v) बीएसए) और लिम्फोसाइट निलंबन के बीच प्रत्यावर्तन परमिट.
    2. दोनों सिरिंज बैरल में धोने बफर डालने और बफर प्रति बैरल से वाल्व के माध्यम से और बाहर प्रवाह सिलिकॉन टयूबिंग में बह रही है सुनिश्चित करने के द्वारा इलेक्ट्रॉनिक solenoid वाल्व फ्लश.
    3. अन्य बैरल के लिए वैकल्पिक और बफर बह रही है और सभी बुलबुले प्रणाली से हटा रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए वाल्व स्विच का उपयोग करें. बैरल में से एक से धो बफर निकालें और लिम्फोसाइट निलंबन चित्रा -4 ए के साथ बदलें.
  4. सिलिकॉन tubin कनेक्टएक microslide एडाप्टर के माध्यम से एक चुना microslide चैनल के एक बंदरगाह के लिए सिरिंज पंप से जी. फिर एक microslide एडाप्टर के माध्यम से विपरीत बंदरगाह के लिए बहिर्वाह वाल्व से सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट. सिलिकॉन टयूबिंग और एडेप्टर हवाई बुलबुले प्रणाली (चित्रा 4 बी) में प्रवेश को रोकने के लिए पहले कनेक्शन के लिए धोने बफर से भर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  5. एक बार प्रवाह प्रणाली से जुड़ी खुर्दबीन मंच पर microslide जगह है और आंदोलन को रोकने के लिए क्लिप या टेप के साथ देते हैं. उचित चरण की स्थापना के साथ एक साथ 10X उद्देश्य के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें. Endothelial monolayer कल्पना है सुनिश्चित करें और ध्यान में नेत्र लेंस का उपयोग कर. सुनिश्चित छवियों छवियों को एक मॉनिटर करने के लिए relayed और दर्ज किया जा सकता है जिससे माइक्रोस्कोप से जुड़ा हुआ है जो एक कैमरा के माध्यम से कब्जा कर लिया जा सकता है.

7. विश्लेषण के लिए आसंजन की परख तकनीक और रिकॉर्डिंग प्रवाह

  1. Withdrawa शुरू होने से 2 मिनट के लिए धोने बफर के साथ endothelial परत छिड़कनाकिसी भी मलबे या अनबाउंड अवरुद्ध एंटीबॉडी निकालें और फिर 0.05 फोनों की एक निरंतर दीवार कतरनी तनाव में श्वेतकोशिका समाधान के लिए एक 5 मिनट सांस में अनुमति देने के लिए वाल्व स्विच करने के लिए सिरिंज पंप के एल
  2. श्वेतकोशिका सांस के अंतिम 2 मिनट के दौरान, microslide की लंबाई के साथ 10 यादृच्छिक क्षेत्रों रिकॉर्ड. इस endothelial monolayer पर लिम्फोसाइट रोलिंग / tethering के ऑफ़लाइन विश्लेषण की अनुमति देता है. अगले करने के लिए जाने से पहले लगभग 10 सेकंड के लिए प्रत्येक क्षेत्र रिकॉर्ड और रिकॉर्डिंग दो बार जल्दी उत्तराधिकार में यही रोलिंग सेल रिकॉर्डिंग से बचने के प्रवाह की दिशा के खिलाफ किए गए हैं जो सुनिश्चित करते हैं.
  3. इसके शुरू की स्थिति के लिए वाल्व लौटने से धोने बफर के एक 5 मिनट सांस के साथ श्वेतकोशिका सांस का पालन करें. इस सांस की अंतिम 2 मिनट के दौरान microslide की लंबाई के साथ कम से कम 10 बेतरतीब ढंग से चुनी क्षेत्रों का चयन करके एक दूसरे रिकॉर्डिंग चरण के लिए बाहर ले. अगले करने के लिए जाने से पहले लगभग 5 सेकंड के लिए प्रत्येक क्षेत्र रिकॉर्ड और यह सुनिश्चित करें कि endothelial monolayer और पक्षपाती leucocytes स्पष्ट ध्यान में हैं. इस आसंजन के पैटर्न के ऑफ़लाइन विश्लेषण की अनुमति देता है.

Representative Results

यह परख multistep प्रवाह आसंजन झरना कल्पना और आणविक inhibitors के साथ उन लोगों के लिए नियंत्रण प्रयोगों के परिणामों की तुलना द्वारा अंतर्निहित आणविक तंत्र को स्पष्ट करने की क्षमता है. विभिन्न संवहनी बेड विशिष्ट endothelial कोशिकाओं को शामिल करने और कतरनी तनाव की स्थिति बदलकर recapitulated किया जा सकता है.

आसंजन झरना के हर कदम प्रोटोकॉल में उल्लिखित रिकॉर्डिंग विधि का पालन करके ऑफ़लाइन विश्लेषण किया जा सकता है. आसंजन झरना के पहले चरण में कुल पक्षपाती कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा सकता है जो ल्यूकोसाइट के रोलिंग है. ऑफ़लाइन विश्लेषण पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या श्वेतकोशिका सांस दौरान प्रत्येक दर्ज क्षेत्र में समझा जा करने की अनुमति देता है. छवि का प्लेबैक मजबूती से पक्षपाती और endothelium भर में एक रोलिंग गति के दौर से गुजर रहे हैं कि उन है कि कोशिकाओं की तुलना की अनुमति देता है. रोलिंग गति इस तकनीक का उपयोग करते हुए कल्पना की जा सकती है, प्रत्येक क्षेत्र में कम से कम 10 सेकंड के लिए दर्ज की गई है. रोलिंग कोशिकाओं कोशिकाओं बहने की तुलना endothelial सतह पर उनकी कम वेग से पहचाने जाते हैं. यह व्यवहार टुकड़ी के बिना कम से कम 5 सेकंड के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यकृत sinusoids भीतर आसंजन झरना एक कम कतरनी वातावरण में जगह लेता है और vivo अध्ययन में केवल एक संक्षिप्त tethering कदम के साथ कम से कम रोलिंग की पुष्टि की है. हम प्रवाह परख पक्षपाती ल्यूकोसाइट के कम से कम 10% लगातार इन assays में अधिक HSEC प्रेरित रोल प्रदर्शन है कि यकृत sinusoids के वातावरण को दर्शाता है कि इस बात की पुष्टि की है.

आसंजन झरना के अगले कदम फर्म आसंजन है. कुल पालन धोने बफर सांस (कदम 7.3) के दौरान रिकॉर्डिंग के दूसरे चरण से गणना की जा सकती. ऑफ़लाइन विश्लेषण मजबूती से पक्षपाती कोशिकाओं की कुल संख्या (चित्रा 5) प्रत्येक क्षेत्र में गिना जा सकता है. मजबूती से पक्षपाती कोशिकाओं स्थिर या धीमी गति से रेंगने व्यवहार के साथ shapechanged हैं कि कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं.क्षेत्र प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या तो गणना की जा सकती. यह आंकड़ा तब की हद तक व्यक्त करने के लिए, लिम्फोसाइटों (आमतौर पर 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) की एकाग्रता और प्रवाह की दर (एक रेखाजाल या समकक्ष का उपयोग निर्धारित) देखने के क्षेत्र के कुल सतह क्षेत्र के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है पक्षपाती कोशिकाओं / मिमी के रूप में लिम्फोसाइट पालन 2/10 6 कोशिकाओं perfused.

आसंजन के पैटर्न का अध्ययन कर आसंजन झरना, आकार बदलने सहित रेंगने और transendothelial प्रवास के अंतिम दो चरणों का विश्लेषण शामिल है. HSEC monolayer के ऊपरी सतह के अनुयायी ल्यूकोसाइट चरण उज्ज्वल monolayer के माध्यम से चले गए हैं कि उन whilst के चरण अंधेरे (चित्रा 6) दिखाई देते दिखाई देते हैं. कोशिकाओं तो, 'स्थिर' आसंजन (nonmigrated / दौर) का प्रदर्शन के रूप में वर्गीकृत 'आकार बदला' आकारिकी या 'माइग्रेट' और व्यक्ति के रूप में श्रेणियां फिर से एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा सकता हैकुल चिपकने वाला जनसंख्या.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रवाह कक्ष के भीतर प्राथमिक मानव यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं के monolayer. मीडिया पूर्व प्रवाह आसंजन परख मिला हुआ endothelial monolayer के. बी) चरण विपरीत छवि के प्रारंभ से endothelial कोशिकाओं के monolayer युक्त से भरा ए) Microslides, endothelial कोशिकाओं (मानव यकृत endothelial कोशिकाओं के लिए इस के साथ होना चाहिए precoated किया गया है जो microslide में वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए चूहे की पूंछ कोलेजन टाइप 1) और यह endothelial कोशिकाओं संस्कृति और मिला हुआ में स्वस्थ हैं कि आवश्यक है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2 चित्रा 2. परख चैम्बर प्रवाह. एक प्रवाह परख कक्ष सेट अप यहां देखा जा सकता है, यह एक औंधा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है, जो एक पारदर्शी कक्ष के होते हैं. एक हीटर कक्ष में रखा गया है और thermostatically 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए बाहर स्थित है जो एक सिरिंज पंप करने के लिए कक्ष के भीतर एक microslide से सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए उपलब्ध बंदरगाहों होना चाहिए. microslide खुर्दबीन मंच पर सीधे रखा जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. पम्प सिरिंज. एक सिरिंज पंप कनेक्ट हैप्रवाह चैम्बर के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से एड. पंप परख के लिए आवश्यक वांछित कतरनी तनाव के आधार पर एक विशिष्ट वापसी की दर तय है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. वाल्व प्लावित है और दो ​​बैरल वाल्व से सिलिकॉन टयूबिंग, स्थापित कर रहे हैं एक बार चैम्बर प्रवाह के लिए वाल्व कनेक्ट. ए) एक इलेक्ट्रॉनिक solenoid वाल्व) वास्तव में कोई मृत अंतरिक्ष. बी के साथ कोशिकाओं या मीडिया या तो युक्त दो सिरिंज बैरल के बीच स्विच करने की अनुमति देता है प्रवाह कक्ष से जुड़ा है. यह प्रवाह चैम्बर पर बंदरगाह के लिए सिलिकॉन टयूबिंग पर अनुकूलक को जोड़ने जब एक तरल / तरल इंटरफेस है कि महत्वपूर्ण है. <एक href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. कुल श्वेतकोशिका पालन के मापन. धोने बफर सांस कदम (प्रोटोकॉल में बताया गया है) के अंतिम दो मिनट के दौरान, दस यादृच्छिक क्षेत्र की एक न्यूनतम दर्ज किया जाना चाहिए. ये बंद लाइन का विश्लेषण किया जा सकता है और मजबूती से पक्षपाती कोशिकाओं की कुल संख्या प्रत्येक क्षेत्र में गिना जा सकता है. ल्यूकोसाइट की कुल आसंजन नियंत्रण कक्षों और एंटीबॉडी अवरुद्ध साथ pretreated उन के बीच तुलना की जा सकती है, यहाँ हम एक नियंत्रण स्लाइड से एक प्रतिनिधि के क्षेत्र और intracellular आसंजन अणु -1 (ICAM-1) अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ pretreated एक स्लाइड शो. तीर प्रतिनिधि में, पक्षपाती leukocytes उजागर करने के लिए जोड़ दिया गया हैनियंत्रण स्लाइड से क्षेत्र ेश्य पहचान 25 leukocytes के एक कुल रहे हैं और ICAM-1 ब्लॉक स्लाइड में पहचान 13 leukocytes के एक कुल रहे हैं. = 100 माइक्रोन स्केल सलाखों. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. दर्ज क्षेत्रों के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा endothelial monolayers पर श्वेतकोशिका आसंजन के पैटर्न का विश्लेषण. ऑफ़लाइन विश्लेषण भी श्वेतकोशिका आसंजन की दिशा और वेग अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आसंजन झरना के विशेष कदम कल्पना और चरण विपरीत इमेजिंग का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. सक्रिय मजबूती से पक्षपाती लेकिन नहीं कर रहे हैं जो चरण उज्ज्वल कोशिकाओं 'दौर' आसंजन, सक्रिय हैं, जो कोशिकाओं में कहा जा सकता हैडी और चरण उज्ज्वल 'बदला आकार' करार दिया जा सकता है और चरण अंधेरा हैं जो कोशिकाओं transendothelial प्रवास आया है और 'माइग्रेट' कहा जा सकता है जो कोशिकाओं रहे हैं. छवि आसंजन की प्रत्येक पद्धति का उदाहरण दिखाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

सफलतापूर्वक एक प्रवाह परख प्रदर्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम endothelial कोशिकाओं की एक स्वस्थ और मिला हुआ monolayer पूर्व प्रवाह आसंजन परख करने के लिए तैयार है कि यह सुनिश्चित करना है. प्राथमिक endothelial कोशिकाओं संस्कृति के लिए मुश्किल और संवर्धन तरीकों में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हो सकता है. यह 1) प्रवाह कक्षों पर्याप्त रूप से और समान रूप से एक monolayer में endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित हैं कि महत्वपूर्ण है, HSEC के लिए हम चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार मैं उपयोग करें, लेकिन यह अन्य endothelial आबादी के लिए अलग हो सकता है, 2) मध्यम संस्कृति के लिए, सेल प्रकार के लिए उपयुक्त है HSEC हम प्रोटोकॉल अनुभाग में हमारी पूरी मध्यम वर्णन किया है. अन्य महत्वपूर्ण कदम कतरनी तनाव के शारीरिक स्तर को प्रतिबिंबित करने के लिए उचित दर पर सिरिंज पंप स्थापित करने में शामिल हैं.

प्रवाह परख के दौरान यह endothelial monolayer नुकसान या endothelial सतह से प्रतिरक्षा कोशिकाओं पट्टी कर सकते हैं जो प्रवाह सर्किट के भीतर हवाई बुलबुले को रोकने के लिए आवश्यक है. यह एन से रोका जा सकता हैसभी सिलिकॉन टयूबिंग और एडेप्टर सभी हवाई बुलबुले हटा दिया है और मीडिया का उपयोग करने से पहले prewarmed रहे हैं कि कर रहे हैं कि, पिछले कनेक्शन को धोने बफर के साथ perfused हैं कि suring. यह एक तरल / तरल इंटरफेस कनेक्शन के दौरान वहाँ है कि बहुत महत्वपूर्ण है microslide पर बंदरगाहों के लिए एडेप्टर जोड़ने पर किसी भी हवा है, तो यह सिरिंज वापसी के दौरान endothelial monolayer को बाधित करेगा जो प्रणाली के भीतर एक हवा खाई बनेगी कदम. सिरिंज बैरल में श्वेतकोशिका समाधान कोशिकाओं इस प्रकार प्रयोग भर में एक निरंतर सेल घनत्व को बनाए रखने, व्यवस्थित नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से आंदोलन की जरूरत है.

रिकॉर्डिंग चरणों के दौरान यह endothelial परत की छवि को पर्याप्त रूप से ध्यान केंद्रित किया और सटीक ऑफ़लाइन विश्लेषण की अनुमति के लिए स्पष्ट है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और उस प्रवाह परख (पोस्ट श्वेतकोशिका सांस में) के दूसरे चरण के दौरान कहा कि काफी समय से धोने बफर के दौरान छोड़ दिया है रिकॉर्डिंग से पहले चरण के लिए सुनिश्चित करें कि recommenced हैसभी nonadherent ल्यूकोसाइट को हटा रहे हैं. इसी तरह यह संकीर्ण केशिकाओं में प्रवाह पैटर्न के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए और भी चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत बड़ा पक्षपाती ल्यूकोसाइट से भेदभाव करने के लिए कठिन हो सकता है उचित घनत्व की एक monolayer में endothelial कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. हम मानव यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं के लिए इष्टतम बोने घनत्व का वर्णन किया है, लेकिन यह अलग endothelial आबादी और प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं.

महत्वपूर्ण प्रगति intravital माइक्रोस्कोपी के साथ पशु मॉडल में श्वेतकोशिका भर्ती अध्ययन में किया गया है. प्रवाह आसंजन परख विधि का प्रमुख लाभ श्वेतकोशिका भर्ती प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं के साथ एक बाइनरी सिस्टम में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, इन मुलाकातों कतरनी तनाव के शारीरिक प्रासंगिक स्तरों के अधीन अध्ययन किया जा सकता है. Differenc वहाँ हो सकता है के रूप में यह मानव सेलुलर सिस्टम के साथ पशुओं में intravital अध्ययन के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रजातियों के बीच endothelial गुणों में ते. प्रवाह परख की सीमाओं में से एक श्वेतकोशिका भर्ती endothelial monolayer के एक कोशिकीय वातावरण में अध्ययन किया जा रहा है. ल्यूकोसाइट अन्तःचूचुक भर में पालन किया और transmigrated एक बार इसके अलावा वे पृथक और नीचे की ओर प्रक्रियाओं के अधीन किया जा करने के लिए पर्याप्त संख्या में मौजूद में नहीं हो सकता है.

इन सीमाओं के बावजूद, प्रवाह आसंजन परख में महारत हासिल हो जाने के बाद यह श्वेतकोशिका आसंजन झरना के आगे के विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए विकसित की है और एक बहुकोशिकीय पर्यावरण पुनरावृत्ति करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. एकल खेतों और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल का लम्बे समय तक रिकॉर्डिंग ल्यूकोसाइट की रेंगने व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा प्रवाह परख के पूरा होने पर microslides अधिक विस्तार में आसंजन और स्थानांतरगमन अध्ययन करने के लिए लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी और Immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है. इसके अतिरिक्त, हम पहले से विकसित किया हैबह ल्यूकोसाइट hepatocytes की मौजूदगी से वातानुकूलित यकृत अन्तःचूचुक के साथ बातचीत कर सकता है, जहां इन विट्रो मॉडल एड. यह परख भी ल्यूकोसाइट की subpopulations अध्ययन करने के लिए विकसित किया जा सकता है: हमारे समूह ऐसे विनियामक टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं और जिगर में घुसपैठ ल्यूकोसाइट रूप कैंपेन्स के साथ अध्ययन का प्रदर्शन किया गया है.

इन अध्ययनों प्रवाह आसंजन परख मानव प्रणालियों में सामान्य और अंग विशेष श्वेतकोशिका भर्ती अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि सबूत हैं.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा

Acknowledgments

एसएस एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम अनुदान से एक वेलकम ट्रस्ट इंटरमीडिएट क्लीनिकल फैलोशिप, CW द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Six channel microslide VI 0.4 flow chamber  Ibidi 80601 Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  microslide VI 0.4 Ibidi 80646
Flow assay chamber Solent Scientific 33-3322 These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. 
Inverted Microscope IX2 Olympus, UK Model IX50
Harvard Syringe Pump Harvard Apparatus, UK 702101
Electronic solenoid valve Lee Products Limited, UK Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large Fisher Scientific FB50855 2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter
Silicone Tubing-small Fisher Scientific FB50853 1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter
Harvard Glass Syringe Harvard Apparatus, UK 55-0962
Cell separation medium/Lympholyte VH Bio CL-5020
Rat Tail Collagen Sigma Aldrich C3867-1VL

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