Heterotop Mucosal transplantere Procedure for direkte Drug Delivery til Brain i mus

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En musemodel af human endoskopisk cranii genopbygning er blevet udviklet, der skaber en semipermeabel grænseflade mellem hjernen og næsen ved hjælp af nasal slimhinde-podninger. Denne metode gør det muligt for forskere at undersøge levering til centralnervesystemet af højmolekylære terapeutika, der ellers er udelukket af blod-hjerne-barrieren, når de indgives systemisk.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kohman, R. E., Han, X., Bleier, B. S. Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51452, doi:10.3791/51452 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Levering af terapeutiske midler ind i hjernen hæmmes af tilstedeværelsen af ​​blod-hjerne-barrieren (BBB), som begrænser passagen af ​​polære og forbindelser med høj molekylvægt fra blodbanen og ind i hjernevæv. Nogle direkte succes levering i mennesker er opnået via implantation af transkranielle katetre; men denne metode er meget invasiv og forbundet med mange komplikationer. En mindre invasiv alternativ ville være at dosere hjernen gennem et kirurgisk implanteret, semipermeabel membran, såsom den nasale mucosa, der anvendes til at reparere cranii manglerne efter endoskopisk transnasal tumor fjernelse kirurgi i mennesker. Drug overførsel selvom denne membran vil reelt omgå BBB og diffundere direkte ind i hjernen og cerebrospinalvæsken. Inspireret af denne fremgangsmåde blev en kirurgisk fremgangsmåde udviklede musene, der bruger en donor septal slimhinde indpodet i et ekstrakranialt kirurgisk BBB defekt. Denne model har vist sig effektivt attillade passage af forbindelser med høj molekylvægt i hjernen. Da mange lægemiddelkandidater er i stand til at krydse BBB, denne model er værdifuldt for at udføre præklinisk afprøvning af nye behandlingsformer for neurologiske og psykiatriske sygdomme.

Introduction

Behandling af neurologiske og psykiatriske sygdomme er alvorligt hæmmet af tilstedeværelsen af blod-hjerne-barrieren (BBB), hvilket hindrer over 95% af alle potentielle farmaceutiske midler at nå centralnervesystemet 1-3. For eksempel glial neurotrofisk faktor (GDNF) har vist sig at være effektivt i behandling af Parkinsons sygdom, når det injiceres direkte i hjernen, men er ineffektiv, når den leveres systemisk, fordi det ikke kan trænge BBB 4-6.

Talrige nærmede er blevet udviklet til at omgå dette problem. Forbedring i systemisk levering af neurotheraputics er blevet påvist ved hjælp af lægemiddelkonjugater indeholdende antistoffer er selektive for transportproteiner placeret på hjernen kapillærendotelet; men denne metode har ikke vist sig at være gældende for en bred vifte af lægemidler 7,8. Derudover har osmotisk åbning af BBB blevet anvendt klinikallierede, men denne fremgangsmåde lider af systemisk lægemiddel dosering i modsætning til en mere direkte levering til hjernen regionen af interesse 9. Væsentlig indsats har været lagt i at optimere transnasal levering i håb om direkte rettet mod hjernen 10-12. Selv om nogle succes er opnået, har afgørende resultater kun er opnået for lægemidler, der besidder endogene receptorer, såsom insulin 13,14. Desuden mekanismen for transnasal levering har været kontroversiel med tyder indirekte indrejse i hjernen via olfaktoriske neuron optagelse eller gennem blodbanen 11. Direct transkraniel levering ved hjælp af implanterbare katetre er opnået, men denne fremgangsmåde er meget invasiv og forbundet med mange komplikationer 15,16. Til dato er der ingen generel, minimalt invasiv metode til at levere forbindelser med høj molekylvægt i hjernen.

Præsenteret heri er et murint kirurgisk procedureder skaber en semipermeabel grænseflade med hjernen. Dette opnås ved at transplantere en slimhindemembran eksplantatet 17 over en kirurgisk kraniotomi defekt i en mus. Ved hjælp af denne fremgangsmåde er det blevet vist, at opløselige forbindelser op til 500 kDa kan leveres ind i det centrale nervesystem (direkte ind i hjerneparenkymet samt i cerebrospinalvæske) i både tid og molekylvægt afhængig måde 18. Denne metode til at omgå BBB er en model for kraniet basen defekt reparationer hos mennesker, der bruger vaskulariserede slimhinde podninger til at reparere huller i kraniet efter transnasal endoskopisk kirurgi 19,20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før operation sikre, at alle procedurer, der skal gøres, er godkendt af IACUC og eventuelle yderligere etiske eller juridiske myndigheder og bruge human behandling af dyr praksis. Dette omfatter brug af sterile kirurgi betingelser, bedøve musen ved at bruge IACUC godkendt metode, smøring mus øjne med dyrlægen salve under operationen, og give postsurgical pleje. Må ikke fortsætte med kirurgi, hvis der er nogen spørgsmål, om aspekter af proceduren er godkendt. Alle procedurer udføres heri, blev godkendt af Boston University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1.. Forberedelse af dyrene og kirurgiske Supplies

  1. Autoklavér alle kirurgisk instrument, der vil blive anvendt under operationen.
  2. Sørg for at alle teknikker, der skal udføres, er godkendt af de animalske reguleringsorganer.

2.. Høst af mucosal Graft

  1. Valgte en genetisk identisk mus af samme alder somden eksperimentelle mus og aflive det i en IACUC godkendt metode (her: isofluran kvælning efterfulgt af cervikal dislokation).
  2. Ved hjælp af kirurgiske sakse, fjern skindet omkring den nasale region mus hoved udsætte kraniet.
  3. Med en pneumatisk boremaskine, mærket med tre linjer, hvoraf to sideværts flankerer den nasale region og en tredje i overensstemmelse med de øjne, der forbinder de to linjer vinkelret.
  4. Bore ned ventralt for at adskille næseskillevæggen fra det omgivende væv. En bredere vej vil forhindre beskadigelse af slimhinden, men det vil også gøre det mere vanskeligt at isolere membranen. En smal snit tættere på midterlinjen anbefales.
  5. Brug en saks til at klippe skillevæggen fri for væv levet op til det, og opbevar det i en steril saltvandsopløsning. På dette tidspunkt transplantatet kan renses op for at fjerne alle tilsluttede væv. Den ideelle situation er at have ubeskadigede slimhindemembraner udsat på begge sider af brusk septum. Én gr.agterste kan levere membran til to mus givet overfladeareal af membranen er tilstrækkelig til at dække kraniotomi sites. Det anbefales, at protesen anvendes så hurtigt som muligt og forskeren fortsætter til trin 3, så snart transplantatet isoleres.

3.. Kirurgisk implantation af mucosal Graft

  1. Brug standard, aseptiske murine kirurgiske procedurer, bedøver og montere en mus i stereologiske ramme. Bruge cirka 2% isofluran i ren oxygen ved hjælp af en gnaver anæstesiapparat.
  2. Immobilisere mus i en stereotaktisk apparat med øre barer og en næse holder. Påfør oftalmologiske salve til øjnene og krat hovedbunden med betadin og 75% ethanol i tre runder. Enten ved hjælp af en saks eller et hår trimmer, fjerne pels på hovedet. Expose kraniet med et barberblad og nivellere hovedet. Udfør en kraniotomi over placeringen af ​​hjernen, der skal doseres. For eksempel, når målretning striatum skære et 1,25 mmdiameter cirkulære hul i kraniet (centreret ved AP: 1.00 mm ML: 0,88 mm) ved hjælp af en pneumatisk boremaskine. Fugt det borede område med sterilt saltvand og bruge et barberblad til at fjerne kraniet.
  3. Fjern forsigtigt dura med spidsen af ​​en nål. Derudover kan dette opnås ved at anvende en minimal mængde af vævklæbemiddel til den fugtige dural overflade. Når dette lag er hærdet, kan sideværts bevægelse med et barberblad spids anvendes til at fjerne membranen.
  4. Placer slimhindemembranen over hjernen overflade under ekstrem omhu for at holde epitel vendende væk fra såret. Dette gøres bedst ved at overføre hele skillevæg på overfladen af ​​kraniet støder op til kraniotomi site med en pincet. Med spidsen af ​​et par af kirurgiske sakse, trækkes membranen ud af brusk og på kraniet og hjernen overflade. Lad ikke membranen tørre ud eller røre det med nogen absorberende materiale. Transplantatet bør generøst overlappe alle benede kanter kraniotomi site.
  5. Dæk transplantatet med en steril stykke nitril. Dette fungerer til at forhindre adhæsion af huden til implantatet under helingen. Nitrilet skal være stort nok til at dække hele slimhinden. Trim overdreven membran, hvis nødvendigt. Undgå enhver bevægelse af nitril, når det er kommet i kontakt med transplantatet.
  6. Luk huden med en kørende 5-0 steril sutur, og lad musen komme i 3-7 dage før du går videre til næste trin. Pas på ikke at forurolige nitril barriere eller slimhinden transplantat under huden lukning.

4.. Administration Dosering Solution

  1. Efter at have sikret den bedøvede mus i stereotaktisk ramme, klippe sutur med en saks og fjerne overskydende hud omkring kraniet.
  2. Fjern nitril barriere og rengøre overfladen af ​​kraniet. Brug sterilt saltvand og vatpinde til at rense området, indtil transplantatet er synlig. Det kan være nødvendigt at skære transplantatet med en barberkniv, hvis vokset større end desired overfladeareal.
  3. Hvis forsøget bliver længere end et par dage, er det klogt at implantere mindst to kraniet skruer til at styrke hovedet implantat.
  4. Placer godt stykke over transplantatet, således at kanterne er i kontakt med skallen. Påfør cyanoacrylatklæbemiddel ved krydset mellem brønden og kraniet. Fyld godt med sterilt saltvand og kontroller, at der ikke er utætheder. Wells er lavet af cut sprøjtenåle.
  5. Anvend knoglecement på skallen for at sikre godt på plads.
  6. Fjern saltvand fra brønden med en pipette. Vask grundigt flere gange for at kontrollere, at limen har ikke lækket i. Tilsæt ønskede løsning; i dette tilfælde 50 pi fluorescerende dextran anvendes. Det forventes, at vandopløselige forbindelser af en tilsvarende polaritet vil opføre sig på samme måde som dextran. Levering af hydrofobe forbindelser eller suspensioner er ikke blevet undersøgt med denne metode.
  7. Cap toppen af ​​brønden ved hjælp af et cirkulært stykke nitril fastgjort tiltop hjælp cyanoacrylatklæbemiddel. Sørg for, at limen ikke kommer i kontakt med såvel indhold.

5. Analyse af Transmucosal levering

  1. Efter den ønskede tid er gået, bedøver musen og udveksle såvel indholdet med en opløsning af Evans blåt farvestof. Dette farvestof anvendes til at verificere, at transplantatet var intakt.
  2. Efter 30 minutter bedøver musen tungt, fjerne farvestoffet løsning, og aflive via halshugning.
  3. Fjern manuelt implantatet og fjerne hjernen ved hjælp af kirurgiske saks. Vær omhyggelig med at holde transplantatet på plads.
  4. Når fjernet, flash-fryse hjernen i en opløsning af isobutan afkølet i et tøris-bad.
  5. Integrer hjernen i Optimal Cutting Temperatur (OLT) løsning og skive ved 50 mM.
  6. Placer de ønskede skiver direkte på et objektglas.
  7. Billede af udsnit ved hjælp af en fluorescens mikroskop, så snart OLT opløsningen er tørret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erhvervelse af en stor nok næseskillevæggen explant er afgørende for de efterfølgende trin. Dette kan opnås ved at bore ved placeringen på donormus kraniet er vist i figur 1a. Skæring ad denne vej vil producere en explant af tilstrækkelig størrelse, som vist i figur 1b. Hvis sådybden ikke er dyb nok, vil transplantatet være trunkerede og det vil være svært at opnå en tilstrækkelig stor membran til at dække hjernens overflade. Boring mere sideværts end den foreslåede sti ikke anbefales, da mere væv vil forblive på næseskillevæggen, og det næste skridt vil være mere vanskeligt. Forud for overførsel af slimhinden overfladen af ​​skillevæggen skal rengøres for overskydende bindevæv. Når dette er gjort, skal slimhinden være synlig på overfladen af brusken. Figur 1c viser, hvad væv ligner efter rengøring.

Forud for at overføre membRane, kraniotomi og durotomy skal udføres for at blotlægge hjernen overflade. Først efter den post-durotomy blødningen er stoppet kan overføres membranen. 2a viser hvad operationsstedet skal se ud, før du fortsætter til næste trin. Overførsel af slimhinden fra brusk på hjernen overflade er den mest teknisk udfordrende trin i den samlede kirurgiske indgreb og skal udføres omhyggeligt. Hvis det høstede septum er stor nok, bør overfladearealet af den mucosale graft være store nok til at dække hjernens overflade. Når overføres, bør det kirurgiske område ligner den i figur 2b. Det er vigtigt at sørge for, at den side af membranen, der er i kontakt med brusk er den samme, som er i kontakt med hjernen overflade. Hvis membranen bliver vippet over eller foldet over sig selv, skal det kasseres, og en anden skal anvendes. Når dette trin er fuldført, kan hovedbunden sutureresså musen kan komme sig og transplantatet kan helbrede. For at undgå bivirkninger fra transplantatet kommer i kontakt med den indre overflade af hovedbunden, bør et stykke beskyttende nitril være placeret over på operationsstedet. Som vist i figur 2c, bør det indsatte stykke være store nok til at dække membranen, men ikke store nok til at hindre suturering huden lukket.

Under restitutionsperioden, væsentlig væv i vækst opstår af den omgivende periosteum, som skal fjernes før dosering membranen. Efter genåbning af hovedbunden vil sterile vatpinde og saltopløsning skal anvendes til at rense stedet, indtil det ligner den i figur 3a. Vi har ikke observeret nogen betydelig immunrespons; men dette er ikke blevet bekræftet histologisk. Transplantatet kan være nødvendigt at blive skåret med en barberkniv, hvis det er vokset hen over overfladen af ​​kraniet. På dette stadium brønden, der skal indeholde dosering løsningning skal implanteres over transplantatet. Adskillige kraniet skruer kan sættes ind på dette trin, hvis langsigtede mekanisk stabilitet af implantatet er en bekymring. Sørg brønden er placeret, så den ikke rører implantatet. Når først på plads, kan cyanoacrylatklæbestof påføres lim det til kraniet. For at forhindre klæbemidlet i at komme i kontakt med transplantatet det skal anvendes til overfladen af ​​brønden og skubbes nedad for at tætne mellemrummet. Når brønden er sikker, skal det fyldes midlertidigt med saltvand til både hydrat transplantatet og kontrollér for lækager. Den klæbes godt skal se ud som i figur 3b og opløsning bør være klart angiver, at det ikke indeholder noget klæbemiddel. Eventuelle lækager vil være indlysende, fordi væskeniveauet i brønden vil falde. Hvis der findes lækager, de skal fastsættes med mere lim. Brønden bliver derefter forstærket med knoglecement. På dette tidspunkt saltvand i brønden kan fjernes med en pipette ogerstattes med den ønskede dosering løsning. Når der dækker godt med et stykke af nitril pleje bør tages for at sørge for, at limen ikke kontakte løsningen i brønden. Ved afslutningen af hele proceduren, bør musen hoved ligner den i figur 3c. Knoglecementen er derfor svagt gennemskinnelig hvis indholdet af brønden er lysfølsomme, farvestof eller blæk kan tilsættes til overfladen af ​​det tørrede cement eller cement-blanding for at forhindre fotonedbrydning af såvel indhold.

Efter at den ønskede periode ventetid bør hjernen analyseres for at opdage virkningen af ​​doseringen. Hjernen skal behandles forskelligt, afhængigt af, hvad der bliver undersøgt. Hvis formålet med fremgangsmåden er at analysere tilstedeværelsen af et kemikalie tilsættes til brønden, (som beskrevet i protokollen afsnittet ovenfor), så anbefales det at gøre en flash frysning af hjernen for at bevare de indgivne forbindelser. Figur 4 > Viser et repræsentativt resultat af anvendelse af denne fremgangsmåde. Dosering med en 40 kDa fluorescerende polymer (tetramethyrhodamine dextran) i 24 timer viser mærkbar spredning i hjernevæv. Vores tidligere resultater med dextran vis spredning i hjernevæv er både tid og molekylvægt afhængig 18. Mindre molekyler diffunderer ind i hjerneparenkymet i højere grad end større partikler og en større dosering tid resulterer i en større mængde diffusion for alle molekylvægte, som vi testede. Hvis flash frysning er gjort, er det vigtigt at montere dias efter sektionering og ikke udsætte dem for enhver løsning. Enhver væske vil solubilisere den administrerede forbindelse og diffundere den over overfladearealet af hjernesnit. Hvis immunhistokemi skal udføres på hjernen, så det anbefales at perfuse musen til at fastsætte hjernevæv.

iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Figur 1.. Billeder af næseskillevæggen høst procedure. A) Placeringen af borestedet på skallen af en aflivet mus. De stiplede linjer angiver omkredsen til at bore. B) næseskillevæggen direkte efter kirurgisk fjernelse. C) næseskillevæggen efter at fjerne overskydende væv. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Kirurgiske billeder af engraftment processen. A) operationssted efter kraniotomi og durotomy. Billedet er repræsentative for, hvad kraniet skal se ud forud for at placere transplantatet på det. B) Placering af slimhinden graft på kraniotomi site. Den stiplede linje angiver omkredsen af ​​implantatet. Billedet viser den ønskede overflade af implantatet. C) Implantation af den beskyttende nitril barriere. Størrelsen af materialet, som vist er stort nok til at dække transplantatet, men ikke stor nok til at forstyrre suturering. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Fig. 3. Kirurgisk billeder af doseringen processen. A) Et eksempel på, hvad det helet slimhinde graft ligner følgende streng rengøring af operationsstedet. B) Billede af godt fastgjort til kraniet. Grænsefladen af ​​kraniet og er godt sikretmed cyanoacrylat klæbemiddel og fyldes med sterilt saltvand. Den stabile løsning niveau indikerer ingen lækager fra brønden og klarheden af løsningen viser ingen forurening af løsningen med lim. C) Billedet af afsluttet operation. Boringen indeholder doseringen løsning og er forsvarligt lukket med et nitril barriere. Knoglecement er på plads til at afstive det godt implantatet. Klik her for at se større billede.

Figur 4
Fig. 4. Fluorescerende mikroskop billede af en musehjerne skive efter transmucosal dosering med 40 kDa tetramethylrhodamin konjugeret dextran i 24 timer. Udsnittet blev taget på -1,06 mm bregma med en tykkelse på 501; meter. Mucosal graft er synlig på overfladen af ​​hjernen. Bar = 1 mm. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den sværeste skridt i proceduren, der er beskrevet heri, er den vellykket overdragelse af en tilstrækkelig størrelse slimhinde på hjernen overflade. Dette trin er væsentligt nemmere, hvis det høstede næseskillevæggen er stort nok og rengøres godt. Hvis den ventrale del af skillevæggen er afkortet, hvis en ny graft opnås. Boringen vinkel skal være vinkelret på musen hovedet for at sikre, at slimhinden ikke beskadiges af boret. Hvis en bredere end anbefalet boring sti taget det vil være meget sværere at fjerne de ekstra væv, der er forbundet med skillevæggen. Eventuelle store stykker af bindevæv bør fjernes med skarpe saks nedskæringer snarere end at forsøge at trække dem løs. Mindre stykker væv kan fjernes ved skrabning med spidserne af saks forudsat at vævet ikke er forbundet til slimhinden. Ved slutningen af ​​renseprocessen skal bruskoverfladen med membranen stadig fastgjort blive udsat for. Occaforeløbigt den septal brusk kan blive løsrevet fra knoglerne, at det er tilsluttet på den dorsale kant. Hvis dette sker, er det stadig muligt at bruge det i næste trin, men det er mere udfordrende for to grunde. Knoglen er et praktisk håndtag til at holde eksplantatet når rengøring og overføre det. Når fjernet, er det sværere at manøvrere mere delikat brusk ark. For det andet, brusk-knogle kryds er, hvor slimhinden er tykkeste og nemmeste at få, når du fjerner det fra brusk. Hvis knoglen er adskilt fra brusk denne del af membranen er tabt.

Når den septale graft er blevet rengjort og kraniotomi og durotomy er blevet udført, kan slimhinden anbringes over den blotlagte hjerne overflade. Dette opnås bedst ved at anbringe eksplantatet støder op til kraniotomi site. Membranen kan derefter trækkes fra brusk på kraniet, og i hjernen. Mange ting kan gå galt i løbet af denne processek. Membranen kan udtørre, få revet, fold på toppen af ​​sig selv, eller bundt op. Også membran, der dækker den anden side af skillevæggen kan blive beskadiget gnide mod kraniet. Det er også muligt, at i forsøget på at fjerne vender opad slimhinden, fjerner man de membraner fra begge sider på samme tid. For at undgå alle disse problemer er det afgørende at flytte membranen langsomt og altid iagttage begge sider af skillevæggen. Den bedste strategi er at bruge spidsen af ​​en saks til at fjerne membranen fra brusk ark, før du prøver at skubbe det væk. Hvis nogen del af membranen forbliver fastgjort, er det muligt, at elasticiteten af ​​vævet trækkes tilbage efter at trække det. Ved at bruge små, tugging bevægelser membranen kan frigøres fra skillevæggen. Først da vil det let glide. Membranen er for tynd til at kunne håndteres med pincet det kan kun trækkes fra den ene overflade til den anden. Hvis det bliver drejet rundt eller foldet over sig selv, detskal kasseres og en anden skal opnås.

Hvis transplantatet dækker hele overfladen af ​​den eksponerede hjernen, forløb og hovedbunden kan sutureres således at operationsstedet kan helbrede. En nitril barriere skal sættes på plads, så huden ikke kommer i kontakt med membranen. Der skal udvises omhu, så at trykket ikke udøves på nitril ved suturering ellers graft stilling kan bevæge sig. Også passe på ikke at sy ind i nitril. Den bedste måde at sikre, at materialet adlyder, er at holde den fugtig med saltvandsopløsning og sørg for at det forbliver fladt hele suturering.

Når implantatet er helet (3-7 dage) i brønden indeholdende dosering løsning kan være fastgjort til kraniet over transplantatet. Det kan fastgøres midlertidigt til kraniet med lim og permanent med knoglecement. Når knoglen cement anvendes, vil det ikke være muligt at foretage rettelser til godt position therefore alle optimering skal ske forud for dens anvendelse. Når brønden er i position og holdes på plads med cyanoacrylat klæbemiddel, bør det være fyldt med sterilt saltvand. Hvis proceduren blev udført med succes væskeniveauet ændres ikke, og opløsningen bliver klar. Hvis der er en lækage, vil niveauet falde, og placeringen af ​​hvor vandet undslap skal være synlig. Efter anvendelse af mere lim på læk sted, bør mere saltvand tilføjes at kontrollere læk blev forseglet. Hvis limen forurener brøndopløsningen vil en gennemskinnelig film være synlige på toppen af ​​niveauet væske. Hvis det forekommer, og skal vaskes flere gange med saltvand, indtil opløsningen er klar. Derudover kan en bomuld swap bruges til at fjerne filmen ved at røre ved det til den flydende overflade. Kun når brønden opløsning er stabil og klar bør cement anvendes. Når cementen er tør, kan saltvand fra brønden fjernes og erstattes med dosering løsning. Der skal udvises omhu for atikke at beskadige membranen, når pipettering og ud af brønden. Når de er fyldt, skal toppen af ​​brønden forsegles med et stykke af nitril ved hjælp cyanoacrylatklæbemiddel. Det er vigtigt, at rummet er tilbage mellem overfladen af ​​opløsningen, og toppen af ​​brønden. Dette vil sikre, at limen ikke rører løsning, når sætte på nitril barriere.

Når det er tid til at analysere virkningen af ​​doseringsproceduren skal hjernen fjernes og afbildes. Hvis immunhistokemi skal udføres, kan standard perfusion og antistoffarvning gøres. Hvis placeringen af ​​forbindelsen doseres skal bestemmes, anbefales det at blinke fryse hjernen i et tøris / isobutan løsning. Dette vil sikre, at placeringen af ​​forbindelsen i hjernen skiver er den samme som den var umiddelbart før eutanasi.

Den heri beskrevne protokol beskriver en fremgangsmåde til at undersøge drug delivery til muse hjernen gennem et kirurgiskpodede semipermeabel slimhinden 18. Dette er analogt til resultatet af transnasal tumor fjernelse kirurgi i mennesker, hvor kraniet basen fejl er repareret med en vaskulariseret nasal slimhinde 19,20. Ved anvendelse af denne musemodel, er det nu muligt at undersøge, hvordan disse mucosale transplantater er i stand til at omgå BBB og giver mulighed for direkte høj molekylvægt drug delivery til hjernen. Vi har nu udført denne procedure over 100 gange. Afgørende for denne fremgangsmåde er en vellykket høst af en nasal septal graft fra en donor mus og overførsel af slimhinden fra transplantatet på test mus. Denne procedure, for første gang, gør præklinisk afprøvning af højmolekylære terapi for en række neurologiske og psykiatriske lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Benjamin S. Bleier MD er bly opfinder af foreløbige patent for metoder til drug delivery til det centrale nervesystem.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af Mcihael J. Fox Foundation for Parkinsons Research 2011 reaktionsoperationer Innovations Awards Program. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Taconic C57BL/6
Isoflurane Piramal Healthcare
Student fine scissors Fine Science Tools 91461-11
Pneumatic drill MTI Dental 333-CB
Drill bit
Forceps Fine Science Tools 91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP Abbott Laboratories 4925
Polystyrene Petri dish Fisher 08-757-12 for temporarily storing graft
Bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Oxygen/Isoflurane System SurgiVet V720100
Temperature Control System Physitemp TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument KOPF Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators Fisher 23-400-106
7.5% Providone iodine Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless Feather 2976#10
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools 10003-12
3% Hydogen peroxide for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB
Needles Becton, Dickinson and Company 305176 needle tip cut off and used as well
Syringes Becton, Dickinson and Company 309597
Nitrile gloves Denville Scientific Inc G4162 for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder Fine Science Tools 91201-13
Cyanoacrylate adhesive commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque Stoelting 51458
Isobutane (2-methylbutane) Aldrich M32631 for dry ice bath
Dry ice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
  2. Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
  3. Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
  4. Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
  5. Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
  6. Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
  8. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
  9. Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
  10. Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
  11. Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
  12. Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
  13. Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
  14. Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
  15. Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
  16. Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
  17. Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
  18. Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
  19. Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
  20. Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics