चूहों में मस्तिष्क के लिए सीधी दवा वितरण के लिए Heterotopic Mucosal Engrafting प्रक्रिया

Medicine

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Summary

मानव इंडोस्कोपिक खोपड़ी आधार पुनर्निर्माण के एक माउस मॉडल नाक mucosal grafts का उपयोग कर मस्तिष्क और नाक के बीच एक semipermeable इंटरफ़ेस बनाता है कि विकसित किया गया है. इस विधि शोधकर्ताओं प्रणालीबद्ध दिलाई जब अन्यथा रक्त मस्तिष्क बाधा से बाहर रखा गया है जो उच्च आणविक भार चिकित्सा विज्ञान के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए वितरण का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

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Kohman, R. E., Han, X., Bleier, B. S. Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51452, doi:10.3791/51452 (2014).

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Abstract

मस्तिष्क में चिकित्सा विज्ञान के वितरण खून से और मस्तिष्क के ऊतकों में ध्रुवीय और उच्च आणविक भार यौगिकों के पारित होने को प्रतिबंधित जो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​की उपस्थिति से अवस्र्द्ध है. मनुष्य में कुछ प्रत्यक्ष वितरण सफलता transcranial कैथेटर के आरोपण के माध्यम से हासिल किया गया है; हालांकि इस विधि को अत्यधिक आक्रामक और कई जटिलताओं के साथ जुड़ा हुआ है. एक कम आक्रामक विकल्प ऐसे मनुष्यों में इंडोस्कोपिक transnasal ट्यूमर को हटाने सर्जरी के बाद खोपड़ी आधार दोषों की मरम्मत के लिए प्रयोग किया जाता है कि नाक mucosa के रूप में एक शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित, semipermeable झिल्ली के माध्यम से मस्तिष्क खुराक के लिए किया जाएगा. हालांकि ड्रग हस्तांतरण इस झिल्ली को प्रभावी ढंग से बीबीबी बाईपास और मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव में सीधे फैलाना होगा. इस दृष्टिकोण से प्रेरित होकर, चूहों में एक शल्य दृष्टिकोण एक extracranial शल्य बीबीबी दोष खत्म engrafted एक दाता सेप्टल mucosal झिल्ली का उपयोग करता है कि विकसित किया गया था. इस मॉडल को प्रभावी ढंग से दिखाया गया हैमस्तिष्क में उच्च आणविक भार यौगिकों के पारित होने की अनुमति. कई दवा उम्मीदवारों बीबीबी पार करने में असमर्थ रहे हैं, इस मॉडल तंत्रिका विज्ञान और मनोरोग रोगों के लिए उपन्यास के उपचारों के preclinical परीक्षण के प्रदर्शन के लिए मूल्यवान है.

Introduction

तंत्रिका विज्ञान और मनोरोग बीमारी के उपचार के गंभीर रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 1-3 तक पहुँचने से सभी संभावित दवा एजेंटों के 95% से अधिक रोकता है जो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​की उपस्थिति द्वारा बाधा है. उदाहरण के लिए, glial neurotrophic कारक (GDNF) व्युत्पन्न यह बीबीबी 4-6 घुसना नहीं कर सकते हैं क्योंकि प्रणालीबद्ध दिया लेकिन जब अप्रभावी है, मस्तिष्क में सीधे इंजेक्शन जब पार्किंसंस रोग के उपचार में प्रभावी होना दिखाया गया है.

दरवाजा खटखटाया कई इस समस्या को नाकाम करने के लिए प्रयास करने के लिए विकसित किया गया है. Neurotheraputics के प्रणालीगत वितरण में सुधार मस्तिष्क केशिका अन्तःचूचुक पर स्थित परिवहन प्रोटीन के लिए चयनात्मक एंटीबॉडी युक्त दवा conjugates का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है; हालांकि इस विधि फार्मास्यूटिकल्स 7,8 की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू होना दिखाया नहीं किया गया है. इसके अतिरिक्त, बीबीबी की आसमाटिक उद्घाटन क्लिनिक इस्तेमाल किया गया हैब्याज 9 के मस्तिष्क क्षेत्र को एक और अधिक प्रत्यक्ष वितरण के लिए विरोध के रूप में सहयोगी है, लेकिन इस विधि प्रणालीगत दवा खुराक से ग्रस्त है. पर्याप्त प्रयास सीधे मस्तिष्क 10-12 को निशाना बनाने की उम्मीद में transnasal प्रसव के अनुकूलन में डाल दिया गया. कुछ सफलता हासिल किया गया है, निर्णायक परिणाम केवल इंसुलिन 13,14 के रूप में अंतर्जात रिसेप्टर्स, अधिकारी है कि दवाओं के लिए प्राप्त किया गया है. इसके अलावा transnasal वितरण के तंत्र घ्राण न्यूरॉन तेज के माध्यम से या खून 11 के माध्यम से मस्तिष्क में अप्रत्यक्ष प्रविष्टि का सुझाव सबूत के साथ विवादास्पद रहा है. प्रत्यारोपण कैथेटर का उपयोग प्रत्यक्ष, transcranial वितरण हालांकि इस प्रक्रिया को अत्यधिक आक्रामक और कई जटिलताओं 15,16 के साथ जुड़ा हुआ है, हासिल किया गया है. तिथि करने के लिए, मस्तिष्क में उच्च आणविक भार यौगिकों देने के लिए कोई सामान्य, कम आक्रामक तरीका है.

एक murine शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के साथ साथ प्रस्तुतकि मस्तिष्क के साथ एक semipermeable इंटरफ़ेस बनाता है. यह एक माउस में एक शल्य कपाल - उच्छेदन दोष पर एक mucosal झिल्ली explant 17 engrafting द्वारा पूरा किया है. इस प्रक्रिया का उपयोग यह 500 केडीए अप करने के लिए घुलनशील यौगिकों एक समय और आणविक वजन निर्भर फैशन 18 दोनों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीधे मस्तिष्क पैरेन्काइमा में और साथ ही मस्तिष्कमेरु द्रव में) में दिया जा सकता है कि दिखाया गया है. बीबीबी को दरकिनार करने का यह तरीका transnasal इंडोस्कोपिक सर्जरी 19,20 निम्नलिखित खोपड़ी में छेद की मरम्मत के लिए vascularized mucosal grafts का उपयोग करता है जो मानव में खोपड़ी के आधार दोष मरम्मत के लिए एक मॉडल है.

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Protocol

सर्जरी से पहले किया जा करने के लिए सभी प्रक्रियाओं IACUC और किसी भी अतिरिक्त नैतिक या कानूनी अधिकारियों द्वारा अनुमोदित और मानवीय पशु उपचार पद्धतियों का उपयोग कर रहे हैं सुनिश्चित करें. यह बाँझ शल्य चिकित्सा शर्तों का उपयोग IACUC विधि को मंजूरी दी का उपयोग माउस anesthetizing, सर्जरी के दौरान पशु चिकित्सक मरहम के साथ चूहों आंखों में चिकनाई, और postsurgical देखभाल प्रदान शामिल है. प्रक्रिया के पहलुओं को मंजूरी दे दी है, चाहे किसी भी सवाल है कि अगर वहाँ सर्जरी के साथ आगे बढ़ना नहीं है. इस के साथ साथ प्रदर्शन किया सभी प्रक्रियाओं बोस्टन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. पशु की तैयारी और सर्जिकल आपूर्ति

  1. सर्जरी के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा कि सभी शल्य चिकित्सा उपकरण आटोक्लेव.
  2. प्रदर्शन किया जा रहे हैं कि सभी तकनीकों पशु नियामक एजेंसियों द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं सुनिश्चित करें.

Mucosal भ्रष्टाचार के 2. फसल काटने वाले

  1. के रूप में समान उम्र के एक आनुवंशिक रूप से समान माउस चुनाप्रयोगात्मक माउस और (यहाँ: गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद isoflurane asphyxiation) एक IACUC अनुमोदित विधि में यह euthanize.
  2. शल्य कैंची का प्रयोग, खोपड़ी उजागर माउस सिर की नाक क्षेत्र के आसपास की त्वचा को हटा दें.
  3. Laterally नाक क्षेत्र और लंब के रूप में दो लाइनों से जोड़ता है, जो आंखों के साथ लाइन में एक तिहाई पार्श्व जिनमें से दो तीन लाइनों के साथ एक साँस ड्रिल, मार्क के साथ.
  4. आसपास के ऊतकों से नाक पट अलग करने के क्रम में पेट के बल नीचे ड्रिल. एक व्यापक पथ हालांकि यह भी इसे और अधिक कठिन झिल्ली को अलग करने के लिए कर देगा mucosal झिल्ली को नुकसान को रोकने जाएगा. करीब midline के लिए एक संकीर्ण कटौती की सिफारिश की है.
  5. इसका पालन किसी भी ऊतक से मुक्त पट कटौती और यह एक बाँझ खारा समाधान में स्टोर करने के लिए कैंची का प्रयोग करें. इस समय भ्रष्टाचार के किसी भी जुड़ा ऊतक को दूर करने से साफ किया जा सकता है. आदर्श स्थिति undamaged mucosal झिल्ली उपास्थि पट के दोनों किनारों पर उजागर किया है. एक जीआरपिछाड़ी झिल्ली की सतह क्षेत्र कपाल - उच्छेदन साइटों को कवर करने के लिए पर्याप्त है प्रदान की दो चूहों के लिए झिल्ली की आपूर्ति कर सकते हैं. यह भ्रष्टाचार के रूप में जल्दी संभव के रूप में इस्तेमाल और शोधकर्ता के रूप में जल्द ही भ्रष्टाचार अलग है के रूप में चरण 3 पर आय है कि सिफारिश की है.

Mucosal भ्रष्टाचार के 3. शल्य आरोपण

  1. मानक, सड़न रोकनेवाला murine शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का उपयोग करना, anesthetize और stereological फ्रेम में एक माउस माउंट. एक कृंतक संज्ञाहरण मशीन का उपयोग कर शुद्ध ऑक्सीजन में लगभग 2 isoflurane% का उपयोग करें.
  2. कान सलाखों और एक नाक धारक के साथ एक stereotaxic तंत्र में माउस स्थिर. आंखों को नेत्र मरहम लागू करें और तीन दौर के लिए betadine और 75% इथेनॉल के साथ खोपड़ी रगडें. कैंची या एक बाल trimmer का उपयोग कर, सिर पर फर हटा दें. एक धार के साथ खोपड़ी बेनकाब और सिर स्तर. Dosed किया जाएगा कि मस्तिष्क के स्थान के ऊपर एक कपाल - उच्छेदन प्रदर्शन करना. उदाहरण के लिए, striatum लक्षित करते समय एक 1.25 एमएम कटौतीएक साँस ड्रिल का उपयोग:;: (0.88 मिमी एम एल 1.00 मिमी एपी पर केन्द्रित) खोपड़ी में व्यास परिपत्र छेद. बाँझ खारा के साथ drilled क्षेत्र गीले और खोपड़ी को दूर करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें.
  3. ध्यान से एक सुई की नोक का उपयोग ड्यूरा हटा दें. साथ ही, यह नम dural सतह के लिए ऊतक चिपकने वाला की एक न्यूनतम राशि लगाने से पूरा किया जा सकता है. इस परत कठोर है एक बार, एक रेजर ब्लेड टिप के साथ पार्श्व गति झिल्ली को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. दूर घाव से सामना करना पड़ रहा उपकला पक्ष रखने के लिए चरम ख्याल रखने के मस्तिष्क की सतह से ऊपर mucosal झिल्ली रखें. यह सबसे अच्छा चिमटी के साथ कपाल - उच्छेदन साइट से सटे खोपड़ी की सतह पर पूरे पट स्थानांतरित द्वारा किया जाता है. शल्य कैंची की एक जोड़ी की टिप का उपयोग करना, उपास्थि के बंद और खोपड़ी और मस्तिष्क की सतह पर झिल्ली खींच. झिल्ली बाहर सूखी या किसी भी शोषक सामग्री के साथ इसे छूने मत देना. भ्रष्टाचार उदारता कपाल - उच्छेदन के सभी बोनी किनारों ओवरलैप चाहिएite.
  5. Nitrile की एक बाँझ टुकड़ा के साथ भ्रष्टाचार को कवर किया. इस उपचार के दौरान भ्रष्टाचार को त्वचा के आसंजन को रोकने के लिए कार्य करता है. Nitrile पूरे mucosal झिल्ली को कवर करने के लिए काफी बड़े होने की जरूरत है. यदि आवश्यक हो तो अत्यधिक झिल्ली ट्रिम. यह भ्रष्टाचार के संपर्क में आ गया है एक बार Nitrile के किसी भी प्रस्ताव से बचें.
  6. एक चल 5-0 बाँझ सीवन के साथ त्वचा को बंद करें और माउस अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 3-7 दिनों के लिए ठीक करते हैं. त्वचा बंद होने के दौरान Nitrile बाधा या mucosal भ्रष्टाचार उपद्रव नहीं ख्याल रखना.

Dosing समाधान के 4. प्रशासन

  1. Stereotaxic फ्रेम में anesthetized माउस हासिल करने के बाद, कैंची से सिवनी में कटौती और खोपड़ी के आसपास अतिरिक्त त्वचा को हटा दें.
  2. Nitrile अवरोध हटाने और खोपड़ी की सतह को साफ. भ्रष्टाचार दिख रहा है जब तक क्षेत्र को साफ करने के लिए बाँझ खारा और कपास swabs का प्रयोग करें. डी से भी बड़ा हो गया है, तो यह एक रेजर के साथ भ्रष्टाचार में कटौती करने के लिए आवश्यक हो सकता हैसतह क्षेत्र esired.
  3. प्रयोग कुछ दिनों से अधिक समय हो जाएगा, तो यह सिर प्रत्यारोपण को सुदृढ़ करने के लिए कम से कम दो खोपड़ी शिकंजा प्रत्यारोपण करने के लिए बुद्धिमान है.
  4. किनारों खोपड़ी के साथ संपर्क में हैं ताकि भ्रष्टाचार के ऊपर अच्छी तरह से रखें. अच्छी तरह से और खोपड़ी के बीच जंक्शन पर cyanoacrylate चिपकने वाला लागू करें. बाँझ खारा के साथ अच्छी तरह से भरें और सुनिश्चित करें कि कोई लीक कर रहे हैं बनाने की जांच. वेल्स कटौती सिरिंज सुई से बना रहे हैं.
  5. जगह में अच्छी तरह से सुरक्षित करने के लिए खोपड़ी पर हड्डी सीमेंट लागू करें.
  6. एक विंदुक के साथ अच्छी तरह से खारा निकालें. कि चिपकने वाला वांछित समाधान जोड़ें अंदर लीक नहीं किया गया है सत्यापित करने के लिए अच्छी तरह से कई बार धोएं; इस मामले में फ्लोरोसेंट dextran के 50 μl प्रयोग किया जाता है. यह एक ऐसी ही polarity के पानी में घुलनशील यौगिकों dextran के रूप में ही व्यवहार करेंगे कि उम्मीद है. हाइड्रोफोबिक यौगिकों या निलंबन की डिलिवरी इस विधि के साथ पता लगाया नहीं गया है.
  7. करने के लिए सुरक्षित Nitrile का एक परिपत्र टुकड़ा का उपयोग करके अच्छी तरह से शीर्ष टोपीcyanoacrylate चिपकने का उपयोग ऊपर. चिपकने वाला अच्छी तरह से सामग्री के साथ संपर्क में नहीं आता है सुनिश्चित करें.

Transmucosal डिलिवरी के 5. विश्लेषण

  1. समय के वांछित राशि बीत जाने के बाद, माउस anesthetize और इवान नीले रंग का एक समाधान के साथ अच्छी तरह से सामग्री का आदान प्रदान. इस डाई भ्रष्टाचार बरकरार था कि सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. 30 मिनट के बाद, भारी माउस anesthetize डाई समाधान निकालने के लिए, और कत्ल के माध्यम से euthanize.
  3. मैन्युअल प्रत्यारोपण हटाने और शल्य कैंची का उपयोग कर मस्तिष्क को हटा दें. जगह में भ्रष्टाचार रखने के लिए सावधान रहें.
  4. एक बार हटाया, फ्लैश फ्रीज isobutane की एक समाधान में मस्तिष्क एक सूखी बर्फ स्नान में ठंडा.
  5. इष्टतम काटने तापमान 50 माइक्रोन से कम (अक्टूबर) समाधान और टुकड़ा में मस्तिष्क शामिल करें.
  6. एक खुर्दबीन स्लाइड पर सीधे वांछित स्लाइस रखें.
  7. छवि के रूप में जल्द ही अक्टूबर समाधान सूख गया है के रूप में एक पुष्पन माइक्रोस्कोप का उपयोग टुकड़ा.

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Representative Results

एक बड़ा पर्याप्त नाक पट explant प्राप्त करने के बाद के चरणों के लिए महत्वपूर्ण है. यह चित्र 1A में दिखाया दाता माउस की खोपड़ी पर स्थान पर ड्रिलिंग के द्वारा पूरा किया जा सकता है. चित्रा 1 बी में दिखाया के रूप में इस मार्ग के किनारे काटना पर्याप्त आकार का एक explant का उत्पादन होगा. ड्रिलिंग गहराई गहरी पर्याप्त नहीं है, तो भ्रष्टाचार काटा जायेगा और यह मस्तिष्क की सतह को कवर करने के लिए एक बड़ा पर्याप्त झिल्ली प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. अधिक ऊतक नाक पट पर रहेगा क्योंकि सुझाव पथ सलाह नहीं दी है और अधिक से अधिक laterally ड्रिलिंग, और अगले कदम के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा. पिछले mucosal झिल्ली के हस्तांतरण के लिए, पट की सतह सभी अतिरिक्त संयोजी ऊतक की साफ करने की जरूरत है. बार यह किया है, mucosal झिल्ली उपास्थि की सतह पर दिखाई जानी चाहिए. -1 सी ऊतक सफाई के बाद कैसा लग रहा है पता चलता है.

पिछले memb स्थानांतरित करने के लिएराणे, एक कपाल - उच्छेदन और durotomy मस्तिष्क की सतह को बेनकाब करने के लिए किया जाना चाहिए. बाद durotomy खून बह रहा बंद कर दिया है के बाद ही झिल्ली हस्तांतरित किया जा सकता है. चित्रा 2A सर्जरी साइट अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले की तरह दिखना चाहिए पता चलता है. मस्तिष्क की सतह पर उपास्थि से mucosal झिल्ली के हस्तांतरण पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम है और सावधानी से किया जाना चाहिए. काटा पट काफी बड़ी है, mucosal भ्रष्टाचार की सतह क्षेत्र मस्तिष्क की सतह को कवर करने के लिए इतना बड़ा होना चाहिए. एक बार तबादला, शल्य चिकित्सा के क्षेत्र चित्रा 2 बी में है कि इसी तरह दिखता चाहिए. यह उपास्थि के साथ संपर्क में है कि झिल्ली की ओर मस्तिष्क की सतह के साथ संपर्क में है कि एक ही एक है कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है. झिल्ली पर रूप से फ़्लिप या खुद से जोड़ जाता है, उसे खारिज कर दिया जाना चाहिए और एक दूसरे से इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस चरण के पूरा होने पर, खोपड़ी sutured किया जा सकता हैमाउस को ठीक कर सकते हैं और भ्रष्टाचार को चंगा कर सकते हैं. खोपड़ी की भीतरी सतह के साथ संपर्क में आने वाले भ्रष्टाचार से किसी भी प्रतिकूल प्रतिक्रिया को रोकने के क्रम में, सुरक्षा Nitrile का एक टुकड़ा शल्य साइट के लिए ऊपर रखा जाना चाहिए. चित्रा 2C में दिखाया गया है, डाला टुकड़ा झिल्ली को कवर करने के लिए काफी बड़ी है, लेकिन त्वचा बंद suturing बाधित करने के लिए पर्याप्त बड़ा नहीं होना चाहिए.

वसूली की अवधि के दौरान, में वृद्धि पर्याप्त ऊतक झिल्ली dosing से पहले हटा दिया जाना है जो आसपास के periosteum के कारण होती है. खोपड़ी दोबारा खोलने के बाद, बाँझ कपास swabs और नमकीन घोल यह चित्र 3a में है कि इसी तरह लग रहा है जब तक साइट को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता होगी. हम किसी भी पर्याप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नहीं मनाया है; हालांकि इस histologically पुष्टि नहीं की गई है. भ्रष्टाचार यह खोपड़ी की सतह के पार हो गया है अगर एक रेजर के साथ कटौती करने की आवश्यकता हो सकती है. इस स्तर पर खुराक समाधान शामिल होंगे कि अच्छी तरह सेtion भ्रष्टाचार ऊपर प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए. प्रत्यारोपण की लंबी अवधि के यांत्रिक स्थिरता एक चिंता का विषय है अगर कई खोपड़ी शिकंजा इस कदम पर में रखा जा सकता है. यह भ्रष्टाचार स्पर्श नहीं करता है कि इतनी अच्छी तरह से तैनात है सुनिश्चित करें. जगह में एक बार, cyanoacrylate चिपकने वाला खोपड़ी के लिए यह गोंद के लिए लागू किया जा सकता है. यह अच्छी तरह से की सतह के लिए आवेदन किया है और अंतर को सील करने के लिए नीचे की ओर धकेल दिया जाना चाहिए भ्रष्टाचार के संपर्क में आने से चिपकने से रोकने के लिए. अच्छी तरह से सुरक्षित है एक बार, यह दोनों हाइड्रेट करने के लिए खारा भ्रष्टाचार के साथ अस्थायी रूप से भर जाता है और लीक के लिए जाँच की जानी चाहिए. पालन ​​अच्छी तरह से चित्रा 3 बी में उस तरह देखो और चाहिए समाधान यह किसी भी चिपकने वाला शामिल नहीं है जो बताता है कि स्पष्ट किया जाना चाहिए. कुएं में द्रव स्तर छोड़ देंगे क्योंकि किसी भी लीक स्पष्ट हो जाएगा. लीक पाए जाते हैं, तो वे अधिक चिपकने के साथ तय किए जाने की जरूरत है. वैसे तो हड्डी सीमेंट के साथ मजबूत बनाया है. इस बिंदु पर अच्छी तरह से में खारा एक विंदुक के साथ हटाया जा सकता हैवांछित खुराक समाधान के साथ बदल दिया. Nitrile देखभाल के एक टुकड़े के साथ अच्छी तरह से कवर जब यकीन है कि चिपकने वाला कुएं में समाधान से संपर्क नहीं करता है बनाने के लिए लिया जाना चाहिए. पूरी प्रक्रिया के अंत में, माउस सिर चित्रा -3 सी में उस तरह दिखना चाहिए. अच्छी तरह की सामग्री को प्रकाश के प्रति संवेदनशील, डाई या स्याही अच्छी तरह से सामग्री की photodegradation को रोकने के लिए सूखे सीमेंट की सतह पर या सीमेंट का मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा सकता है, तो हड्डी सीमेंट इसलिए थोड़ा पारदर्शी है.

इंतज़ार कर समय के वांछित अवधि के बाद, मस्तिष्क खुराक के प्रभाव की खोज के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए. मस्तिष्क की जांच की जा रही है के आधार पर अलग ढंग से व्यवहार किया जाना चाहिए. प्रक्रिया का उद्देश्य अच्छी तरह से जोड़ा किसी भी रासायनिक, (जैसे कि ऊपर प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है) की उपस्थिति का विश्लेषण करने के लिए है तो यह प्रशासित यौगिकों संरक्षित करने के लिए मस्तिष्क की एक फ्लैश ठंड क्या करने की सिफारिश की है. आंकड़ा 4 > इस दृष्टिकोण का उपयोग कर के एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है. 24 घंटे के लिए एक 40 केडीए फ्लोरोसेंट बहुलक (tetramethyrhodamine संयुग्मित dextran) के साथ खुराक मस्तिष्क के ऊतकों में ध्यान देने योग्य प्रसार को दर्शाता है. मस्तिष्क के ऊतकों में dextran शो प्रसार के साथ हमारे परिणाम पिछले 18 समय और आणविक भार दोनों निर्भर है. छोटे अणुओं बड़े लोगों की तुलना में एक बड़ी हद तक मस्तिष्क पैरेन्काइमा में फैलाना, और हम परीक्षण किया है कि सभी आणविक भार के लिए प्रसार की एक बड़ी राशि में एक बड़ा खुराक समय का परिणाम है. फ़्लैश ठंड से किया जाता है, तो यह सेक्शनिंग के बाद स्लाइड माउंट और किसी भी समाधान के लिए उन्हें बेनकाब नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. कोई भी तरल प्रशासित परिसर solubilize और मस्तिष्क टुकड़ा की सतह क्षेत्र भर में यह फैलाना होगा. Immunohistochemistry मस्तिष्क पर प्रदर्शन किया जा रहा है तो यह मस्तिष्क के ऊतकों को ठीक करने के लिए माउस छिड़कना की सिफारिश की है.

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चित्रा 1. नाक पट कटाई प्रक्रिया की छवियाँ. ए) एक euthanized माउस की खोपड़ी पर ड्रिलिंग साइट का स्थान. बिंदीदार रेखा सीधे अतिरिक्त ऊतक को हटाने के बाद सर्जिकल हटाने. सी) नाक पट के बाद. बी) नाक पट ड्रिल की परिधि से संकेत मिलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. Engrafting प्रक्रिया के सर्जिकल छवियों. ए) कपाल - उच्छेदन और durotomy निम्नलिखित शल्य साइट. छवि खोपड़ी से पहले इस पर भ्रष्टाचार रखने के लिए की तरह दिखना चाहिए का प्रतिनिधि हैकपाल - उच्छेदन साइट पर म्यूकोसा भ्रष्टाचार की. बी) प्लेसमेंट. बिंदीदार रेखा भ्रष्टाचार की परिधि को इंगित करता है. छवि सुरक्षात्मक Nitrile बाधा का भ्रष्टाचार. सी) आरोपण की यात्रा की सतह क्षेत्र से पता चलता है. के रूप में दिखाया सामग्री का आकार भ्रष्टाचार को कवर करने के लिए पर्याप्त बड़ी लेकिन suturing के साथ हस्तक्षेप करने के लिए पर्याप्त नहीं है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. दवा खुराक प्रक्रिया के सर्जिकल छवियों. चंगा mucosal भ्रष्टाचार शल्य साइट अच्छी तरह से खोपड़ी को संलग्न की. बी) छवि के कठोर सफाई निम्नलिखित की तरह लग रहा है की एक) एक उदाहरण. अच्छी तरह से खोपड़ी और के इंटरफेस सुरक्षित हैcyanoacrylate चिपकने वाला और अच्छी तरह से बाँझ खारा से भर जाता है के साथ. स्थायी समाधान के स्तर में अच्छी तरह से कोई लीक इंगित करता है और समाधान की स्पष्टता चिपकने वाला. सी) पूरा सर्जरी की छवि के साथ समाधान का कोई संदूषण इंगित करता है. अच्छी तरह खुराक समाधान होता है और सुरक्षित रूप से एक Nitrile बाधा के साथ छाया हुआ है. बोन सीमेंट अच्छी तरह से प्रत्यारोपण rigidify जगह में है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. 24 घंटे के लिए 40 केडीए tetramethylrhodamine संयुग्मित dextran साथ transmucosal खुराक के बाद एक माउस मस्तिष्क टुकड़ा का फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवि. टुकड़ा 50 की मोटाई के साथ -1.06 मिमी पर्वबिन्दु में लिया गया1, एम. mucosal भ्रष्टाचार मस्तिष्क की सतह पर दिखाई दे रहा है. बार = 1 मिमी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया का सबसे कठिन कदम मस्तिष्क की सतह पर एक पर्याप्त आकार mucosal झिल्ली के सफल स्थानांतरण है. काटा नाक पट काफी बड़ी और अच्छी तरह से साफ किया जाता है तो यह चरण काफी आसान कर दिया है. पट के उदर भाग को छोटा कर दिया जाता है, तो एक नया भ्रष्टाचार प्राप्त किया जाना चाहिए. ड्रिलिंग कोण mucosal झिल्ली ड्रिल से क्षतिग्रस्त नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए माउस सिर को सीधा होना चाहिए. एक व्यापक सिफारिश से ड्रिलिंग रास्ता ले लिया जाता है तो यह पट से जुड़ा है कि अतिरिक्त ऊतक निकालने के लिए बहुत कठिन हो जाएगा. संयोजी ऊतक के किसी भी बड़े टुकड़े बल्कि उन्हें ढीला खींचने के प्रयास में तेज कैंची कटौती के साथ हटा दिया जाना चाहिए. ऊतक के छोटे टुकड़े ऊतक mucosal झिल्ली से जुड़ा नहीं है प्रदान की कैंची के सुझावों के साथ scraping द्वारा हटाया जा सकता है. सफाई की प्रक्रिया के अंत में, अभी भी जुड़ी हुई झिल्ली के साथ उपास्थि सतह उजागर किया जाना चाहिए. Occasionally सेप्टल उपास्थि यह पृष्ठीय किनारे पर से जुड़ा है कि हड्डी से अलग हो सकता है. इस इसे अगले चरण में इसका इस्तेमाल करने के लिए अभी भी संभव है यदि ऐसा होता है, लेकिन यह दो कारणों के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण है. हड्डी सफाई और इसे स्थानांतरित जब explant धारण करने के लिए एक सुविधाजनक संभाल रहा है. एक बार हटाया, इसे और अधिक नाजुक उपास्थि चादर पैंतरेबाज़ी करने के लिए कठिन है. Mucosal झिल्ली उपास्थि से हटाने जब प्राप्त करने के लिए बड़ी से बड़ी और सबसे आसान है जहां दूसरे, उपास्थि हड्डी जंक्शन है. हड्डी उपास्थि से कटे है तो झिल्ली के इस हिस्से को खो दिया है.

सेप्टल भ्रष्टाचार साफ किया गया है और कपाल - उच्छेदन और durotomy प्रदर्शन किया गया है एक बार, mucosal झिल्ली उजागर मस्तिष्क की सतह पर रखा जा सकता है. यह सबसे अच्छा कपाल - उच्छेदन साइट के लिए आसन्न explant स्थिति से पूरा किया है. झिल्ली फिर खोपड़ी पर, उपास्थि से खींच लिया, और मस्तिष्क के ऊपर जा सकता है. कई बातें इस प्रक्रिया के दौरान गलत जा सकते हैंएस. झिल्ली, बाहर शुष्क कर सकते हैं फाड़ हो, खुद के ऊपर, या गुच्छा पर गुना. इसके अलावा पट के दूसरे पक्ष को कवर झिल्ली खोपड़ी के खिलाफ रगड़ से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं. यह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ mucosal झिल्ली को दूर करने के प्रयास में, एक ही समय में दोनों पक्षों से झिल्ली को हटा भी संभव है. इन समस्याओं के सभी को रोकने के क्रम में यह पट के दोनों किनारों का निरीक्षण धीरे धीरे और हमेशा झिल्ली स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण है. सबसे अच्छी रणनीति यह बंद स्लाइड की कोशिश कर रहा से पहले उपास्थि चादर से झिल्ली बेदखल करने के लिए कैंची के सुझावों का उपयोग करने के लिए है. झिल्ली के किसी भी हिस्से को संलग्न रहता है, तो यह ऊतक की लोच उस पर खींच के बाद वापस लेना होगा कि संभव है. छोटे, tugging गतियों का उपयोग करके झिल्ली पट से अलग किया जा सकता है. उसके बाद ही यह आसानी से स्लाइड जाएगा. झिल्ली चिमटी के साथ संभाला जा करने में सक्षम होने के लिए बहुत पतली है; यह केवल एक सतह से दूसरे में खींचा जा सकता है. वह खुद को अधिक से अधिक रूप से फ़्लिप या मुड़ा हुआ हो जाता है, यहत्याग किया जाना चाहिए और एक दूसरे से प्राप्त किया जाना चाहिए.

भ्रष्टाचार उजागर मस्तिष्क की पूरी सतह क्षेत्र को शामिल किया गया है, प्रक्रिया सफल रहा था और सर्जरी साइट ठीक कर सकता है, ताकि सिर की त्वचा sutured किया जा सकता है. त्वचा झिल्ली के साथ संपर्क में नहीं आता है कि तो एक Nitrile बाधा जगह में रखा जाना चाहिए. केयर अन्यथा भ्रष्टाचार की स्थिति स्थानांतरित कर सकते हैं suturing जब इतना दबाव है कि Nitrile पर exerted नहीं है लिया जाना चाहिए. इसके अलावा Nitrile में सीवन नहीं ख्याल रखना. सुनिश्चित करें कि सामग्री का अनुसरण करता है बनाने के लिए सबसे अच्छा तरीका नमकीन घोल के साथ नम रखने के लिए और यकीन है कि यह suturing भर में फ्लैट बना रहता है.

भ्रष्टाचार (3-7 दिन) चंगा हो जाने के बाद अच्छी तरह से खुराक समाधान युक्त भ्रष्टाचार ऊपर खोपड़ी के लिए संलग्न किया जा सकता है. यह चिपकने वाला गोंद के साथ खोपड़ी के लिए अस्थायी रूप से तय की और स्थायी रूप से हड्डी सीमेंट के साथ किया जा सकता है. हड्डी सीमेंट लागू हो जाने के बाद, यह अच्छी तरह से स्थिति therefo तक कोई सुधार करना संभव नहीं होगापुन सभी अनुकूलन से पहले अपने आवेदन करने के लिए किया जाना चाहिए. अच्छी तरह से स्थिति और cyanoacrylate चिपकने के साथ जगह में आयोजित में एक बार, यह बाँझ खारा से भरा जाना चाहिए. प्रक्रिया सफलतापूर्वक किया गया था, तो तरल स्तर नहीं बदलेगा और समाधान स्पष्ट हो जाएगा. वहाँ एक दरार है, तो स्तर छोड़ देंगे और पानी बच गए जहां का स्थान दिखाई जानी चाहिए. रिसाव साइट पर अधिक चिपकने वाला आवेदन करने के बाद, अधिक खारा रिसाव सील किया गया सत्यापित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. चिपकने वाला अच्छी तरह से हल contaminates, तो एक पारदर्शी फिल्म द्रव स्तर के शीर्ष पर दिखाई देगा. यदि ऐसा होता है समाधान स्पष्ट है जब तक अच्छी तरह से नमक के साथ कई बार धोया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, एक कपास स्वैप तरल सतह को छूने से फिल्म को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अच्छी तरह से समाधान स्थिर और स्पष्ट है केवल जब सीमेंट लागू किया जाना चाहिए. सीमेंट सूखा है, अच्छी तरह से खारा हटा दिया है और खुराक के समाधान के साथ बदला जा सकता है. देखभाल करने के लिए लिया जाना चाहिएमें और बाहर अच्छी तरह से pipetting जब झिल्ली को नुकसान नहीं. एक बार भरा है, अच्छी तरह से शीर्ष cyanoacrylate चिपकने का उपयोग Nitrile के एक टुकड़े के साथ बंद किया जाना चाहिए. यह अंतरिक्ष समाधान की सतह और अच्छी तरह से शीर्ष के बीच रह गया है कि महत्वपूर्ण है. इस Nitrile बाधा पर लगा जब चिपकने वाला समाधान स्पर्श नहीं करता है यह सुनिश्चित करेगा.

यह खुराक प्रक्रिया के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए समय है एक बार, मस्तिष्क हटा दिया है और imaged किया जाना चाहिए. Immunohistochemistry प्रदर्शन किया जा रहा है, मानक छिड़काव और एंटीबॉडी धुंधला किया जा सकता है. Dosed परिसर के स्थान निर्धारित किया जा रहा है, यह एक सूखी बर्फ / isobutane समाधान में मस्तिष्क फ्रीज फ्लैश करने के लिए सिफारिश की है. यह मस्तिष्क के स्लाइस में परिसर के स्थान पर यह इच्छामृत्यु के लिए तुरंत पहले था के रूप में ही है कि यह सुनिश्चित करेंगे.

यहाँ बताया प्रोटोकॉल एक शल्य चिकित्सा के माध्यम से माउस मस्तिष्क के लिए दवा वितरण की जांच के लिए एक विधि का वर्णनsemipermeable mucosal झिल्ली 18 grafted. यह खोपड़ी आधार दोष एक vascularized नाक mucosal झिल्ली 19,20 साथ मरम्मत कर रहे हैं, जिसमें मानव में transnasal ट्यूमर को हटाने सर्जरी के परिणाम के अनुरूप है. इस माउस मॉडल का उपयोग करना, यह इन mucosal grafts बीबीबी को दरकिनार और मस्तिष्क को सीधे उच्च आणविक भार दवा वितरण के लिए अनुमति में सक्षम हैं कैसे अध्ययन करने के लिए अब संभव है. अब हम 100 से अधिक बार इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है. इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण एक दाता माउस से एक नाक सेप्टल भ्रष्टाचार के सफल कटाई और परीक्षण माउस पर भ्रष्टाचार से mucosal झिल्ली के हस्तांतरण है. यह प्रक्रिया, पहली बार के लिए, तंत्रिका विज्ञान और मनोरोग विकारों की एक किस्म के लिए उच्च आणविक भार चिकित्सा विज्ञान की preclinical परीक्षण सक्षम बनाता है.

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Disclosures

बेंजामिन एस Bleier एमडी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए दवा वितरण की अनंतिम पेटेंट को कवर तरीकों के प्रमुख आविष्कारक है.

Acknowledgments

इस अध्ययन पार्किंसंस अनुसंधान 2011 रैपिड रिस्पांस नवाचार पुरस्कार कार्यक्रम के लिए Mcihael जे फॉक्स फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Taconic C57BL/6
Isoflurane Piramal Healthcare
Student fine scissors Fine Science Tools 91461-11
Pneumatic drill MTI Dental 333-CB
Drill bit
Forceps Fine Science Tools 91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP Abbott Laboratories 4925
Polystyrene Petri dish Fisher 08-757-12 for temporarily storing graft
Bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Oxygen/Isoflurane System SurgiVet V720100
Temperature Control System Physitemp TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument KOPF Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators Fisher 23-400-106
7.5% Providone iodine Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless Feather 2976#10
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools 10003-12
3% Hydogen peroxide for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB
Needles Becton, Dickinson and Company 305176 needle tip cut off and used as well
Syringes Becton, Dickinson and Company 309597
Nitrile gloves Denville Scientific Inc G4162 for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder Fine Science Tools 91201-13
Cyanoacrylate adhesive commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque Stoelting 51458
Isobutane (2-methylbutane) Aldrich M32631 for dry ice bath
Dry ice

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References

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