게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

Biology
 

Summary

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

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Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale. J. Vis. Exp. (87), e51455, doi:10.3791/51455 (2014).

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Abstract

mRNA의 번역은 유전자 발현의 조절에서 중심 역할을하고 포유 동물 세포에서 가장 에너지 소모 과정을 나타낸다. 따라서 mRNA의 번역의 조절 곤란 암 등 병적 상태의 다양한 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 리보솜은 또한함으로써 기능과 새로 합성 된 폴리 펩타이드의 안정성을 조절, 초기 폴리 펩타이드의 접힘을 촉진 보호자를 호스팅합니다. 또한, 새로운 데이터는 리보솜이 신호가 리보솜에서 등장으로 새로 합성 된 폴리 펩타이드의 번역 후 변형의 다양한 연루 분자, 및 / 또는 번역 기계의 구성 요소의 레퍼토리를위한 플랫폼 역할을 나타냅니다. 여기서, 자당 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 리보솜 분획 노포 방법을 설명한다. 자체 개발 한 "anota"알고리즘과 함께이 방법은 수 있습니다 diffe 직접 결정게놈 전체 규모에 대한 개인의 mRNA rential 번역. 더욱이,이 다양한 프로토콜은 새로 합성 된 폴리 펩타이드의 폴딩과 분해에 중심 역할을한다는 것을 포함 리보솜 연관된 단백질 복합체의 기능을 해부 목표 생화학 다양한 연구에 사용될 수있다.

Introduction

유전자 발현을 제어하는​​ 규제 네트워크는 광범위하게 지난 수십 년 동안 연구되어왔다. 게놈 전체 규모로 안정 상태 mRNA 수준에서의 변경은 소위 "유전자 발현"프로파일을 결정하는 데 사용 하였다함으로써 전사 조절에 집중 이러한 연구 노력의 대부분. 최근 연구는 정상 상태의 mRNA 수준이 느슨하게함으로써 mRNA의 번역을 포함한 전사 후 기전은, 유전자 발현 3,4의 조절에 중요한 역할을한다는 것을 나타내는, 프로테옴 1,2의 조성물에 대응 드러낸다. 실제로, ~ 단백질 수준의 50 %가 불멸화 마우스 섬유 아세포 5 mRNA의 번역 수준에서 결정되는 것으로 추정되었다.

mRNA의 번역의 mRNA가 리보솜 조율, 전송 RNA를 (tRNA들)의 행동과 액세서리 요인 코를 통해 단백질로 번역되는 동안 고도의 조절 과정mmonly 번역 인자 (TFS) 6라고도합니다. 단백질 합성은 포유 동물 세포 7에서 가장 에너지 소모 과정이며, 따라서 글로벌 mRNA의 번역 속도는 영양 가용성 및 세포 증식 속도 8을 수용 할 수 있도록 조정됩니다. 글로벌 mRNA의 번역 속도, 다양한 세포 외 자극 (예를 들면 호르몬과 성장 인자), 세포 내 신호 (예를 들어 아미노산 수준)과 스트레스의 다른 유형 (예 : ER 스트레스)이다의 mRNA의 풀 선택적 변화를 유도의 변화뿐만 아니라 (translatome) 6 번역된다. 자극의 종류, 일부의 번역 활동하지만 모든 mRNA를 극적으로하여 빠른 세포 반응 6를 탑재하는 데 필요한 프로테옴의 변화의 결과로 영향에 따라. translatome 이러한 질적 및 양적 변화는 트랜스 연기 요소 사이의 상호 작용 (에 의해 매개되는 것으로 생각된다 예를 들어, 6,9의 선택된 부분 집합에 존재하는 시스 요소 (RNA 요소 또는 기능)의 구성 요소. 예를 들어, 레벨 및 / 또는 속도 제한 번역 개시의 활성의 변화의 eIF4E와 eIF2 선택적 특정 5'UTR 특징 6에 근거 사체의 번역을 조절 인자. 의 eIF4E와 eIF2는 각각 6, 리보솜에 mRNA와 기자의 tRNA의 채용이 필요합니다. eIF4E에 활동의 증가는 선택적으로 사이클린, C-MYC 및 BCL-XL (10) 등의 단백질을 자극하는 인코딩 증식과 생존을 포함하여 긴 고도로 구조화 된 5'UTRs를 숨겨의 mRNA의 번역을 강화합니다. 차례로, eIF2의 불 활성화를 선택적으로 최대 등 그 인코딩 마스터 T와 같은 자신의 5'UTRs 짧은 억제 상류 오픈 리딩 프레임 (uORFs)를 포함하는의 mRNA의 번역을 조절하는 동안, 글로벌 단백질 합성으로 종료로 연결펼친 단백질 반응 (예 ATF4)의 ranscriptional 레귤레이터. 영양분, 성장 인자 및 호르몬, 라파 마이신의 기계적 / 포유류의 대상 MAPK 경로를 직접 인산화 반면 (mTOR의) 통로, 4E-결합 단백질 번역 진압 (4E-BP)의 가족을 불 활성화에 의해 eIF4E에 활동을 자극 등 다양한 자극에 대한 응답으로 6,11를 EIF4E. 차례로, eIF2α 키나아제 (즉, PERK, PKR, HRI 및 GCN2)는 영양 결핍, ER 스트레스와 바이러스 감염 6,12에 대한 응답의 eIF2α subunit 규제를 인산화에 의해 eIF2을 억제한다. TF가의 활동 및 / 또는 발현의 변화는, 번역 기계의 miRNA 등의 규제 요인의 다른 구성 요소는 암, 대사 증후군, 신경 및 정신 장애, 신장 및 심장 혈관 질환 13 ~ 19 등 다양한 병적 인 상태에서 관찰되었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 그 날을 번역 표시chanisms 세포 항상성을 유지하고 그들의 폐기 다양한 인간 질환의 병인에서 중요한 역할을한다는 중추적 역할을한다.

여기서, monosomes, 리보솜 소단위와 메신저 리보 핵산 단백질 입자 (mRNPs)에서 polysom​​es를 구분하는 데 사용되는 포유 동물 세포에서 자당 밀도 구배 원심 분리에 의해 polysom​​es의 분별을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이것은 잘못 번역 (빛 polysom​​es와 관련된)의 mRNA에서 (무거운 polysom​​es과 관련된)을 효율적으로 번역 사이의 차별을 할 수 있습니다. 이 분석에서, 리보솜은 같은 사이클로 헥시 미드 (20)과 세포질 추출물을 원심 분리하여 5-50% 선형 자당 밀도 구배에 분리로 번역 신장 억제제를 사용하여 mRNA의에 고정되어있다. 자당 기울기의 후속 분획들은 바인딩 리보솜의 수에 따라의 mRNA 분리 할 수​​ 있습니다. 각 분획으로부터 추출한 RNA는 결정하기 위하여 사용될 수있다다른 조건 간의 기울기의 mRNA에 걸쳐 분포의 변화, 이에 그라데이션의 위에서 아래로 병진 효율이 증가한다. 노던 블 롯팅 또는 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)를 각 분획의 mRNA의 수준을 결정하는 데 사용된다.

또한, 무거운 polysom​​es (일반적으로 3 개 이상의 변이)를 포함하는 분획을 풀링하고 게놈 전체 polysom​​e 관련 mRNA 수준은 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱을 사용하여 결정된다. 그것은 polysome 관련의 mRNA 수준이 세포질의 mRNA 수준 21에 영향을 미치는 전사와 전사 후 메커니즘에 의해 영향을 번역뿐만 아니라, 있다는 것을 강조하기 위해 가장 중요합니다. 따라서, 관련 mRNA의 polysom​​e에서 게놈 전체 데이터를 사용하여 번역의 차이를 결정하기 때문에 그 번역의 상류이다 유전자 발현 통로의 단계에서 효과를 보정 할 필요가있다기 21. 이러한 보정을 허용하려면, 세포 내 RNA (21)를 결정하는 각 샘플에서 polysome 관련 RNA 게놈 전체의 정상 상태 mRNA 수준과 병렬로 준비가되어 있습니다. 현재, "변환 효율"(TE) 득점 소위 (polysome 관련 mRNA의 데이터 및 세포질 mRNA의 데이터와 로그 비율 즉) 종종의 변환 효율의 세포질 mRNA 수준에서의 변화의 효과를 교정하기 위하여 사용된다 mRNA를 22 없습니다. 그러나 차동 변환을 식별하기 위해 TE 점수를 사용하여 만기가 일반적으로 의사의 상관 관계 (27)에 언급 된 TE 점수의 수학적 속성에 위양성 및 위음성 결과의 상당한 숫자와 연결되어 있습니다. 실제로 여러 실험실에서 데이터 세트의 조사는 의사의 상관 관계가 translatomes 23의 변화를 분석 할 때 피할 수없는 것 같다 것으로 나타났다. 이 차동 TR의 "분석의 개발을하라는 메시지가 앞서 언급 한 단점 (23)로부터 고통을하지 않습니다 anslation "(anota) 알고리즘. anota 분석 동안 회귀 모델은 세포질 RNA 수준의 독립적 인 병진 활동의 측정 값을 도출하기 위해 사용된다. 이러한 조치는 다음 조건과 통계 계산을 비교합니다. 사용자는 통계적 전력을 향상시키고 몇 회 반복 (24)의 연구에서 위양성 결과의 발생을 줄일 수 분산 수축 방법을 적용하는 옵션을 갖는다. 중요한 것은, 그것은 최근 translatome에 교란이 anota에 의하여 촬영 된 것을 증명했지만, TE하지 점수는 프로테옴 (25)의 변화와의 상관 관계. 따라서, 그것은 매우 게놈 전체 규모 번역의 변화를 식별 anota 분석을 적용하는 것이 좋습니다. anota 알고리즘의 이론적 토대가 이전 21,23,26 자세히 설명하는 동안, 여기에 초점을 실제로 적용하는 방법에 있습니다.

세포에서의 mRNA의 번역 활동의 변화를 연구 외에 ve_content ">이 리보솜 분별 프로토콜 분리 및 생화학 적 및 기능적 리보솜과 polysom​​e - 연관된 단백질 복합체를 특성화하는데 사용될 수있다.이 접근법은 성공적으로 식별하기 이전에 전개 된 새로 합성 된 폴리 펩타이드 (27) 및 / 또는 병진기구의 구성 요소의 인산화에 관여의 안정성을 조절 복합체. polysome 분획 법이 응용 프로그램은 또한 간략히 설명 될 것이다.

Protocol

1. 자당 기울기 준비

  1. 60 % 100 ㎖ DDH 2 O.에서 (w / v)의 자당 솔루션을 준비합니다 용액을 분별 단계 (단계 3.5) 중에 튜브의 막힘을 방지하기 위해 0.22 ㎛의 필터로 여과한다.
  2. 200 mM의 HEPES (산도 7.6), 1 M의 KCl, 50 mM의 MgCl2를, 100 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (EDTA 무료), 100 단위 / ㎖의 RNase 억제제 : 배 크로스 그라데이션 버퍼의 5 ML을 준비합니다.
  3. 단계 1.1에서 기술 된 바와 같이 제조 된 60 % 용액을 사용하여, 40 ㎖의 5 % 및 1X 자당 구배 완충액 중 50 % 수 크로스 용액을 만든다.
  4. (총 6 초 원심 튜브)를 레이어드 각 polyallomer 초 원심 분리 관에 반 전체 지점을 표시 그라데이션 메이커에서 제공하는 마커 블록을 사용합니다. 그것은 반 전체 포인트에 도달 할 때까지 그라데이션 메이커가 제공하는 레이어 장치를 사용하여, 5 % 자당 솔루션을 추가합니다. 이어서, INTERF까지 아래로부터 50 % 수크로오스 용액을 쓰두 솔루션 사이의 에이스 반 전체 포인트에 도달합니다. 이 (아래 참조) 높은 재현성을 얻기위한 필수적인으로 그라데이션이 가능한 한 유사한 수 있도록 특별한주의가이 단계에서주의해야한다.
  5. 그라데이션 메이커와 함께 제공 속도 띠 모자와 튜브를 밀봉하고 그라데이션 메이커에 튜브 홀더에 밀봉 된 튜브를 전송합니다.
  6. 선형 5 % ~ 50 % 구배를 얻기 위해 그라데이션 메이커를 실행합니다. 6 선형 그라디언트 높은 기울기 각도로 회전에 의해 몇 분 안에 형성 될 것입니다.
    참고 : 자당 기울기가 6 개월 즉시 사용 또는 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. 분리 및 Polysom​​es의 침전

  1. 세포의 종류에 따라 1 ~ 15 cm 페트리 접시 (~ 15 × 10 6 세포) 용해하기 전에 적어도 하나의 날로 세포를 씨앗. 실험 당일 셀 ~ 80 % 합류해야한다. 참고 : 번역 및 확산 속도가 직접하기 때문에 최적의 포화 상태가 중요합니다8 비례, 따라서 polysomes 적극적으로 증식하는 세포에서 분석되어야한다 (세포의 낮은 포화 상태가 추가 분석을 위해 충분한 자료를 제공하지 않을 수 있습니다 반면, 즉, 번역 속도는 상당히 합류 세포 이상으로 줄어 듭니다). 예를 들어 실험이 번역에 접촉 억제의 효과를 공부에 관심이있는 경우이 규칙의 예외가 될 수있다. 그러나, 세포는이 translatome에 실수로 영향을 미칠 수 있으므로, 너무 오래 합류 조건 이상에서 보관하지 말아야합니다.
    형질 전환이 요구되는 경우에, 시판 키트 대부분 polysom​​e 수준에 영향을주지 않는다. 형질 세포의 날에 80-90% 합류해야하기 때문에, 그것은 ~ 8​​0 %의 합류 세포에게 24 시간 후 형질을 전달하고 세포에서 polysom​​es 48 시간 사후 형질을 분리하는 것이 좋습니다.
  2. 5 37 ° C에서 5 분을위한 성장 배지에서 100 μg / ML의 최종 농도에서 사이클로 헥시 미드와 세포를 품어% CO 2; 100 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드를 포함하는 얼음처럼 차가운 1X PBS 10 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오. 사이클로 헥시 미드함으로써 리보솜 실행 (20)를 방지의 mRNA에 리보솜를 "정지"라고 번역 신장 억제제이다.
  3. 100 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드를 포함하는 얼음처럼 차가운 1X PBS 5ml에 부드럽게 세포를 긁어 및 50 ㎖ 튜브를 수집합니다. 이것은이 단계를 합리적으로 빠르게 오랜 시간 동안 얼음에 세포를두기로 비약적 polysom​​e 제제의 품질을 감소한다 행하는 것이 중요하다.
  4. 4 ℃에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집
  5. 저장성 버퍼 425 μL에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기 [(5 mM 트리스 - 염산 (산도 7.5), 2.5 mM의 MgCl2를 1.5 밀리미터의 KCl과 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (EDTA 무료)], 10 ㎎의 5 μl를 추가 / ML CHX, 1 M DTT의 1 μL, 10 % Trito 25 ㎕를 첨가하여 5 초 동안 RNA 분해 효소 억제제와 소용돌이의 100 단위N X-100 (최종 농도 0.5 %)와 10 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트의 25 μL (최종 농도 0.5 %), 5 초 동안 소용돌이. 중성 세제 조건이 핵 봉투를 방해하지 않고 세포질과 소포체 관련 리보솜을 용해하는 데 사용되는 반면 인해 세포 부종에, 근력 저하 버퍼는, 세포막을 방해합니다.
  6. 7 4 ° C에서 최소 및 새로운 사전 냉장 1.5 ML 튜브에 뜨는 전송 (~ 500 μL) 16,000 XG에 원심 분리기 해물. 분광 광도계를 사용하여 각 시료에 대한 260 nm에서의 OD를 측정하고 세포질 정상 상태의 mRNA 수준을 결정하기 위하여 사용될 것이다 입력으로 파쇄물의 10 %를 유지한다. , 이는 RNAse 무료로 H 2 O의 750 μL에 입력을 희석 750 트리 졸 ㎕의 액체 질소에 플래시 동결을 추가합니다.
  7. 미리 냉장 로터 버킷 자당 그라디언트를 포함 초원 심 분리기 튜브를 전송합니다. 자당 기울기의 상단에서 500 μl를 제거합니다. 그들은 같은 OD (10-2를 포함하도록 해물를 조정용해 버퍼 500 μL의 260 nm에서 0 OD) (단계 2.5 참조) 각 자당 기울기에 그들을로드합니다.
    주 : 이것은 비판적 polysom​​e 제제의 품질을 향상되므로 그것은 즉시 그라디언트에 용 해물을로드하는 것이 중요하다.
  8. 무게와 초 원심 분리하기 전에 각 그라데이션의 균형을.
  9. SW41Ti 로터를 사용하여 4 ° C에서 2 시간 동안 222,228 XG (36,000 RPM)에서 원심 분리기.
    참고 : 자당의 그라디언트를 방해하지 않기 위해, "낮은"브레이크 옵션을 선택해야합니다.

3. Polysom​​e 분별 및 RNA 추출

  1. RNA 분해 효소 ZAP (몇 스프레이)를 포함하는 따뜻한 RNAse가 무료로 물을 청소하여 분획 수집기를 준비합니다. 만 따뜻한 RNAse가없는 물이 단계를 반복합니다. UV 램프를 전환하고 녹색 빛이 나타날 때까지 기다립니다.
  2. 조심스럽게 회에서 튜브를 제거하고 얼음에 배치합니다. 컴퓨터, 펌프, UV 검출기 및 분수 집에 전환합니다. 3 ㎖ / 분 FIL에서 설정 펌프L은 바늘에 도달 할 때까지 쫓는 용액을 60 % (w / v)의 0.02 %를 포함하는 자당 (W / V) 브롬 페놀 블루]와 튜브. 반드시 적어도 하나의 강하가 바늘에서 나오는 볼 수 있도록하고, 기포가 펌프 주사기 또는 튜브에 소개되지 않은 것을 확인.
  3. 분수의 집에 2 ㎖ 튜브를 놓습니다. 분석 프로그램을 실행하고 + / 감도 설정 - 10 백만 전자 볼트. 100 초에 "타​​임베이스"를 설정합니다.
  4. 튜브가 수직 위치에 있는지 확인하는 동안 UV 검출기로 각 초 원심 튜브를 놓습니다. 튜브 홀더 아래의 손잡이를 비틀 바늘과 튜브를 관통.
  5. 1.5 ㎖ / 분에서 펌프를 설정하고 (이것은 각 부분의 ~ 750 μL가 발생합니다) 분수의 집에 30 초에 시간을 설정 분수를 수집합니다. "원격 위치"에 펌프를 넣고, 펌프 및 분획 수집기를 시작하고, 동시에 DAQ 트레이서를 사용하여 기록을 시작. 이 자당 GRA의 상향 이동을 시작합니다의 dient 및 254 nm에서 UV 흡광도의 동시 검출. 즉시 쫓는 솔루션의 첫 번째 드롭으로 튜브를 수집 2 ㎖에 빠진다 수집을 중지.
  6. . CSV 형식으로 추적을 저장하고 UV 흡광도 프로필의 각 부분의 위치를​​ 식별하기 위해 다음과 같이 스프레드 시트 응용 프로그램에서, (한 번 3.7이 완료 단계) :
    1. 254 nm에서 흡광도에 해당하는 값을 포함하는 열을 선택 (채널 0).
    2. 흡광도의 부드러운 라인 산점도를 만듭니다.
    3. 각 분획 (30 초)의 수집 시간에서 5 % -50 % 수 크로스 구배 (~ 12 ㎖)의 체적으로 나눈 300 (값 X 축의 주요 유닛을 설정한다.
  7. 각 부분에 트리 졸 750 μl를 추가하고 플래시는 액체 질소의 분수를 동결.
  8. 제조업체의 지침에 따라 트리 졸 프로토콜을 사용하여 polysom​​e 관련과 (2.6부터) 세포질 RNA를 분리합니다. RNA 수율을 높이기 위해, RNA의 프리 시즌을 진행30 분 또는 -20 ° C 하룻밤 -80 ° C에서 pitation.
    참고 : polysom​​al 분수에서 침전 RNA의 양이 명확하게 표시되지 않을 수 있기 때문에이 캐리어를 추가하는 것이 좋습니다. 트리 졸 프로토콜 동안 RNA 침전 단계 전에 관에 캐리어의 1 μl를 추가합니다.
  9. 분수 (접근 방식은 3.6 기술 사용)> 3 리보솜과 관련된 mRNA의 일치를 결정하고 이러한 분수를 풀. (2.6부터) 풀링 polysom​​e 관련 및 세포질 RNA의 정리 작업을 수행 할 수 RNA 정리 키트를 사용합니다. 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱을 사용하여 게놈 전체의 mRNA 수준을 결정하기 위해 시설에 샘플을 제출하십시오.
    특정의 mRNA의 번역은 RT-qPCR에 의해 모니터링해야하는 경우, 그것은의 cDNA를 합성 (> 3 리보솜 또는 총 RNA를 포함하는 풀링 된 분획) RNA 500 NG를 사용하는 것이 좋습니다.
    주 :> 3 리보솜과 관련된 mRNA를 효율적으로 번역의 mRNA 표현을 새롭게 신더의 80 % 이상을 포함하도록 임의로 설정크기의 폴리펩티드 (28, 29). (1-2) 빛에 해당하는 분수, 중간 (2-3)와 무거운 polysom​​es 포함 (> 3) 따라서 유리할 것이다, 그러나 이들은 (조건에 2 대 4) 2 배에 의해 샘플의 수를 증가하고 실험의 비용. 그것은 미래에 깊은 시퀀싱 및 마이크로 어레이 분석 비용의 감소가, 후자의 방법을 선호한다는 것을 예상된다에도 불구하고, 그것은 유효성 검사를 수행하는 동안, 개인의 mRNA의 분포가 각 부분에서 모니터링하는 것이 좋습니다.

mRNA의 번역 4. 게놈 전체 분석

  1. 설치 R, bioconductor 및 anota 패키지 :
    1. R (R-project.org에서 다운로드)를 설치하고 R-세션을 시작합니다.
      주 : R은 모든 운영 체제에 사용할 수 있습니다 및 anota 그들 모두에서 실행됩니다.
    2. bioconductor 설치 (bioconductor.org). 할 일에 시작됩니다 - R 코드는 Windows에서 R-터미널 (예를 들어, R 콘솔을 통해 해석uble) R 바로 가기를 클릭. Bioconductor는 (R-터미널)에서 입력하여 설치됩니다

      소스 ( "http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite ()
    3. (R-터미널)에서 입력하여 anota의 bioconductor 패키지 (및 anota이 필요 qvalue 패키지)를 설치합니다 :

      소스 ( "http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite (c ( "anota", "qvalue"))
    4. 패키지가 성공적으로 설치하고 (R-터미널)에서 입력하여 anota 설명서를 열 것을 시험 :

      라이브러리 ( "anota")

      비네팅 ( "anota")
    5. 참고 : anota 패키지에 사용되는 모든 기능에 대한 추가 도움말이 anota 웹 페이지 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) 또는 사용하여 하나를 찾을 수 있습니다 예를 들어 R. 내의 도움말 기능은 anotaPerformQc 기능에 대한 도움말을 얻을 수있는 R-TE로 이동rminal와 타입 (anota 패키지가로드 된 경우에만 작동합니다)

      라이브러리 ( "anota") #은 anota 패키지를로드

      ? anotaPerformQc #이 기능에 대한 도움말을 엽니 다
  2. R에 데이터 가져 오기 :
    1. 분석을 위해 발현 데이터를 준비합니다. 데이터는 mRNA 수준을 측정하기 위해 사용되었다 기술에 대하여 (예를 들면 정규화 및 품질 제어) 전처리한다. LOG2 입력 값은 로그 변환되어야 가장 일반적입니다. 모든 polysom​​e 관련 RNA 샘플 및 모든 세포질 RNA 샘플 하나에 대한 데이터를 하나의 테이블을 컴파일합니다. 첫 번째 열은 샘플 당 하나의 데이터 열 다음에 유전자 식별자를 포함해야한다; 첫 번째 행은 샘플의 이름을 포함해야합니다. 그것은 테이블이 동일한 견본 순서와 동일 유전자 순서가있는 것이 중요합니다. "myPolysom​​eData.txt"와 "myCytosolicData.txt"라는 탭으로 구분 된 텍스트 파일로 파일을 저장합니다.
    2. C1, C2, C3, D1, D2, 모두 myCytosolicData.txt 및 myPolysom​​eData.txt 파일 D3 :이 예에서는 두 개의 샘플 클래스는 따라서이 순서에 6​​ 샘플을 생성, 클래스 당 3 회 반복으로 (제어 또는 병) 사용됩니다. 두 개의 샘플 클래스가있을 때 Anota는 조건 당 적어도 3 개의 반복을 필요로합니다. 이러한 독립적 인 생물은 복제해야합니다.
    3. 데이터 입력 파일 (myPolysom​​eData.txt 및 myCytosolicData.txt)를 포함하는 디렉토리를 만듭니다. 이 디렉토리에서 열기 R. 윈도우 / 맥이이 디렉토리에 R-바로 가기를 복사하고이 바로 가기를 사용하여 R을 실행하여 수행 할 수 있습니다 (직접 작업하는 것은 또한 드롭 다운 메뉴를 사용하여 변경할 수 있습니다.)
    4. 새로 만든 디렉토리에 myCode.R라는 파일을 생성하고 텍스트 편집 소프트웨어를 사용하여 엽니 다. 이 파일의 코드를 작성합니다.
    5. R에 데이터를로드하려면 (코드의 각 첨가 한 후 다시 저장이 파일에 기억) myCode.R 파일에 다음 코드를 작성합니다. 다음은 단계별로들입니다코드를 제외한 모든 코드의 TEP 설명도 한 번만 사용 (즉, 아래 참조, 코드를 실행) 처음과 소스 기능을 작성할 수 있습니다 :

      # #이 anota 라이브러리를로드

      라이브러리 (anota)

      # #이 R로 입력 된 데이터를로드

      dataCyto <- as.matrix (read.table ( "myCytosolicData.txt", 헤더 = TRUE, row.names = 1, 9 월 = " 티셔츠"))

      dataPoly <- as.matrix (read.table ( "myPolysom​​eData.txt", 헤더 = TRUE, row.names = 1, 9 월 = " 티셔츠"))
    6. R 단자에 직접 입력하여 R의 코드를 실행합니다 :

      소스 ( "myCode.R")
    7. 데이터를 (R-터미널로)를 입력하여 성공적으로로드되었는지 확인합니다 :
      머리 (dataCyto) #은 dataCyto 테이블 위에 표시됩니다
      머리 (dataPoly)
  3. 차등 번역 유전자의 식별 :
    1. 설명하는 벡터를 생성샘플 카테고리 (벡터 R에있는 개체의 유형입니다). 세 개체가 샘플의 동일한 순서를 가질 수 있도록이 벡터는 myPolysom​​eData.txt 및 myCytosolicData.txt의 샘플 주문을 반영해야한다. 샘플을 비교하는지에 대한 anota을 지시 할 때 벡터가 사용됩니다. myCode.R 파일에 다음을 추가합니다 :

      # # 복제 샘플이 동일한 샘플 클래스가 있습니다

      의 # # # 설명이 벡터 (즉, "C"또는 "D").

      myPhenotypes <- C ( "C", "C", "C", "D", "D", "D")
    2. 데이터 세트의 품질 관리를 실시하고 있습니다. anota 분석을 위해 사용하기 전에 평가해야 질 측정의 수가있다. 이러한 anota 설명서에 자세히 설명되어 있습니다. myCode.R 파일에이 코드를 추가하고 저장 :

      anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)

      anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut)
    3. R-터미널에 입력하여 코드를 실행합니다 :

      소스 ( "myCode.R")

      이 anota 설명서의 지침에 따라 검사 할 수 있습니다 출력 파일의 번호를 생성합니다.
    4. 차등 번역 유전자를 식별합니다. 샘플은 그들이 ( "대조"매개 변수를 사용하여) 사용자가 지정하지 않는 한 ( "myPhenotypes"벡터 예) "phenoVec"매개 변수에 제공 할 이름의 알파벳 순서에 따라 비교됩니다. 내부의 "원본"명령을 사용하여 파일 및 마무리 myCode.R에 다음 코드를 추가 R-터미널 상기 한 바와 같이 :

      anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut)
    5. anotaGetSigGenes 이해하기 도움말을 사용하는 방법 Output가 포맷 및 (R-터미널)에서 입력하여 비교하​​는 샘플 범주를 선택하는 방법을 볼 수 있습니다 :

      ? anotaGetSigGenes
    6. 차동 변환되는 필터와 음모 유전자. anotaPlotSigGenes 함수 내에서 적용 할 수있는 도움을 사용하여 이러한 임계 값의 사용자 정의 조합을 단순화 여러 임계 값이 있습니다. 신뢰성 분석 유전자 선택 minSlope (-0.5), maxSlope (1.5) 및 slopeP (0.01) 설정을 적용합니다.
      참고 : 또한, RVM 23,26,30 거짓 발견 속도 (FDR) (0.15)에 적용되는 설정과는 (LOG2는 [1.5]) 차등 번역 유전자를 식별하는 데 사용할 수있는 변경을 접습니다. 예 : "selDeltaPT"와 같은 다른 필터 ([1.5]은 log2 selDeltaPT 설정 예) 엄격한 필터링하는 데 유용 할 수 있습니다. 그것은 비교 (selCont 인수를 사용하여) 필터링해야하는을 지정할 필요가있다. myCode.R에 다음 줄을 추가하여 설명 설정 적용파일 :

      anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0.5) = 1.5 maxSlope, slopeP = 0.01, maxRvmPAdj = 0.15, minEff = LOG2 (1.5), selDeltaPT = LOG2 (1.5))
    7. 에서 원본 함수를 사용하여 분석을 수행 R-말단 전술 한 바와 같이. 이것은 또한 그래픽 출력을 생성합니다. 이 출력을 검사하는 것은 분석의 성능을 평가하고 설정에 필요한 변경 사항을 식별 할 수있는 좋은 출발점이 될 것입니다.
    8. 출력 테이블을 생성한다. myCode.R 파일에 다음 코드를 추가합니다 :

      write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, 파일 = "MySignificantGenes.txt", 9 월 = " 티셔츠")
    9. R-말단에서 원본 함수를 사용하여 코드를 실행. 결과 테이블의 컬럼은 anotaPlotSigGenes 기능에 대한 도움말에 설명되어 있습니다.

Representative Results

mTOR의 영양소 이용 가능 (19) 글로벌 단백질 합성 속도를 조정하는 셀룰러 네트워크의 주요 노드입니다. mRNA의 번역은 속도 제한 개시 6 단계에서 주로 조절된다. polysomes에 종사하는 리보솜의 비율은 긍정적으로 번역 개시 가격 (28) 상관 관계. mRNA의 번역에 대한 인슐린의 효과를 중재에 mTOR의 신호 전달의 역할을 조사하기 polysom​​e 분별 방법을 적용한 예를 제시한다. 이를 위해, MCF7 인간 유방암 세포를 저 혈청에서 유지하고, 그 다음, 인슐린 단독으로 또는 활성 사이트는 mTOR 억제제 Torin1와 조합 자극. 지속적으로 낮은 혈청에 보관 된 비 자극 세포는 대조군으로. mRNPs, monosome (80S) 및 polysom​​e 분획 polysom​​e 분별 법을 이용하여 분리 하였다. 대조군 세포에 상대적 인슐린 대응 구배 분획의 흡광도의 증가를 유도polysomes에, monosome 분수에서 흡광도의 동반 감소 (그림 1)과 함께. 이러한 연구 결과는 polysom​​es 종사 리보솜의 비율은, 따라서 예상대로, 인슐린 해외 번역 개시 체크를 자극 것을 나타내는, 대조군 세포에 비해 처리 된 인슐린 증가되었음을 보여. Torin1함으로써 mTOR의 신호가 변환기구 (19)에 대한 인슐린의 효과를 매개에서 중요한 역할을한다는 연구 결과를 확증 흡광도 프로파일에서 인슐린의 효과 (도 1)를 반전.

구배 준비 불일치를 피할 수없는 신조에 기초하여, 질문 polysome 분획 방법 (22)을 사용하여 얻은 데이터의 재현성에 대하여 제기되고있다. 경험적으로이 잠재적으로 해로운 문제, 세포질 무거운 polysom​​e 관련 RNA (4 더 리보솜과 관련된 mRNA의)를 테스트하기 위해 격리했다 4 독립적 인 생물은 복제에서 Torin1 (그림 2)와 함께 혼자 인슐린 또는 인슐린으로 치료 MCF7 세포에서. 세포질 및 각 복제에 무거운 polysom​​e 관련 mRNA를 컴포지션 인슐린과 Torin1의 효과는 마이크로 어레이 방식을 사용하여 게놈 전체의 규모에 결정되었다. 주성분 분석 (PCA)이 도포 polysom​​e 분별 방법의 재현성을 결정한다. 이러한 분석은 다른 조건이 아니라 (그림 2)를 분리하면서 각 조건에 속하는 샘플이 밀접하게 두 첫 번째 구성 요소 내에 위치 것으로 나타났다. 이러한 연구 결과는 여기에 설명 된대로 polysom​​e 분별 방법은 재현성과 게놈 전체 수준에서 번역의 양적 및 질적 변화를 연구하는 것이 적절하다는 것을 보여줍니다.

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혈청 기아, 인슐린과는 mTOR는 MCF7 세포에서 해외 환산 시그널링의 효과를 나타낸도 1. Polysomal 프로파일은. MCF7 세포는 16 시간 (0.1 % FBS로 유지) 영양분을 박탈하고 5 nm의 인슐린 (기능) 단독으로 처리했다 4 시간 동안 250 nm의 Torin1 (기능 + Torin1)와 함께. 지속적으로 영양분 (0.1 % FBS)을 박탈했다 처리되지 않은 세포는 대조군으로 사용 하였다. 해당 세포질 추출물 5~50% 자당 기울기에 원심 분리에 의해 침전되었다. 무료 리보솜 아 단위 (40S와 60S), monosomes (80S)과 polysom​​e 분수에있는 리보솜의 번호가 표시됩니다.

그림 2
그림 2. (P)를 사용하여 얻은 게놈 전체 데이터olysome 프로파일 링은 높은 재현성이다. MCF7 세포가. 세포질과 polysome 관련 RNA (> 3 변이가) GeneTitan 배열 (어피 메트릭스)를 사용하여 측정 하였다 4 독립적 인 생물 복제하고 자신의 게놈 전체의 mRNA 수준에서 추출 하였다 그림 1에서와 같이 처리 하였다. PCA는 결과 데이터의 재현성을 평가하기 위해 사용되었다. , RNA의 기원 (C = 세포질, P = polysom​​e 관련) 모든 치료에 대한 처음 두 PCA 성분 (;, Ctrl 키를 = 제어 기능 = 인슐린 T1 = 토린 1) 제시된 및 복제합니다. 동일한 조건 및 RNA의 원점에서 샘플 밀접하게 높은 재현성을 나타내는 위치한다.

Discussion

이 문서는 포유 동물 세포에서 게놈 전체 규모의 번역 활동의 질적 및 양적 변화를 포착하기위한 자체 개발 한 분석 방법으로 다음에 잘 설립 polysom​​e 분별 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜 특별한주의가 성공적으로 완료 1) 휴대 포화 상태에 지불되어야한다 확산 속도와 영양소의 가용성이 mRNA의 번역 활동과의 상관 관계 및 translatome의 구성에 영향을 미칠 수있는 (세포 포화 상태)이 복제하고 실험 조건에서 일관성이 있어야합니다, 2) 급속한 세포 용해 (사이클로 헥시 미드 및 버퍼에있는 RNA 분해 효소 억제제의 존재에도 불​​구하고, 용해가 신속하고 세포 추출물이 바​​로 RNA의 분해와 polysom​​es의 분리를 방지하기 위해 용해 후 자당 기울기에 중첩해야해야한다), 3) 그라데이션 준비 (보장하기 위해 높은 데이터 재현성, 자당 구배 구배 메이커와 SPE를 사용하여 제조되어야)을 처리 할 때 사회적주의를 기울여야합니다.

병진 활성의 변화를 연구 이외에도,이 프로토콜은 리보솜 연관된 단백질 복합체를 분리하고 그들의 생리 기능을 설정하는데 사용될 수있다. 리보솜 - 관련된 단백질 복합체는 그라데이션 분획물로부터 면역 침전 및 웨스턴 블롯 또는 질량 분석법에 의해 분석 될 수있는 반면,이를 위해 수준 및 다양한 리보솜 - 관련 단백질의 인산화 상태, TCA 침전에 의해 결정될 수있다 웨스턴 블 롯팅 하였다. 이 기술의 단점은 속도가 느린 그라데이션 부분 방법은 결합 반응 속도 빠른 연결 / 분리에있는 경우에도 밀접하게 결합 단백질의 분리가 발생할 수 있다는 것입니다. 새로 합성 된 폴리 펩타이드에 관련된 요인은 전형적인 예입니다. 리보솜을 형성 신흥 새로 합성 된 폴리 펩타이드는 3과 화학 가교제를 사용하여 리보솜과 관련된 단백질 복합체에 고정 할 수 있습니다-3,3 - 디티 오비스 [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. 이 방법은 공개가 활성화 C 키나제 1 (RACK1) / C 월 N-말단 키나제 (JNK) / 진핵 번역 신장 요인에 대한 수용체 1A2 (eEF1A2) 복잡한 27 스트레스에 반응 새로 합성 된 폴리 펩타이드의 분해를 조절한다. 또한, 유사한 방법론은 단백질 키나제 C BII (PKCbII이)가 새로 합성 된 AKT의 폴리 펩타이드를 인산화하고 조절하는 리보솜에서 발생 RACK1 (32)와 mTOR의 단지 2 (mTORC2)의 활성화에 의해 리보솜에 채용되는 것을 보여주는 연구에 사용 된 자신의 안정성 33, 34.

anota 분석 하였다 polysome 분획 법의 주요 제한은 : 세포의 상대적으로 높은 수 (~ 15 × 106 세포)를위한 1) 요구, 2) 관련의 mRNA 분자의 리보솜의 지역화에 관한 위치 정보의 부족, 및 세 세포 및 분자 헤테로 관련) 문제정상 및 종양 조직의 geneity. 필요한 세포 수와 관련된 문제는 양의 높은 풍부 세포에 의한 것 (예를 들어, HeLa 세포) 35로 제한하고 세포의 monosomes (80S)에 해당하는 흡수 스펙트럼의 피크를 정렬하여 해결할 수 있습니다. 이러한 인체 조직과 같은 복잡한 시스템에서 얻은 유전자 발현의 변동 해석에 조직의 이질성 교란 효과에 관한 문제를 설명하는 반면, 리보솜 프로파일 기술 (아래 참조), 소정의 mRNA 분자의 리보솜의 정확한 위치를 결정하기 위하여 사용될 수있다 부추와 스토리 (36)에 의해 책에서 자세히 설명합니다.

리보솜 보호 조각 (RPFS가) RNAse가 I 처리에 의해 생성과 깊은 시퀀싱 (22)에 의해 분석되는 것을 특징으로 최근 기술을 프로파일 링 소설 리보솜가 개발되었다. 이 기술을함으로써 종래 unpr 제공 단일 염기 해상도 리보솜 위치의 판정을 허용리보솜 생물학에 ecedented 통찰력. 예를 들어, 리보솜 프로파일은 관련 mRNA의 분자 또는 요소의 식별에 리보솜 밀도의 측정에 사용 될 수있는 대안 개시 사이트, 비 8월 코돈에서 개시하고 uORFs 같은 조절 요소 등의 영향 번역 개시 체크.보기 그러나 정확하게 mRNA의 번역 효율을 추정하는 리보솜 프로파일의 기능을 제한하는 몇 가지 방법 론적 한계가 있습니다. 다음은 임의의 분열과 RNAse가 I 소화에 의해 도입 된 독립적 인 편견을 포함, 번역 억제제 (예 : emetine 및 사이클로 헥시 미드 등의 예를 들어 신장 억제제는 번역 개시 사이트에서 리보솜 축적을 유도 할 가능성이있다)에 의해 도입 된 바이어스는 위양성 및 위음성 결과 많은 수의 관련 TE 점수뿐만 아니라 예측에서의 부정확성으로는 단백질 코딩 mRNA가 37에서 시작 읽습니다. 아마도 가장 중요한 반면리보솜 프로파일은 특정의 mRNA 분자에 리보솜의 위치를​​ 직접 확인 할 수 있습니다, 특정의 mRNA와 관련된 변이의 수는 간접적으로 전체 (무작위 조각의 mRNA에서 관찰 그 이상 RPFS (리보솜 관련 mRNA를) 읽고의 주파수를 정상화 추정된다 의 mRNA). 예를 들어, 네 개의 "B"의 mRNA 분자 (BA, 비비, BC와 BD)가 위치 1, 2, 3, 4, 리보솜 프로파일 링 기술의 고유의 결점에 네 변이가 차지하는 간단한 설정에서 허용되지 4 리보솜이 위치 1에 바의 mRNA 만 연결 시나리오, 2, 3, 4, 바, 비비, BC와 BD의 mRNA가 위치 1, 2에 하나의 리보솜에 의해 각각 점유 시나리오를 구별 각각 3, 4,. 반면, polysome 분별하는 동안, polysome 무결성하여 리보솜의 정의 수 (그림 1)과 관련된의 mRNA 풀의 분리를 허용 보존됩니다. 이 수입polysom​​e 분별과 리보솜 프로파일 사이에 개미 차이점은 전자의 방법은 직접 mRNP에서의 mRNA를 비교하는 데 사용할 수있는 반면, 가볍고 무거운 polysom​​e 분수, 후자의 방법은 가능성의 mRNA에 의해 발생하는 translatome의 변화를 포착 할 수 없게됩니다 것을 제안하는 전환에서 무거운 polysom​​es에 mRNP 분수에서 이동하는 사람들의 기여를 과대 평가하면서, 무거운 polysom​​es 빛. 상기 방법 사이의 이러한 불일치의 생물학적 의미가 같은 eIF4E를 구분하는 것과 같은의 mRNA의 부분 집합의 번역 활성화를 보여주는 데이터의 큰 몸으로 강조되고, 같은 것과 다른, 숨겨 무거운 polysom​​es 빛에서 전환, 반면에 5'TOP 요소는 바로 리보솜이없는 mRNA의 6 풀에서 무거운 polysomes을 모집합니다. 흥미롭게도, mTOR의 경로는 부수적으로 "의 eIF4E 성"과 5'TOP의 mRNA 1의 번역을 조절하는 것으로 알려져있다1. 따라서, 상술된다 방법론 차이 translatome에 mTOR의 억제의 효과를 평가하기 위해 38, 3924 polysome 분획 프로파일 리보솜을 사용 연구 사이 결론 명백한 불일치를 설명 할 수있다.

결론적으로, polysom​​e 분별과 리보솜 프로파일은 주로 각각의 mRNA에 mRNA와 리보솜의 위치와 관련된 변이의 수에 대한 정보를 제공하는 보완적인 방법이다. 중요한 것은, 이러한 방법의 단점과 장점에도 불구하고, 그것은 두 절차에 의해 얻어진 게놈 전체의 데이터를 적절하게 분석 기능 및 생화학 적 유효성을 검사하는 것이 중요 남아있다.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 또한 CIHR 젊은 연구자 상을받는 사람입니다 IT에 대한 건강 연구 보조금의 캐나다 연구소 (CIHR의 MOP-115195)와 FRQ-S에 의해 지원되었다; 와 스웨덴 연구위원회 및 스웨덴 암 협회는 OL하기

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Biobasic HB0264
MgCl2 Sigma M8266
KCl VWR CABDH4532
Dithiothreitol (DTT) Biobasic DB0058
Tris Biobasic TB0196
Glycoblue Ambion AM9515 RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate  Sigma D6750
Triton X-100 Sigma X100
Cycloheximide Sigma C1988
Protease inhibitor cocktail  Roche 04693132001 Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor  Promega N2515
0.45 µm Filter System 150 ml Corning 431155
Sucrose Sigma S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen 74204 RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331372
SW41Ti Rotor Package with accessories Beckman Coulter 331336
Optima L100 XP ultra centrifuge Beckman Coulter DS-9340A
ISCO fraction collector  Brandel FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder Brandel UA-6 UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump Brandel BR-A86-5
UA-6 Detector Cable Brandel 60-1020-211
FC-176 Communication Cable Brandel FCC-176
Gradient Master Base Unit Biocomp 108-1 Gradient Maker
Gradient Forming Attachments Biocomp 105-914A-1R Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device MicroDAQ USB-1208FS Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software MicroDAQ TracerDAQ Pro Analysis software (Download only)
10x buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl 
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text

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References

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