שני פוטונים
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Published 5/12/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בקליפת המוח של היונקים, תאי עצב יוצרים רשתות מאוד מסובכות ולהחליף מידע בסינפסות. שינויים בחוזק סינפטי, כמו גם תוספת / הסרה של סינפסות, מתרחשים באופן חוויה תלויה, המספקים את היסוד המבני של פלסטיות עצבית. כרכיבי postsynaptic של סינפסות המעוררות ביותר בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים נחשבים פרוקסי טוב של סינפסות. יתרונות לוקחים גנטיקה עכבר וטכניקות תיוג פלורסנט, נוירונים בודדים והמבנים הסינפטי שלהם יכולים להיות מתויגים במוח שלם. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה transcranial באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים לעקוב קוצים שכותרתו fluorescently postsynaptic הדנדריטים לאורך זמן in vivo. פרוטוקול זה משתמש בהכנה דלילה, גולגולת, אשר משומרת על הגולגולת שלמה ותמנע תופעות דלקתיות הנגרמות על ידי חשיפה של קרומי המוח וקליפת המוח. לכן, ניתן לרכוש תמונות מייד לאחר surgery מתבצע. הליך הניסוי ניתן לבצע שוב ושוב על פני מרווחי זמן שונים, החל משעות לשנים. היישום של הכנה זו גם ניתן להרחיב כדי לחקור אזורים שונים בקליפת המוח ושכבות, כמו גם סוגי תאים אחרים, בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

Introduction

היונקים הקליפה משתתפת בתפקודי מוח רבים, משליטת תפיסה והתנועה חושית לעיבוד מידע מופשט וקוגניציה. פונקציות שונות בקליפת המוח לבנות על מעגלים עצביים שונים, אשר מורכבים סוגים שונים של נוירונים תקשורת והחלפת מידע בסינפסות בודדות של. המבנה והתפקוד של סינפסות באופן עקבי להיות שונה בתגובה לחוויות ופתולוגיות. במוח הבוגר, פלסטיות הסינפטית לובשת צורה של שני שינויי כוח ובנוסף / הסרה של סינפסות, ממלאת תפקידים חשובים ביצירת ותחזוקה של מעגלים עצביים פונקציונליים. קוצים הדנדריטים הם רכיבי postsynaptic של רוב סינפסות מעוררות במוח של היונקים. התחלופה המתמדת ושינויים מורפולוגיים של קוצים הם האמינו לשמש אינדיקטור טוב של שינויים בקשרים סינפטיים 1-7.

מיקרו לייזר סריקת שני פוטוניםscopy מציע חדירה עמוקה דרך, הכנות אטומות עבות וphototoxicity הנמוך, מה שהופך אותו מתאים להדמיה לחיות במוח שלם 8. בשילוב עם תיוג פלורסנט, שני פוטונים הדמיה מספקת כלי רב עוצמה כדי להציץ לתוך המוח החי ופעל לארגון מחדש מבני בסינפסות בודדות עם גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. שיטות שונות שימשו להכנת עכברי הדמיה לחיות 9-13. כאן, אנו מתארים הכנה דלילה, גולגולת של in vivo שני פוטונים הדמיה כדי לחקור את הפלסטיות המבנית של קוצים הדנדריטים postsynaptic בקליפת מוח העכבר. שימוש בגישה זו, המחקרים האחרונים שלנו תיארו תמונה דינמית של שינויים בעמוד השדרה הדנדריטים בתגובה למיומנות מוטורית לומדת עם זמינות גוברת של בעלי חיים מהונדסים עם תת נוירונים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, יכולים להיות מיושמים גם נהלים דומים שתוארו כאן לחקירהסוגי te תאים אחרים ואזורים בקליפת המוח, בשילוב עם מניפולציות אחרות, כמו גם בשימוש במודלים של מחלת 16-23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור צריך להיות ממוסדים הביתה לפני תחילתו של הניתוח ומחקר הדמיה. ניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות מאוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז מוסדי הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. ניתוח

  1. החיטוי כל מכשירי הניתוח ולעקר את סביבת העבודה עם אלכוהול 70% ביסודיות לפני הניתוח.
  2. להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal הזרקה (IP) של פתרון KX הרדמה (200 מ"ג / קטמין קילוגרם ו20 מ"ג / קילוגרם xylazine) בהתאם למשקל גופו של עכבר הערה:. מינון KX יכול להיות מותאם על פי הזן, הגיל ומצב בריאות של העכברים. התייעצות וטרינרית כדי לקבוע את המינון האופטימלי מומלצת גם.
  3. לבצע בדיקת הבוהן קמצוץ מעת לעת על ידי לחיצה על בוהן של העכבר ובדיקת תגובה רפלקסיבית לנטר את מצב ההרדמה.ודא שהעכבר הוא בהרדמה מלאה לפני תחילת ניתוח הערה:. במהלך פגישות הדמיה ממושכות, לבדוק את מצב ההרדמה של העכבר מעת לעת, לנהל KX נוסף במידת צורך.
  4. מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח.
  5. לגלח את הראש של העכבר באמצעות סכין גילוח כדי לחשוף את הקרקפת.
  6. לחטא את האזור המגולח ידי מנגב את העור עם לסירוגין רפידות אלכוהול ובטאדין. הסר את כל גזירות שיער שיורית.
  7. בעדינות להחיל משחה העין כדי לשמן את שני העיניים, ולכן מניעת ניזק בלתי הפיך הנגרם על ידי התייבשות במהלך הניסוי.
  8. לעשות חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת, ולהעביר את העור רוחבי לכיוון הקצוות של הגולגולת.
  9. הסר את רקמת החיבור הצמודה לגולגולת.

2. דליל, גולגולת הכנה

  1. זהה את אזור ההדמיה המבוסס על ster. קואורדינטות eotaxic הערה: נסה להימנע מכלי דם גדולים, שחדירה לחסום אור ולטשטש את מבני הדמיה. בכלי דם הוא ציין הטוב ביותר כאשר הגולגולת לחה עם תמיסת מלח סטרילית.
  2. השתמש בתרגיל מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל אזור מעגלי של גולגולת (0.5-1.0 מ"מ קוטר). העבר את התרגיל המקביל למשטח הגולגולת, ולא מחזיק את זה נגד הגולגולת ולחיצה. מקדחה עד ששתי השכבה החיצונית הקומפקטית עצם ושכבת עצם הספוגית האמצע יוסרו הערה:. כדי למנוע נזק שנגרם על ידי התחממות יתר, להימנע ממגע ממושך בין המקדח והגולגולת.
  3. המשך דילול שכבת העצם הקומפקטי הפנימית עם להב microsurgical במרכז האזור-דליל התרגיל. החזק את להב microsurgical בזווית של כ 45 ° כדי לגרד את הגולגולת בלי לחיצה על הגולגולת באופן שווה עד דליל אזור קטן (200-300 בקוטר מיקרומטר) בעובי של משוערמיקרומטר ly 20-30 מתקבל. בשל אוטומטי הקרינה של הגולגולת, העובי ניתן למדוד על ידי סריקה את המרחק בין משטח העליון ותחתון של הגולגולת מתחת לשני פוטונים מיקרוסקופ הערה:. למרות עובי גולגולת של פחות מ 20 מיקרומטר מספק איכות הדמיה טובה, זה לא מומלץ, כי זה הופך את תהליך ההרזיה בהפעלות מחדש הדמיה הבאות קשה. כדי להימנע מעל דליל, העובי של הגולגולת צריך להיבדק מעת לעת במהלך הניתוח (ראה דיון).

3. קיבוע

  1. מוציא בזהירות את עצם פסולת.
  2. מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate בכל קצה של פתיחת מרכז צלחת ראש סטרילית, אשר כבר autoclaved (ראה איור 1). החזק את הצלחת בראש בחוזקה נגד הגולגולת עם האזור דליל הממוקם במרכזה של פתיחת הערה:. אם הדבק מזהם את r דלילegion במקרה, הסר אותה בזהירות עם להב microsurgical.
  3. משוך בעדינות את העור מן הצדדים של הגולגולת לקצוות של פתיחת מרכז צלחת הראש.
  4. המתן כ10 דקות עד שצלחת הראש מצורפת גם לגולגולת.
  5. מניחים את הצלחת על ראש שני בלוקים לרוחב של הצלחת החזקה ולאחר מכן הדקתי את הברגים על הקצוות של צלחת הראש כדי לשתק את העכבר על צלחת ההחזקה (ראה איור 1) הערה:. ודא שאין עור או שפם בין צלחת הראש והלוקים לפני הידוק הברגים. הכנה משותקת טובה צריכה להראות שום תנועה הנצפית של הגולגולת מתחת למיקרוסקופ לנתח כאשר החלק האחורי של בעל החיים הוא טפח בעדינות.
  6. . יש לשטוף את הגולגולת חשופה עם מי מלח כדי להסיר את דבק unpolymerized הערה: חשוב כדי להסיר כל דבק שנותר, כדבק unpolymerized מטשטש תמונות ונזקים מיקרוסקופ מטרות <./ Li>

4. הדמיה

  1. קח את תמונה של כלי הדם של הגולגולת חשופה עם האזור דליל כמו מפה 1, המשמש למיקום מחדש של האזור צילם בפגישות הדמיה הבאות (ראה איור 2).
  2. מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ההדמיה. אתר את האזור דליל תחת מטרת מיזוג 10X באמצעות epifluorescence ולהזיז את האזור הדק ביותר למרכז התצוגה.
  3. הוסף טיפה של תמיסת מלח בחלק העליון של הגולגולת ולעבור למטרת 60x, אשר כבר שטפה עם מים סטריליים. בחר אזור בו קוצים הדנדריטים בודדים בבירור הם דמיינו לאורך הדנדריטים. לזהות ולתייג את האזור המקביל ב -1 במפה על ידי השוואת כלי דם בין תצוגת epifluorescent והתמונה בכלי הדם.
  4. מנגינת הלייזר באורך גל שני פוטונים פי fluorophores. לדוגמא, 920 ננומטר לYFP; 890 ננומטר של ה-GFP; 1,000 ננומטר לDsRed ו24 tdTomato.
  5. לרכוש ערימות תמונה עם 2צעדי מיקרומטר לאורך ציר z באמצעות אובייקטיבי 60x. ערימת תמונה זו משתרעת על שטח של כ 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), והוא משמש כמפה 2 להעתקה במהלך פגישות הדמיה שלאחר מכן (ראה איור 2).
  6. לרכוש תשע ערימות תמונה בתוך מפה 2 שימוש בזום דיגיטלי 3X. כל ערימת תמונה משתרעת על שטח משוער של 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), עם 0.7 מיקרומטר צעדים לאורך ציר Z-הערה:. עוצמת הלייזר צריכה להיות מתחת 40 mW כאשר נמדדו בדגימות כדי למזער phototoxicity.

5. שחזור

  1. בעקבות הדמיה, בעדינות לנתק את הצלחת בראש מהגולגולת.
  2. לנקות ביסודיות את הגולגולת ואת העור כדי להסיר את כל הדבק שנותר הערה:. כל דבק שנותר על העור יגרום לגירויים ולהאט את החלמת עור בזמן שכל דבק שנותר בגולגולת יגרום לשחיקה של הגולגולת וngiogenesis בשכבת העצם גדלה לאחרונה, מה שהופך את ההעתקה הבאה ומחדש הדמיה קשה.
  3. יש לשטוף את הגולגולת ואת העור עם מספר פעמים מלוחה.
  4. תפר את הקרקפת עם תפר כירורגי סטרילי.
  5. שמור את החיה על כרית חימום בכלוב נפרד. לנהל משכך כאבים עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם) תת עורי כדי להקל על כאב שלאחר ניתוח. להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית לאחר החלמה מלאה. לפקח על בעלי החיים בשיתוף פעולה הדוק (לבדוק לפחות פעם ביום) עד שהחתך נרפא ותפרים יוסרו. להזריק הבא של משכך כאבים עצירות במידת הצורך.

6. Reimaging

  1. חזור על שלבי 1.1-1.8.
  2. חזור על שלבי 3.1-3.6
  3. אתר אזור צילם בעבר על ידי השוואת הדפוס בכלי הדם למפת 1 ודפוס סניף הדנדריטים למפת 2.
  4. אם reimaging מתבצע בתוך 1 שבוע, חזור על שלב 2.3 כדי להסיר את השכבה דקה של עצם גדל עתה על גבי מחדש דלילגיון באמצעות להב microsurgical. אם reimaging מבוצע לאחר שבוע יותר מ 1, חזור על שלבי שני 2.2 ו2.3 הערה:. שכבת העצם גדלה חדש מורכבת ממבנה מרוכז פחות בהשוואה לשכבה המקורית הקומפקטית העצם, מה שמוביל לאיכות תמונה מופחתת. לכן, כדי לרכוש את אותה האיכות, יש צורך לדלל את הגולגולת מעט יותר מפגישת ההדמיה הקודמת.
  5. להתאים את המיקום ואת הכיוון כדי להשיג ערימות תמונה התואמות נלקחו בעבר ערימות תמונה מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים.
  6. לרכוש תמונות כמו בשלב 4.6.
  7. חזור על שלבי 5.1-5.5 לאחר הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעכברי שורת YFP-H 25, חלבון פלואורסצנטי צהוב מבטא בקבוצת משנה של נוירונים פירמידליים בשכבת V, אשר פרויקט דנדריטים קודקודם לשכבות השטחיות בקליפת המוח. דרך ההכנה דלילה, הגולגולת, מגזרים הדנדריטים שכותרתו fluorescently יכולים להיות צילמו שוב ושוב מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים על מרווחי הדמיה שונים, הנעים בין שעות לחודשים. כאן אנו מראים דוגמא להדמיה של אותו דנדריטים מעל 8 ימים בקליפת המוח המוטורי של עכבר ישן 1 בחודש, שבו עמוד השדרה פרט, כמו גם filopodia ניתן דמיינו לאורך דנדריט בבירור ארבע פעמים. בדרך כלל, את העומק של ערימות תמונה הוא כ 100-200 מיקרומטר משטח pial. ניתן לבצע ניתוחים שונים המבוססים על התמונות האלה. לדוגמא, היווצרות עמוד השדרה, החיסול והתחלופה ניתן לכמת על ידי השוואת תמונות ממפגשים שונים. צפיפות עמוד השדרה יכולה להיות מחושבת על ידי חלוקת מספר הקוצים באורך של dendritקטע ic. שינויים של תנועתיות עמוד השדרה ומורפולוגיה גם ניתן לנתח.

איור 1
איור 1. צלחות מחוייט קיבוע של הכנה דלילה, גולגולת לשני פוטונים בתחום ההדמיה vivo. () תצלום של צלחת הראש, אשר עשויה משניים או שלושה סכיני גילוח דבוקים יחד, עם קצוות חדים המכוסים בקלטות. (ב) תצלום של צלחת האחזקה, אשר מורכבת מצלחת 1 נירוסטה, 2 בלוקים מפלדה אל חלד, 2 ברגים, ו2 מפרידי.

איור 2
איור 2. הדמיה שני פוטונים Transcranial דרך הכנה דלילה, גולגולת בקליפת המוח המוטורית העכבר, בתמונות vivo נרכשו. (ב) היטל מרבי נמוכה ההגדלה של סניפים הדנדריטים בקליפת המוח המוטורית של עכבר ישן 1 חודש (מפה 2). (C) תמונות חוזרות ונשנות של אותו קטע הדנדריטים לחשוף קוצים שהוקמו זה עתה (ראשי חץ), קוצים בוטלו (חיצים), וfilopodia (כוכבים) ביום 0, 2, 4, ו -8. הלוח השמאלי הוא תצוגה גבוהה יותר ההגדלה של המגזר הדנדריטים מוצג באזור התאגרף ב( ב '). סולם ברים: 500 מיקרומטר (), 20 מיקרומטר (ב '), ו2 מיקרומטר (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשיג הכנה דלילה, גולגולת מוצלחת, כמה צעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. 1) העובי של הגולגולת. יש עצם גולגולת מבנה כריך, עם שתי שכבות של עצם קומפקטי בצפיפות גבוהה ושכבה אמצעית של עצם ספוגי בצפיפות נמוכה. בעוד תרגיל מיקרו במהירות גבוהה הוא מתאים להסרת השכבות החיצוניות של עצם קומפקטי ועצם ספוגי, להב microsurgical הוא אידיאלי לדילול השכבה הפנימית של עצם קומפקטי. כעובי וקשיחות של עליות הגולגולת במהלך פיתוח, הדמיה של עכברים בוגרים דורשת עצם יותר שיש להסירו כדי להשיג תמונות באיכות טובה. האזור דליל מציג מראה שקוף מוצק ומספק איכות הדמיה טובה כאשר העובי של הגולגולת הוא כ 20-30 מיקרומטר. עובי הגולגולת יש לבדוק מעת לעת במהלך תהליך הדילול כמו שעושה מעל לדילול תהליך הדילול במפגשי reimaging שלאחר מכן קשה. 2) הגודל של האזור דליל.חשוב לקבוע תצורה דלילה, גולגולת יציבה, שבו חלל כמו קונוס-מושגת. הארכיטקטורה של האזור דליל בגודל נכון מונעת גרימת נזק לקליפת המוח ומסייעת לדילול בהפעלות מחדש הדמיה הבאות. מומלץ להפוך את האזור התחתון (כ 200-300 מיקרומטר קוטר) של האזור דליל יותר קטן מהפתח העליון (כ 0.5-1.0 מ"מ בקוטר). 3) היציבות של התמונות. הכנה משותקת היטב מסייעת לשפר את איכות תמונה על ידי הקטנת חפצי תנועה המושרית בדרכי הנשימה. זה חשוב לשמור את הגולגולת יבשה ונטול רקמת חיבור ועצם פסולת לפני צלחת הראש מחוברת לגולגולת. דבק נוסף יכול להיות מיושם גם כדי למלא את הפערים שנותרו בין צלחת הראש והגולגולת. בנוסף, מיקוד באזור מכלי דם גדול גם ממזער את התנועות הנגרמות על ידי שאיבת דם.

חקירה של השינויים בחזייהבחי חיות עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים דורש דור של חלון אופטי. בנוסף להכנה דלילה, גולגולת, יכולים גם להיות דמיינו מבנים שכותרתו fluorescently ידי הסרת הגולגולת והחלפתו בכיסוי זכוכית (בדרך כלל 3-5 מ"מ בקוטר) המספקת חלון ברור הדמיה 10, 13. בעוד שני דליל, גולגולת ופרוטוקולי הדמיה פתוחה גולגולת מיושמות באופן נרחב במחקרי הדמיה vivo, לכל שיטה יש יתרונות משלה והוא מתאים לעיצובים ניסיוניים שונים. לדוגמא, ההכנה הפתוחה הגולגולת היא שימושית עבור מחקרים שיחקרו שטחים גדולים יחסית במוח (למשל, בקוטר 5 מ"מ) ודורשים פגישות הדמיה רבות עם מרווחי זמן קצרים (כלומר, ימים). ברגע שהחלון גולגולתי הוא מושתל בהצלחה, אין צורך בניתוח נוסף. עם זאת, התקופה שלאחר ניתוח (בדרך כלל כ 1 חודש) נדרש לפני ההדמיה הראשונהפגישה כדי לשפר תגובות דלקתיות פוטנציאליות הנגרמות על ידי ניתוח. Re-ההדמיה הופכת לבלתי אפשרית כאשר החלון גולגולתי חסום על ידי צמיחה מחודשת של העצם ו / או עיבוי של קרומי המוח. לעומת זאת, בעלי חיים עם הכנה דלילה, גולגולת יכולים להיות צילמו מייד לאחר הניתוח הראשוני, מה שהופך אותו מתאים יותר להדמיה כרונית של בעלי חיים צעירים יותר (לדוגמא, 2 שבועות). זה מתאים לחקירה עם מרווחים ארוכי הדמיה (כלומר חודשים עד שנים), כעיבוי לצמיחה מחודשת עצם והדורה הוא לא בעייתי. עם זאת, מחדש דליל של הגולגולת נדרש בדרך כלל עבור הפעלות מחדש הדמיה הבאות (מרווחי יום גם עם 2) בשל צמיחה מחודשת העצם. יתר על כן, שכבת העצם גדלה חדש מורכב ממבנה מרוכז פחות בהשוואה לעצם הקומפקטי המקורי, מקטין מאוד את השקיפות של האזור דליל, הגולגולת. לכן, כדי לרכוש את אותה האיכות של תמונות, יש צורך להסיר את שכבת העצם גדלה חדש לחלוטין. וכאלהttempts בדרך כלל להוביל לעובי הסופי של הגולגולת בהדמיה הבאה דקה יותר מההכנה הקודמת. מאז עובי הגולגולת היה מוכן 20-30 מיקרומטר בפגישה ההדמיה הראשונית, משאיר מקום מוגבל מחדש דליל, הפעמים ההדמיה הכוללת של הכנה דלילה, גולגולת היא בדרך כלל פחות מ -5 פעמים. לאחרונה, גישה ניסויית חדשה בשם מלוטש וחיזק דלילה, גולגולת (יציאות) פותחה כדי לשלב את שני ההכנות דלילים, ופתוחה גולגולת 11, 26, 27.

עד כה, רוב in vivo הדמיה בקליפת המוח שבוצע באמצעות קווי עכבר מהונדסים להביע EGFP או YFP תחת אמרגן Thy1 הספציפי עצבי. עכברים מהונדסים אלה מבטאים חלבוני ניאון בדלילות בקבוצת משנה, אבל אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב בקליפת המוח 25. מאז קווים רבים של ראיות מצביעים על כך שפלסטיות מבנית חוויה תלויה קורה בSeleסוגי תאי ctive של מעגלים מוגדרים היטב, חשוב לתייג ותמונה בצורה תאים מסוג מסוימת. עד כה, גישות רבות יושמו כדי להשיג מטרה זו. לדוגמא, נוירונים פירמידליים בשכבות בקליפת המוח שונות יכולים להיות ממוקדים על ידי ביצוע ב electroporation ברחם בשלבים מוגדרים עובריים 28, 29. כמו כן, זריקה של וקטורים ויראליים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי יכולה לשמש גם לתייג תאים באזורי מוח שונים 30. בנוסף, קווים רבים של עכברים הטרנסגניים כבר נוצרו לנהוג הביטוי של recombinase Cre תחת יזמים סוג תא מסוימים ביום 31 ב, 32. הזרקה של וקטורים ויראליים כגון וירוס adeno הקשורים נושא גן כתב הניאון הבא קודון עצירת floxed לעכברים אלה מציעה את האפשרות למקד ברמה מסוימת של תאי עצב באזור הוגבלה 33. על ידי שילוב של התיוג החדש אלה מתקרב עם דליל, שלנוהכנת קול, שינויים בקשרים סינפטיים של נוירונים בקליפת המוח יכול להיחקר על ידי שני פוטונים בתחום ההדמיה vivo בסוג והתא / או צורת מעגל ספציפי.

עם הזמינות הגוברת של בעלי חיים מהונדסים עם יכולים להיות מיושמים גם אוכלוסיות תאים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, נהלים דומים שתוארו כאן כדי לחקור סוגי תאים אחרים (תאי גליה) וכלי דם במוח החי. בשילוב עם מניפולציות התנהגותיות ומודלי מחלה, שני פוטונים בתחום ההדמיה vivo ירחיב במידה רבה את ההבנות של המנגנונים המולקולריים, תאיים, ואת המעגל שבבסיס תפקודי מוח שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לג'יימס Perna להמחשה הגרפית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש לYZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats