Гетеротопическая слизистой Процедура прививку для прямого доставки лекарств в мозг у мышей

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Модель мыши эндоскопической основания черепа реконструкции человеческого была разработана, что создает полупроницаемую интерфейс между мозгом и носа с использованием слизистой оболочки носа трансплантатов. Этот метод позволяет исследователей изучать доставку в центральной нервной системе высоких терапевтических молекулярной массой, которые в противном случае исключенных гематоэнцефалический барьер при системном введении.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kohman, R. E., Han, X., Bleier, B. S. Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51452, doi:10.3791/51452 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Доставка терапии в мозг препятствует присутствии гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который ограничивает прохождение полярных и высокомолекулярных соединений из крови и в ткани головного мозга. Некоторые прямой успех доставка в людях было достигнуто с помощью имплантации транскраниальной катетеров; Однако этот метод является высоко инвазивными и связано с многочисленными осложнений. Менее инвазивные альтернативы можно было бы дозировать мозг через хирургически имплантированных, полупроницаемую мембрану, таких как слизистой оболочки носа, которая используется для ремонта основания черепа дефекты следующие эндоскопической трансназальной опухоли операции по удалению у человека. Передача Drug хотя эта мембрана будет эффективно обойти гематоэнцефалический барьер и диффундировать непосредственно в мозг и цереброспинальной жидкости. Вдохновленный этим подходом, хирургический подход у мышей была разработана, который использует мембраны донором перегородки слизистой насаждаемое над экстракраниального хирургического BBB дефекта. Эта модель, как было показано эффективноразрешить прохождение высокомолекулярных соединений в мозге. Поскольку многочисленные лекарств-кандидатов не способны пересекать ГЭБ, эта модель является ценным для выполнения доклинических испытаний новых методов лечения неврологических и психиатрических заболеваний.

Introduction

Лечение неврологических и психиатрических заболеваний сильно затруднено наличием гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который предотвращает более 95% всех потенциальных фармацевтических средств от достижения на центральную нервную систему 1-3. Например, глиальных нейротрофического фактора (GDNF), как было показано быть эффективным при лечении болезни Паркинсона при введении непосредственно в мозг, однако не работает, если доставляется системно, поскольку она не может проникнуть через ВВВ 4-6.

Многочисленные подошел были разработаны, чтобы попытаться обойти эту проблему. Улучшение системной доставки neurotheraputics была продемонстрирована с помощью конъюгатов лекарственного средства, содержащего антитела селективные для транспортных белков, расположенных на эндотелия капилляров головного мозга; Однако этот метод не было показано, что применимо для широкого диапазона фармацевтических 7,8. Кроме того, осмотическое открытие BBB был использован клиникусоюзник, однако этот метод страдает от системного введения дозы лекарственного средства по сравнению с более прямой доставки к области мозга интереса 9. Существенные усилия были направлены на оптимизацию доставки трансназальные в надежде направленные непосредственно против мозг 10-12. Хотя некоторые успехи были достигнуты, убедительные результаты были только получены для препаратов, которые обладают эндогенные рецепторы, такие как инсулин 13,14. Кроме того, механизм доставки трансназальной был спорным с доказательств того, косвенное вступление в мозг через обонятельный поглощения нейронов или через кровь 11. Прямая, транскраниальная доставка с помощью имплантируемых катетеров была достигнута, но эта процедура является высоко инвазивными и связано с многочисленными осложнениями 15,16. На сегодняшний день нет вообще, минимально инвазивный метод, чтобы доставить высокомолекулярных соединений в мозг.

Представлен мышиным хирургическая процедурачто создает интерфейс с полупроницаемой мозга. Это достигается путем прививку на слизистой оболочке эксплантов 17 над хирургического дефекта в краниотомии мыши. С помощью этой процедуры было показано, что растворимые соединения до 500 кДа могут быть доставлены в центральную нервную систему (непосредственно в паренхиме головного мозга, а также в цереброспинальной жидкости) и в то время, и молекулярная масса зависимым образом 18. Это метод обхода через ГЭБ представляет собой модель для основания черепа дефектов ремонта в людях, которыми пользуется васкуляризированной слизистой трансплантатов для восстановления отверстия в черепе следующих трансназальной эндоскопической хирургии 19,20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

До операции убедитесь, что все процедуры, которые необходимо сделать утверждаются IACUC и любые дополнительные этических или юридических органов и использовать гуманные методы лечения животных. Это включает в себя использование стерильных условий хирургии, анестезии мышь с помощью IACUC утвержден метод, смазочные мышей глаза ветеринара мази во время операции, а также предоставление послеоперационный уход. Не приступайте к операции, если есть какие-либо вопросы, будут ли утверждены аспекты процедуры. Все процедуры, проводимые здесь были утверждены Комитетом Бостонского университета Институциональные уходу и использованию животных в.

1. Подготовка животных и хирургические принадлежности

  1. Автоклав все хирургический инструмент, который будет использоваться во время операции.
  2. Убедитесь, что все методы, которые должны быть выполнены утверждаются регулирующими органами животных.

2. Заготовка слизистой Graft

  1. Выбрал генетически идентичного мышь же возраста, какэкспериментальная мышь и усыпить его в IACUC утвержденного метода (здесь: изофлюран удушья с последующим смещением шейных позвонков).
  2. Использование хирургические ножницы, удалить кожу вокруг носа области головы мыши подвергая череп.
  3. С пневматической бурильной, марки с тремя линиями два из которых с боков фланге носовой области и третий в соответствии с глазами, которая соединяет две линии перпендикулярно.
  4. Детализация снизу, с тем, чтобы отделить носовую перегородку от окружающей ткани. Более широкий путь предотвратит повреждение слизистой оболочки, однако это также сделает его более трудно выделить мембрану. Узкий разрез ближе к средней линии рекомендуется.
  5. Используйте ножницы, чтобы вырезать перегородку бесплатно из любой ткани, прикрепленной к его и хранить его в стерильный физиологический раствор. В это время трансплантат могут быть очищены, чтобы удалить подключенное ткани. Идеальная ситуация, чтобы иметь неповрежденные слизистые оболочки подвергается с обеих сторон перегородки хряща. Один гркормовой может поставить мембрану в течение двух мышей при условии, что площадь поверхности мембраны, достаточно, чтобы покрыть краниотомия сайтов. Рекомендуется, чтобы трансплантат используется как можно быстрее и исследователь переходит к этапу 3, как только трансплантат изолированы.

3. Хирургическое Имплантация слизистой оболочки Graft

  1. Используя стандартные, асептические мышиных хирургических процедур, анестезии и смонтировать мышь в стереологического кадра. Используйте около 2% изофлуран в чистом кислороде с использованием грызунов наркозный аппарат.
  2. Остановите мышь в стереотаксической аппарата с уха баров и держателем носа. Применить глазной мази для глаз и скраб на кожу головы бетадином и 75% этанола в течение трех раундов. Использование либо ножницы или волос триммер, снимите шерсть на голове. Expose череп с лезвием бритвы и выравнивания положения головы. Выполнение трепанацию черепа выше местоположения мозга, которые будут дозированного. Например, при ориентации стриатуме вырезать 1,25 ммДиаметр круглое отверстие в черепе (с центром в ЗС: 1.00 мм; ML: 0,88 мм) с помощью отбойного молотка. Смочить пробурена область стерильным физиологическим раствором и использовать лезвие, чтобы удалить череп.
  3. Осторожно снимите твердую мозговую оболочку, используя кончик иглы. Кроме того, это может быть достигнуто с применением минимального количества тканевого адгезива на влажной поверхности твердой мозговой оболочки. После этого слой затвердеет, боковое движение с наконечником бритвенных лезвий может быть использован, чтобы удалить мембрану.
  4. Поместите мембрану слизистой оболочки над поверхностью мозга, принимая крайнюю осторожность, чтобы сохранить эпителиальных стороне, обращенной от раны. Это лучше всего делать путем передачи всю перегородки на поверхности черепа, прилегающей к краниотомии сайта с помощью пинцета. С помощью кончика пары хирургических ножниц, потяните мембрану от хряща и на черепа и головного мозга поверхности. Не позволяйте мембрана высыхает и не касайтесь его любой абсорбирующим материалом. Трансплантат должен щедро перекрываются все костные края краниотомии сITE.
  5. Накройте трансплантата со стерильным части нитрила. Это действует, чтобы предотвратить прилипание к коже трансплантата во время лечения. Нитрил должна быть достаточно большой, чтобы покрыть всю слизистую оболочку. Обрезать чрезмерное мембрану при необходимости. Избегайте движения нитрила, как только он вступает в контакт с трансплантата.
  6. Закройте кожи с управлением 5-0 стерильной шва и пусть мышь восстановить в течение 3-7 дней, прежде чем приступить к следующему шагу. Будьте осторожны, не возмущают нитрильного барьер или трансплантата слизистой во время закрытия кожи.

4. Администрация дозирования раствора

  1. После обеспечения наркозом мышь в стереотаксической рамы, сократить шов с ножницами и удалить лишнюю кожу вокруг черепа.
  2. Снимите нитрильного барьер и очистить поверхность черепа. Используйте стерильного физиологического раствора и ватные тампоны для очистки области, пока трансплантат не видно. Это может быть необходимо, чтобы сократить трансплантат бритвой если выросло больше, чем Desired площадь поверхности.
  3. Если эксперимент будет больше, чем на несколько дней, имеет смысл внедрить как минимум два винта черепа, чтобы укрепить голову имплантат.
  4. Поместите значительно выше трансплантата так, чтобы края находятся в контакте с черепа. Применить цианакрилатного клея на стыке между скважиной и черепа. Заполните колодец стерильным физиологическим раствором и убедитесь, что нет никаких утечек. Уэллс сделаны из вырезать шприцев игл.
  5. Применить костного цемента на черепе, чтобы закрепить хорошо на месте.
  6. Извлеките солевой раствор из скважины с помощью пипетки. Вымойте хорошо несколько раз, чтобы убедиться, что клей не просочилась на сайт Добавить искомое решение; в этом случае 50 мкл флуоресцентного декстрана используется. Ожидается, что водорастворимые соединения сходной полярности будет вести себя так же, как декстран. Доставка из гидрофобных соединений или суспензий не были изучены с помощью этого метода.
  7. Закрывают верхнюю часть скважины с помощью круговой кусок нитрила, прикрепленный кначалу помощью цианакрилатного клея. Убедитесь, что клей не вступают в контакт с содержимым также.

5. Анализ трансмукозной доставки

  1. После того, как необходимое количество времени прошло, обезболить мышь и обмена содержимым также с раствором синего красителя Эвана. Этот краситель используется для проверки того, что трансплантат был цел.
  2. Через 30 мин, обезболить мышь тяжело, удалить раствор красителя, и усыпить через обезглавливание.
  3. Вручную удалите имплантат и удалить мозг, используя хирургические ножницы. Будьте осторожны, чтобы сохранить трансплантат на месте.
  4. После удаления флэш-замораживание мозга в растворе изобутана охлаждают в бане с сухим льдом.
  5. Вставить мозг в оптимального раскроя температура раствора (OCT) и ломтик на 50 мкм.
  6. Поместите необходимое ломтики непосредственно на предметное стекло микроскопа.
  7. Изображение срез с использованием цветения микроскоп, как только решение октябре высохнет.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Получение достаточно большой носовой перегородки эксплантов имеет решающее значение для последующих стадиях. Это может быть достигнуто путем бурения на месте на черепа мыши-донора в показано на фиг.1А. Режущий по этому пути будет производить эксплантов достаточного размера, как показано на рисунке 1b. Если глубина бурения не достаточно глубоко, трансплантат будет усеченным, и это будет трудно получить достаточно большую мембрану, чтобы покрыть поверхность мозга. Бурение более многосторонний, чем предложенный путь не рекомендуется, потому что больше ткани останется на носовой перегородки, и следующим шагом будет сложнее. Перед передачей мембраны слизистой, поверхность перегородки должна быть очищена от всей избыточной соединительной ткани. Как только это сделано, мембрана слизистой оболочки должны быть видны на поверхности хряща. Рисунок 1c показывает, что ткань выглядит как после очистки.

До передачи коррране, трепанация черепа и durotomy должны быть выполнены, чтобы разоблачить поверхность мозга. Только после того, пост-durotomy кровотечение остановилось можете мембрана быть переданы. показывает то, что операция сайт должен выглядеть прежде чем переходить к следующему шагу. Передача слизистой оболочки от хряща на поверхность мозга является наиболее технически сложным этапом всей хирургической процедуры и должно быть сделано тщательно. Если перегородка собирают достаточно велико, площадь поверхности трансплантата слизистой оболочки должна быть достаточно большой, чтобы покрыть поверхность мозга. После передачи, хирургическое область должна похож на что на рисунке 2b. Важно, чтобы убедиться, что сторона мембраны, которая находится в контакте с хряща является той же, что находится в контакте с поверхностью мозга. Если мембрана получает перевернулся или сложить над собой, он должен быть уничтожен, а другой должен быть использован. Как только этот этап закончен, волосистой части головы может быть пришитытак, что мышь может восстановить и трансплантат может исцелить. Для того, чтобы предотвратить любые побочные реакции со стороны трансплантата вступления в контакт с внутренней поверхностью кожи головы, часть защитной нитрила должен быть помещен выше в хирургическом месте. Как показано на рисунке 2с, вставленный кусок должен быть достаточно, чтобы покрыть мембрану большой, но не достаточно большой, чтобы препятствовать ушивание кожа закрыты.

В период восстановления, существенное ткань в-роста происходит окружающей надкостницы, который должен быть удален перед дозированием мембрану. После повторного открытия кожу головы, стерильные ватные тампоны и солевой раствор необходимо будет использован для очистки сайт, пока он не похож на что на рисунке 3а. Мы не наблюдается существенного иммунного ответа; однако это не было подтверждено гистологически. Трансплантат может должны быть сокращены с бритвой, если она выросла по всей поверхности черепа. На этом этапе также, что будет содержать дозирования раствораТион следует имплантировать выше трансплантата. Несколько винты черепа можно положить в на этом этапе, если долгосрочная механическая стабильность имплантата, вызывает беспокойство. Убедитесь, что хорошо расположен так, что он не касался трансплантата. Как только на месте, цианоакрилат клей может быть нанесен приклеить его к черепу. Чтобы выступающий клей от вступления в контакт с трансплантата следует приложенного к поверхности скважины и нажат вниз, чтобы запечатать разрыв. После того, как хорошо находится в безопасности, она должна быть заполнена временно физиологическим раствором в обоих гидрата трансплантата и убедитесь в отсутствии утечек. Придерживался также должен выглядеть, что на рисунке 3b и решение Должно быть ясно, указывая, что он не содержит клей. Любая утечка будет очевидно, потому что уровень жидкости в скважине упадет. При обнаружении утечки они должны быть исправлены с более клея. Затем скважина армированный костного цемента. В этот момент солевой в скважине могут быть удалены с помощью пипетки изаменены искомого решения дозирования. При освещении хорошо с куском ухода нитрильного должны быть приняты, чтобы убедиться, клей не связаться решение в скважине. В конце всей процедуры, глава мышь должна выглядеть на рисунке 3с. Костный цемент слегка прозрачный поэтому, если содержимое скважины являются светочувствительными, краситель или чернила могут быть добавлены к поверхности высушенного цемента или цементной смеси, чтобы предотвратить фотодеградацию содержимого скважины.

По истечении желаемого промежутка времени ожидания, мозг должен быть проанализирован, чтобы обнаружить эффекты дозирования. Мозг следует относиться по разному в зависимости от того, что в настоящее время рассматривается. Если цель процедуры состоит в анализе на присутствие любого химического вещества добавляют к скважине, (например, как описано в разделе протокола выше), то рекомендуется, чтобы сделать флэш-замораживание мозга, чтобы сохранить введенных соединений. Рисунок 4 > Показывает, представитель исход использовании этого подхода. Дозирование с флуоресцентным полимера 40 кДа (tetramethyrhodamine конъюгированного декстрана) в течение 24 часов показывает заметное диффузии в ткани головного мозга. Наши предыдущие результаты с декстран шоу диффузии в ткани головного мозга занимает очень много времени и молекулярная масса зависит 18. Более мелкие молекулы диффундируют в паренхиме головного мозга в большей степени, чем крупные, и больше времени дозирования приводит к большему количеству диффузии для всех молекулярных масс, которые мы тестировали. Если флэш-замораживание делается важно смонтировать слайды после секционирования, а не подвергать их к какому-либо решению. Любая жидкость будет солюбилизировать вводимого соединения и диффундировать через его площади поверхности среза головного мозга. Если иммуногистохимия должна быть выполнена на мозг, то рекомендуется заливать мышь, чтобы исправить мозговой ткани.

iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Изображения носа процедуры уборки перегородки. А) Расположение буровой на череп эвтаназии мыши. Пунктирные линии указывают периметр, чтобы развернуть. B) носовой перегородки непосредственно после хирургического удаления. C) носовой перегородки после удаления избытка ткани. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Хирургические изображения процесса приживления. А) Хирургическая Интернет следующие трепанации черепа и durotomy. Изображение, что череп должен выглядеть до размещения трансплантата на него. Б) Размещение слизистой оболочки трансплантата на к краниотомии сайте. Пунктирная линия показывает периметр трансплантата. Изображение показывает нужный площадь поверхности трансплантата. C) Имплантация защитного нитрильного барьера. Размер материала, как показано достаточно, чтобы покрыть трансплантат большой, но не достаточно большой, чтобы мешать наложения швов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Хирургические образы процесса дозирования препарата. А) Пример того, что исцеленный трансплантата слизистой выглядит следующим образом строгую очистку места операции. Б) Образ хорошо прикреплен к черепу. Интерфейс черепа и также обеспеченас цианоакрилат клей и хорошо заполнено стерильным физиологическим раствором. Стабильный уровень раствора указывает на отсутствие утечек из колодца и ясность решения указывает на отсутствие загрязнения решения клеем. C) образ завершенного хирургии. Хорошо содержит решение дозирования и надежно закрывают нитрила барьера. Костного цемента на месте, чтобы rigidify имплантат а. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
Рисунок 4. Флуоресцентного микроскопа изображение среза мозга мыши следующей чресслизистое дозирование с 40 кДа тетраметилродамин конъюгированного декстрана в течение 24 часов. Ломтик было принято на -1,06 мм брегмы толщиной 501; м. Трансплантат слизистой виден на поверхности мозга. Бар = 1 мм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Самым сложным этапом процедуры, описанной в настоящем документе, успешная передача из мембраны адекватного размера слизистой на поверхность мозга. Этот шаг сделан значительно легче, если собирают носовой перегородки достаточно большой и убираются хорошо. Если брюшной участок перегородки обрезано, новый трансплантат должна быть получена. Угол бурение должно быть перпендикулярно к головке мыши, чтобы гарантировать, что мембрана слизистой оболочки не повреждены сверла. Если шире, чем рекомендовано бурение путь берется это будет намного труднее удалить лишнюю ткань, которая соединена с перегородкой. Любые крупные куски соединительной ткани должны быть удалены с резкого сокращения ножниц Вместо того, чтобы вытащить их потерять. Меньшие кусочки ткани могут быть удалены путем соскабливания кончиками ножниц, предусмотренных ткань не подключен к слизистой оболочке. В конце процесса очистки, поверхность хряща с мембраной еще прикрепленным должна подвергаться воздействию. Occasionally перегородки хряща может стать отделяется от кости, что он подключен к на спинном краю. Если это происходит, то все еще можно использовать его на следующем шаге однако это является более сложным по двум причинам. Кость удобная ручка для удержания эксплантов при чистке и передачи его. После удаления, это труднее маневрировать лист более тонкий хряща. Во-вторых, костно-хрящевого перехода, где мембрана слизистой оболочки является толстый и самый простой, чтобы получить при удалении его из хряща. Если кость отделена от хряща эта часть мембраны теряется.

После того, как перегородки трансплантат был очищен и были выполнены трепанация черепа и durotomy, мембрана слизистой оболочки могут быть размещены на открытой поверхности мозга. Это лучше всего достигается путем установки эксплантов, прилегающей к краниотомии сайте. Мембрана может затем быть выведены из хряща, на черепе, а над мозга. Многое может пойти не так во время этого процессорыс. Мембрана может высохнуть, рвется, сложите на вершине себе, или сбиваться в кучу. Кроме того, мембрана, покрывающая другую сторону перегородки могут быть повреждены от трутся черепа. Кроме того, возможно, что при попытке удалить лицевой стороной вверх слизистой оболочки, один удаляет мембраны с обеих сторон одновременно. В целях предотвращения всех этих проблем крайне важно, чтобы переместить мембрану медленно и всегда соблюдайте обе стороны перегородки. Лучшая стратегия заключается в использовании кончики ножницами, чтобы выбить мембрану из листа хряща, прежде чем пытаться скользить его. Если какая-либо часть мембраны остается прикрепленной, вполне возможно, что эластичность ткани убирается после потянув за него. С помощью небольшой, дергать движения мембрана может быть отделен от перегородки. Только тогда он легко соскользнуть. Мембрана является слишком тонким, чтобы быть в состоянии быть обработаны с помощью пинцета; это можно вытянуть только от одной поверхности к другой. Если он получает перевернулся или сложить над собой, этодолжны быть отброшены, а другой должна быть получена.

Если трансплантат охватывает всю площадь поверхности обнаженной мозга, процесс был успешным и кожа головы может быть пришиты так, что операция сайт может исцелить. Нитрильного барьер должен ввести в действие так, чтобы кожа не вступают в контакт с мембраной. Необходимо соблюдать осторожность, так что давление, оказываемое на не нитрила при сшивании в противном случае положение трансплантат может двигаться. Также постарайтесь не накладывать швы в нитрила. Лучший способ убедиться, что материал подчиняется является держать его влажным с физиологическим раствором и убедиться, что он остается плоским по всей наложения швов.

После того как трансплантат зажила (3-7 дней) и с раствором дозирования могут быть прикреплены к вышеуказанной трансплантата черепа. Это может быть исправлено временно к черепу с помощью клейкой клея и навсегда с костным цементом. После того, как костный цемент применяется, это не будет возможно сделать какие-то корректировки в положение хорошо Therefoповторно все оптимизация должно быть сделано до его применения. После того, как хорошо находится в положении и удерживается на месте с цианоакрилатным клеем, он должен быть заполнен стерильным физиологическим раствором. Если процедура прошла успешно уровень жидкости не изменится и решение будет ясно. Если есть утечка, уровень упадет и расположение, где вода сбежал должны быть видны. После нанесения клея больше на месте утечки, более физиологический раствор должен быть добавлен, чтобы проверить герметичность была решена. Если клей загрязняет решение также, полупрозрачная пленка будет виден в верхней части уровня жидкости. В этом случае также должна быть несколько раз промывают солевым раствором, пока раствор не станет прозрачным. Кроме того, замена хлопок может быть использован для удаления пленки путем прикосновения к поверхности жидкости. Только тогда, когда решение также является стабильным и ясно, следует цемент применяется. Когда цемент сухой, солевой из скважины могут быть удалены и заменены раствора дозирования. Следует проявлять осторожность, чтобыне повредить мембрану пипетки при входе и выходе из скважины. После заполнения, в верхней части скважины должны быть запечатаны с куском нитрила с использованием цианакрилатный клей. Важно, что пространство остается между поверхностью раствора и в верхней части скважины. Это будет гарантировать, что клей не касается решение, когда надевает нитрильного барьера.

Как только пришло время, чтобы проанализировать эффект от процедуры дозирования, мозг должен быть удален и образ. Если иммуногистохимия должна быть выполнена, стандарт перфузии и антитело окрашивание может быть сделано. Если местоположение соединения дозированной должно быть определено, рекомендуется мигать заморозить мозг в сухом растворе лед / изобутана. Это гарантирует, что расположение соединения в срезах мозга так же, как это было непосредственно перед эвтаназии.

Протокол, описанный здесь описан способ, чтобы исследовать доставки лекарств в мозг мыши через хирургическим путемпривиты полупроницаемую мембрану слизистой оболочки 18. Это аналогично тому, итогах трансназальной опухоли операции по удалению у человека, в котором основания черепа дефекты отремонтированного с васкуляризированной носовой слизистой оболочке 19,20. Используя эту модель мыши, теперь можно изучить, как эти слизистой трансплантаты способны обход BBB и позволяет для прямого высокой молекулярной массой доставки лекарств в мозг. Теперь мы выполнили эту процедуру более 100 раз. Решающее значение для этой процедуры является успешным заготовка носовой перегородки трансплантата от донора мыши и передача слизистой оболочки от привитого на испытательном мыши. Эта процедура, в первый раз, дает возможность доклинических испытаний высоким молекулярным весом терапии для различных неврологических и психиатрических расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Бенджамин С. Блейер MD является ведущим изобретателем временных методов патент покрывая доставки лекарств к центральной нервной системе.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось Mcihael Дж. Фокс Фонд исследований 2011 Innovations Быстрого Реагирования Паркинсона Награды программы. Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Taconic C57BL/6
Isoflurane Piramal Healthcare
Student fine scissors Fine Science Tools 91461-11
Pneumatic drill MTI Dental 333-CB
Drill bit
Forceps Fine Science Tools 91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP Abbott Laboratories 4925
Polystyrene Petri dish Fisher 08-757-12 for temporarily storing graft
Bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Oxygen/Isoflurane System SurgiVet V720100
Temperature Control System Physitemp TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument KOPF Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators Fisher 23-400-106
7.5% Providone iodine Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless Feather 2976#10
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools 10003-12
3% Hydogen peroxide for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB
Needles Becton, Dickinson and Company 305176 needle tip cut off and used as well
Syringes Becton, Dickinson and Company 309597
Nitrile gloves Denville Scientific Inc G4162 for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder Fine Science Tools 91201-13
Cyanoacrylate adhesive commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque Stoelting 51458
Isobutane (2-methylbutane) Aldrich M32631 for dry ice bath
Dry ice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
  2. Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
  3. Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
  4. Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
  5. Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
  6. Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
  8. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
  9. Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
  10. Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
  11. Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
  12. Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
  13. Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
  14. Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
  15. Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
  16. Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
  17. Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
  18. Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
  19. Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
  20. Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics