Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi

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Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

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Abstract

Gli spermatozoi sono abbastanza unico tra i tipi di cellule. Sebbene prodotta nel testicolo, sia la trascrizione del gene nucleare e la traduzione sono spenti una volta la cella rotonda pre-cursore comincia ad allungarsi e differenziarsi in ciò che è morfologicamente riconosciuto come uno spermatozoo. Tuttavia, lo spermatozoo è molto immaturo, non avendo capacità di motilità o riconoscimento uovo. Entrambi questi eventi si verificano una volta il transito spermatozoi un organo secondario noto come epididimo. Durante il passaggio ~ 12 giorni che ci vuole per una cella di sperma di passare attraverso l'epididimo, modificazioni post-traduzionali delle proteine ​​esistenti svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione della cellula. Un aspetto importante di questa è fosforilazione proteica. Al fine di caratterizzare gli eventi di fosforilazione che si svolgeranno durante la maturazione degli spermatozoi, devono essere stabiliti due popolazioni di cellule di sperma puri e pre-frazionamento di fosfopeptidi. Utilizzando tecniche di lavaggio indietro, un metodo per l'isolamento di puro spermatozoi of alta qualità e la resa dei epididimi distali o caudale è delineato. Sono spiegati i passaggi per solubilizzazione, la digestione, e pre-frazionamento di fosfopeptidi spermatozoi attraverso TiO2 cromatografia di affinità. Una volta isolato, fosfopeptidi possono essere iniettati in MS per identificare entrambi gli eventi di fosforilazione di proteine ​​su specifici aminoacidi e quantificare i livelli di fosforilazione che si svolgono durante i processi di maturazione degli spermatozoi.

Introduction

Uscito dal testicolo, spermatozoi sono molto differenziati ancora notevolmente, queste cellule sono immature 1,2. Come tali, non hanno completa funzionalità, tra cui la possibilità di nuotare e si legano ad un ovocita 3. Anche se è necessaria ulteriore maturazione della cellula sperma, questo non può avvenire tramite percorsi canonici, poiché in questa fase del loro processo di differenziazione cellulare, sono incapaci di trascrizione genica e in seguito biosintesi delle proteine ​​4. È conferita la competenza biologica su spermatozoi che lasciano testicolo ed entrano una parte del sistema riproduttivo maschile noto come epididimo 5. L'epididimo è una stretta spirale, tubo altamente differenziato che collega i condotti efferenti (del testicolo) per le deferenti ed è presente in tutti i mammiferi maschi 6. Gli spermatozoi progressivamente acquisire il loro potenziale di concimazione durante la discesa epididimale, basandosi sull'ambiente luminale continua evoluzione che è created da parte delle cellule epiteliali dell'epididimo locali 7. Le varie attività secretoria e ri-assorbenti presenti nell'atto epididymal milieu di modificare lo sperma in sé, cambiando il suo proteine, carboidrati e lipidi composizione 6. L'importanza dell'epididimo, in particolare la regione iniziale 'caput' di questa struttura è stata esemplificata utilizzando tecniche chirurgiche legatura 8. Gli spermatozoi conservati all'interno del testicolo da efferente condotto legatura sono completamente privo di qualsiasi capacità di fecondare l'ovocita 9-11.

Oltre all'ambiente epididimale, trasduzione del segnale all'interno dell'opera spermatozoi al post-traslazione modificare il complemento spermatozoo esistente. Ad esempio, gli spermatozoi dai primi regioni dell'epididimo visualizzare diversi modelli di fosforilazione di proteine ​​rispetto a queste ultime regioni 5,12. Questo non è sorprendente dal momento che ci sono grandi differenze nel capability dello sperma da queste regioni. Ad esempio, gli spermatozoi dei primi anni, caput epididimo sono immotilite. Al contrario, le cellule spermatiche della regione cauda subiranno avanti motilità progressiva volta posto in mezzo isotonico. Dato che le cellule spermatiche epididymal sono incapaci di de-novo biosintesi delle proteine, tutti i percorsi intrinseci che regolano la funzionalità degli spermatozoi deve avvenire attraverso modificazioni post-traduzionali (PTM). Quindi, è ovvio che la proteomica, e in particolare la ricerca di PTM, come la fosforilazione deve essere uno degli elementi principali, se vogliamo capire sperma maturazione delle cellule.

Un metodo alternativo per ottenere spermatozoi dalle epididymidies usare retro-backflush 13-16. Sebbene questa tecnica è certamente più tempo e richiede un maggior grado di abilità da parte dell'operatore, gli spermatozoi ottenuta costantemente dimostrare purezza superiore al 99,99%. Inoltre, a differenza di tutte le altre tecniche, spermatozoi can essere isolato in uno stato quiescente, rendendo possibile studiare come viene iniziata la motilità degli spermatozoi. Come preparazione del campione è l'aspetto più importante per l'analisi proteomica, l'isolamento degli spermatozoi è diventato uno degli aspetti più importanti di studi sperma-proteomica. Questo protocollo fornisce una spiegazione su come spermatozoi sono isolati dal epididimo cauda. In seguito a questo, la procedura di arricchimento 2 fosfopeptide TiO è delineato, con specifico riferimento su come estrarre peptidi dalle spermatozoi altamente differenziate. L'approccio MS può essere utilizzato per distinguere mutevoli fosfopeptidi se si dovesse confrontare la epididymal spermatozoi caudale in uno stato (immotile o non capacitati) ad un altro (mobili, capacitati, acrosoma reagito, etc.) rendendo questo un approccio potente per studiare sperma funzione.

Protocol

1. Preparazione della Cultura media e Piatti

  1. Rendere 200 ml di Biggers Whitten Whitten e (BWW) 17 soluzione di lavoro aggiungendo 5,54 g di NaCl, KCl 0,356 g, 0,25 g CaCl 2, 0,162 g H 2 KO 4 P, e 0,294 g MgSO 4 a 1 L di acqua Milli-Q . Questa è la soluzione madre e può essere conservato a 4 ° C per un mese.
  2. Dalla soluzione di riserva, aggiungere 420 mg di NaHCO 3 -, 200 mg di glucosio, piruvato 6 mg di sodio, 600 mg albumina sierica bovina, 0,74 ml di lattato di sodio, e 4,0 ml di tampone HEPES a 193 ml di BWW magazzino. Questa è la soluzione di lavoro ed è sempre fatta fresca nel giorno e equilibrati a 37 ° C prima dell'uso.
  3. Per rendere la cannula, prendere polietilene (PE) tubi con un diametro interno di 0,4 mm e un diametro esterno di 1,1 mm e tenere a fuoco basso (tipicamente fiamma metanolo) tale che il tubo inizia a fondere. Tirare subito il tubo OUTWard per allungare e rendere il diametro esterno stretto.
  4. Tagliare a produrre un restringimento di una estremità, che consente una più facile incannulamento dei vasi deferenti.
  5. Tagliare l'altra estremità della cannula per circa 15 cm. Inserire un ago da 30 G nel estremità smussata, e allegare una siringa da 3 ml di esso (completamente ritratto).
  6. Fare un boccaglio di aspirazione tagliando una lunghezza 20 centimetri di tubo in PE (4,2 mm di diametro interno, 6.4 mm di diametro esterno). Inserire un boccaglio in una fine.
  7. Inserire il supporto tubo di vetro micro-capillare e il vetro micro-capillare stesso (tipicamente 3 ml di un mouse, 40 microlitri di un topo).

2. Rimozione di epididimi da mouse

  1. Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione.
  2. Prendere l'animale e fare una piccola incisione nello scroto per esporre epididimo. Estrarre testicolo e epididimo fuori della cavità con un paio di orologiai # 5 pinze.
  3. Tagliare il dotto deferente tale che almeno 1-2 cm rimangono attaccate alla epididimo cauda. Inoltre, tagliare i dotti efferenti prossimali e tessuto connettivo dell'epididimo al testicolo e rimuovere l'intera traccia riproduttivo maschile.
  4. Inserire l'intera traccia riproduttivo maschile sotto un microscopio da dissezione con un intervallo di ingrandimento nell'ordine di 5-40X.

3. Cannulating il Epididimo

  1. Nastro lungo la cannula al microscopio, tale che 1-2 cm del ristretta (a forma di cono) estremità è libera e visibile attraverso la lente.
  2. Prendete un paio di orologiai # 5 pinze e stringere con delicatezza ogni lato dei vasi deferenti e tirare il dotto deferente sulla cannula, in modo tale che la cannula va in vasi deferenti.
  3. Prendete una lunghezza di non riassorbibile seta trattata nera intrecciata (dimensioni 5-0) e fare un nodo attorno ai vasi deferenti cannulate. Assicurarsi che il nodo viene tirato strettamente per tenere la cannula all'interno dei vasi deferenti quando la pressione dell'aria from la siringa viene applicato.

4. retrograda o backflush di Caudal Epididymal spermatozoi

  1. Utilizzando orologiai # 5 pinze, afferrare l'estremità distale dei epididimi cauda e rimuovere la tunica albuginea, al fine di esporre un singolo tubulo dell'epididimo.
  2. Utilizzando le pinze, tirare delicatamente il tubulo fuori per esporre e poi prendere in giro a parte in modo da creare un'apertura per lo sperma per essere rilasciato.
  3. Spingere delicatamente sui 3 ml (mouse) o 20 ml (ratto) siringa in modo da espellere l'aria dalla siringa in vasi deferenti. Alla pressione appropriata, spermatozoi inizierà a venire lentamente del tubulo rotto all'estremità distale del epididimo cauda. In questo momento, applicare il vuoto al boccaglio per disegnare spermatozoi nel capillare di vetro. Nota: Tipicamente in un topo, 2-3 ml di spermatozoi può essere ottenuto a seconda dell'età dell'animale. Una volontà di ratto, a resa media 30-40 ml.

5. Lavaggioe lisi gli spermatozoi in preparazione Proteomica

  1. Espellere gli spermatozoi dal capillare di vetro in 1 ml di soluzione di BWW (37 ° C) soffiando delicatamente nel boccaglio o attaccare una siringa e di espellere l'aria in modo da spingere il spermatozoi indietro del capillare.
  2. Una volta che le cellule spermatiche sono diffusi, lavare 3x (300 xg, 5 min) con 1 ml BWW per rimuovere le proteine ​​contaminanti. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante. Nota: A questo punto, le cellule spermatiche possono essere congelati per un uso successivo.
  3. Solubilizzazione proteine ​​usando 4% CHAPS, 2 M tiourea, e 50 Tris mM, pH 7.4 per 1 ora con vortex intermittente.
  4. Dopo la lisi delle cellule, centrifuga (10.000 xg, 20 min), prendere surnatante e trasferire ad un nuovo tubo. Nota: A questo punto, la quantificazione delle proteine ​​può essere eseguita.

6. legame disolfuro Riduzione e Alchilazione

  1. Aggiungi DTT 10 mM come una concentrazione finale di proteine ​​lisati, vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Aggiungere 50 mM idodoacetamide come concentrazione finale di lisato, vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.

7. Precipitazione

  1. Metanolo cloroformio precipitare il campione aggiungendo 1 volume di lisato (400 microlitri come esempio), aggiungere un volume (400 ml) di metanolo e 0,5 volumi (200 microlitri) cloroformio.
  2. Vortex il campione e di spin (10.000 xg, 2 min).
  3. Si noti che due fasi appariranno dopo centrifugazione. Eliminare tutti ma 2 mm di strato superiore (facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia).
  4. Aggiungere 1 volume (400 ml) di metanolo, tubo invertito 1-2x delicatamente per mescolare e centrifugare di nuovo (10.000 xg, 15 min). Gettare il surnatante sprecare e pellet asciugare all'aria per 3-4 min.

8. tripsina Digestione

  1. Ricostituire tripsina in 25 mM di bicarbonato di ammonio contenente 1 M urea ad un rapporto di 50: 1 (W / W; proteine: tripsina) e incubate overnight a 37 ° C, preferibilmente a 700 rpm su un thermomixer.
  2. Spin (10.000 xg, 15 min) a pellet materiale digerito. Trasferire il surnatante in nuova provetta.

9. fosfopeptide Enrichment

  1. Eseguire purificazione e arricchimento fosfopeptidi dal triptico digest come descritto in precedenza 18. Diluire peptidi triptici 10 volte in tampone DHB [DHB tampone costituito da: 350 mg / ml di acido 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitrile), 2% (v / v) TFA (trifluoroacetico L'acido)] e si applicano a secco TiO2 perline (200 mcg).
  2. Lasciare in un rotatore a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Lavare il campione con il tampone DHB, ruotare e rimuovere il surnatante. Quindi lavare il campione tre volte con tampone di lavaggio [80% ACN (v / v), 2% TFA (v / v)] per rimuovere il DHB.
  4. Dopo la centrifuga finale, eluire direttamente le fosfopeptidi utilizzando tampone di eluizione aggiungendo 25 ml di idrossido di ammonio 2,5%, pH ≥ soluzione 10.5. Spin e rimuovere il surnatante. Neutralizzare immediatamente con ~ 0,3 ml di acido formico.

Representative Results

La qualità dei risultati di un'analisi proteomica è fortemente dipendente dal materiale di partenza. Con MS moderni, lievi contaminazioni in preparazione del campione sono facilmente raccolti. Pertanto, è fondamentale, in caso di proteomica spermatozoo, scegliere un metodo che dà spermatozoi altamente puro. Come illustrato nella figura 1, risciacquo retrograda viene utilizzato per recuperare spermatozoi dall'epididimo cauda. Ciò comporta cannulating deferenti con tubi in PE che permette di applicare lentamente la pressione dell'aria dalla siringa attaccata. Figura 1A mostra l'epididimo cauda insieme ai vasi deferenti. Figura 1B è un primo piano colpo di come i vasi deferenti è legata in cui il È inserito cannula. In tal modo, gli spermatozoi vengono rilasciati al termine di una tubulo asportato dagli epididimi caudale. Come mostrato in Figura 2A, gli spermatozoi vengono estratti dalle regioni apice della caudun epididimo e vengono aspirati in un capillare di vetro in uno stato quiescente (Figura 2B). Questo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali "swim-up", non ultimo dei quali è la possibilità di eseguire un'analisi phoshoproteomic di spermatozoi prima e dopo l'attivazione di motilità. Gli spermatozoi può essere espulso in mezzi di propria scelta. Figura 2C (lato sinistro), dimostra come lo sperma guardare subito dopo l'espulsione in BWW media. Molte delle cellule sono raggruppate insieme. Tuttavia, dopo 10 min di competenza delle cellule è dimostrato perché nuotare verso l'omogeneità nella soluzione (Figura 2C, giuste cellule lato). Dal momento che la tecnica di risciacquo ha un impatto minimo sulle cellule spermatiche, otteniamo quasi il 100% la motilità e le cellule disperdono rapidamente nella media senza provocazione esterna. In un tipico esperimento risciacquo, lo sperma recuperato dalla Swiss-Mouse contienetra 1-5 x 10 6 cellule. Questo è fortemente dipendente dall'età dell'animale e può variare da diversi ceppi di topi. In un ratto norvegese, si ottiene tipicamente 200 x 10 6 spermatozoi, ± 20%. Figura 2D rappresenta la purezza degli spermatozoi ottenuti dal epididimo ratto cauda.

Oltre al campione stesso, uno dei principali problemi riguardanti la preparazione del campione è la resa di tripsina digestione. Protein precipitazione gioca un ruolo importante, non solo nel rimuovere detergenti e sali indesiderati, entrambi i quali sono incompatibili con MS, ma anche proteine ​​denaturazione. Abbiamo trovato la precipitazione metanolo-cloroformio per funzionare al meglio. Non solo è stato segnalato questa procedura per precipitare bassa abbondanti proteine ​​meglio di altri compreso TCA precipitazioni 19, ma ha ulteriori vantaggi. Dopo precipitazione TCA, è spesso necessario regolare il pH dopo sospensione del pellet TCA che possa rimanere abbastanzaacida. Sebbene il pellet precipitato di TCA può essere lavato in soluzioni organiche alti per rimuovere l'acido, questo aggiunge al campione manipolazione e irriproducibilità di risultati. La mancata neutralizzare l'acido comporterà poveri rendimenti peptide triptici. Metanolo-cloroformio precipitazione non è solo veloce ma non acidificare il campione. La Figura 3 illustra il pellet di proteine ​​tipicamente visto da 100 mg di campione tra l'interfase inferiore e superiore.

L'isolamento di fosfopeptidi può avvenire in diversi modi; tuttavia riproducibilità dipende da come il campione è stato gestito fino al questa fase. Uno dei metodi di sviluppo più comuni è TiO2, originariamente sviluppato dal gruppo di Martin Larsen 18,20,21. Sebbene descritto come un processo per utilizzare in microcolonne, possiamo ottenere dati riproducibili mediante cromatografia batch. Il successo del processo è fortemente dipendente dal tampone di eluizione, che deve essere pazza e con la corretta composizione; altrimenti fosfopeptidi non vengono eluiti affatto.

La riproducibilità dei dati di protocollo e rappresentativi da TiO 2 arricchito fosfopeptidi da cauda epididimale sperma in un non mobili (figura 4 in alto) e mobili (Figura 4 in basso) stato da m / z 650-670 può essere visto. Abbiamo dimostrato che questa è una tecnica estremamente riproducibile anche utilizzando repliche biologica 17. Le strisce blu che appaiono nel tempo sono peptidi eluizione da un nano-colonna C18 come aumenta la concentrazione di acetonitrile. Chiaramente, nella popolazione mobili (n = 3 mostrato, n = 8 tipicamente funzionare), vi è un gruppo peptide, con una massa monoisotopico intorno al 651,5 Da gamma che è completamente assente nell'intervallo non mobili. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare questo peptide.

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Figura 1:. Incannulazione del epididymis cauda (A) Immagine del epididimo cauda. La cannula si è registrato fino a esporre di circa 1-2 cm dalla fine pre-tirato. Questo è inserito nei vasi deferenti utilizzando sottili # 5watchmakers pinze. (B) La cannula viene tenuto in posizione legando seta fine attorno a un segmento che contiene sia i vasi deferenti e la cannula. Dal murino, approssimativamente 2-3 microlitri di cellule dell'epididimo caudale e fluido sono raccolti ad una concentrazione di 1 x 10 6 / ml. Dal ratto (in figura), a circa 30-40 ml di liquido si ottengono a concentrazioni simili.

Figura 2
Figura 2: capillare di vetro utilizzato per raccogliere competente spermatozoi dell'epididimo. (A) Un tubulo dall'apice della cauda e pididymis è isolata e rotto. La posizione approssimata da cui ciò avviene è mostrato. (B) La parte superiore dell'immagine mostra un tubo capillare di vetro vuoto e il fondo mostra uno da un ratto precedenza backflush. Non vi è alcuna contaminazione del sangue e la contaminazione delle cellule epiteliali minima. (C) Poiché gli spermatozoi sono ancora diluito nel fluido dell'epididimo, non hanno iniziato ad attivare. Quando il spermatozoi vengono inizialmente espulsa in una soluzione BWW, escono come "stringa" compact (lato sinistro della mano). La competenza della cella è facilmente stabilito, dal momento che dopo 10 minuti la maggior parte degli spermatozoi nuotare in soluzione senza alcun disturbo esterno (lato destro della mano). (D) Una foto di una aliquota di cellule dell'epididimo caudali subito dopo che sono stati lasciati a nuotare out dimostra la purezza delle cellule.

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Figura 3:. Metanolo-cloroformio precipitazione volta spermatozoi stato solubilizzato, la frazione solubile è metanolo-cloroformio precipitato per garantire denaturazione delle proteine ​​e la rimozione di sostanze contaminanti. Il pellet di proteine ​​appare sull'interfaccia tra le fasi di metanolo / acqua e cloroformio. Lo strato superiore viene rimosso attentamente in modo da non disturbare il pellet. È comune lasciare circa 2-3 mm della fase superiore in modo da nessuna proteina è persa.

Figura 4
Figura 4:. Tipica TiO2 profilo fosfopeptide -enriched Utilizzando il protocollo descritto, caudale epididymal spermatozoi sono stati isolati in uno immotile (in alto, N = 3) o stati di mobili (in basso, N = 3). Un cluster peptide con una massa mono-isotopica di ~ 651,5 Dun è dimostrato di essere presente nelle popolazioni motilità ma completamente assente in quelli immotile (freccia). Confronti di questo tipo sono indicati come "privo di etichetta (MS-based)". La massa peptide e tempo di ritenzione vengono poi utilizzati per indirizzare il composto per spettrometria di massa tandem e identificare la proteina da cui il peptide è stato derivato.

Discussion

I passaggi critici per il successo e riproducibile analisi proteomica di spermatozoi sono: 1) la purezza del materiale di partenza; 2) la rimozione dei sali e detergenti indesiderati; 3) denaturazione proteine ​​per la loro estensione in modo da consentire tripsina per digerire un alto rendimento di proteine ​​e 4) minimizzando campione movimentazione per ridurre la perdita di peptide.

Per backflush successo l'epididimo cauda, ​​è essenziale per individuare la zona da cui spermatozoi uscirà. In caso di ratto e topo, questo è all'apice della zona concava, nel mezzo della regione caudale dell'epididimo (vedi figura 2A). Se uno viene ulteriormente verso i vasi deferenti, risciacquo è più facile e il tasso di successo è generalmente superiore. Tuttavia, questo ha la perdita di numero di spermatozoi. In alternativa, se si tenta di muoversi più prossimale al corpus, allora la quantità di pressione necessaria per spingere il spermatozoi indietro attraverso il epididymcondotti Al è spesso così alta, che danno ai epididimo avviene inevitabilmente.

Backflush dell'epididimo avviene tradizionalmente con acqua satura di olio minerale e una soluzione salina bilanciata nella siringa stessa come un mezzo per rimuovere gli spermatozoi 22-25. Entrambe le procedure sono potenzialmente problematici di LC-MS. In primo luogo, minerale rischia di bloccare le nano-C18 nano-colonne che sono essenzialmente utilizzati in tutto il mondo per l'analisi e la cura proteomica devono essere prese in modo che nessuno sia portato avanti nella procedura. In questo caso, non è possibile proseguire e il campione viene sostanzialmente perso. Questo può essere superato con l'uso di BWW o altre soluzioni saline bilanciate nella siringa, tuttavia, anche se questo è successo, presto riconosciuto che molti degli spermatozoi mobili diventano non appena la soluzione BWW entra in contatto e mescolato con il epididimale caudale cellule. Per aggirare questo problema semplicemente backflush gli spermatozoi con l'aria. Non solo è la quallità di spermatozoi paragonabile a quella dei metodi a base liquida, ma la quantità è identico.

Fosfoproteomica è forse uno dei pochi modi per stabilire quali vie di segnalazione si verificano in spermatozoi post-eiaculazione. Una delle principali vie che stiamo indagando è il processo di capacitazione. Gli spermatozoi deve sottoporsi "capacitazione" prima che sia in grado di legarsi ad un uovo. In pratica, questo è realizzato sostanzialmente incubando spermatozoi per un periodo di tempo (topo 40 min; ratto 1,5 ore; umana 3-24 ore) in soluzione BWW con albumina sierica. In precedenza, noi ed altri hanno dimostrato un ruolo per diverse chinasi coinvolte in capacitazione. Di interesse, la cancellazione della PKA μ II produrre topi i cui spermatozoi nuotare spontaneamente in vitro, ma non può subire iperattivazione 26. Quest'ultima è una caratteristica di capacitazione, per cui gli spermatozoi cambiare il loro modello di nuoto da una velocità elevata, bassa ampiezza, a un minimovelocità, ampiezza alta battuto frequenza. Abbiamo dimostrato chinasi a valle coinvolti in questo processo sono PP60-CSRC (SRC) 13,27 c-yes 28 e c-ABL 14. È interessante notare che l'inibizione di SRC ferma capacitazione-dipendente fosforilazione della tirosina 13. Tuttavia, questo può essere superato con l'acido okadaico, suggerendo che SRC non è direttamente coinvolto nella insorgenza generale di fosforilazione della tirosina 29, ma possono disciplinare una fosfatasi 29. Il problema con l'utilizzo BWW come mezzo per forzare spermatozoi fuori dell'epididimo è che, una volta attivato, mouse spermatozoi richiedono soltanto circa 40 min a capacitate. Dato che l'isolamento di spermatozoi può prendere 5 min / mouse e spesso diversi topi sono utilizzati in un esperimento, allora spermatozoi sarà a diversi stadi di maturazione all'inizio dell'esperimento. Per ovviare a questo, la pressione dell'aria può essere utilizzato per spingere il spermatozoi dall'epididimo caudali in una cannula di vetro. Non solo tutte le inact spermaive ed essenzialmente come sarebbero trovate nell'ambiente caudale, rende possibile il confronto fosfoproteomica non mobili e mobile.

La gestione per fosfoproteomica campione deve essere ridotto al minimo quando si confrontano spermatozoi in due diversi stati funzionali. L'uso di metanolo cloroformio rispetto ad altri metodi tradizionali di proteine ​​precipitazione 1) riduce la necessità di ulteriori fasi di lavaggio, 2) rimuove quasi tutte le tracce di sali e grassi e 3) ha una comprovata capacità di precipitare proteine ​​poco abbondanti su TCA 19. Protein precipitazioni prima tripsina digestione è consigliato dal momento che non solo fa questo aiuto per denaturare proteine ​​(che aiuta la digestione tripsina), ma rimuove molti dei metaboliti MS-compatibili presenti nella cellula.

Il confronto di fosfopeptidi sperma può essere fatto in diversi modi. Al livello di base, un semplice confronto della fosfopeptide identificato in un campione, a quella in un'altracampione nel processo noto come "conteggio spettrale" può essere fatto. Tuttavia la critica è stata in questo approccio fondamentalmente perché i primi studi di proteomica usavano basse repliche (per una discussione più vedere Lundren et al. 30). Un approccio più sofisticato è quello di esaminare l'intensità della massa genitore peptide e confrontarlo con gli altri campioni (di confronto libero-label). Nell'esempio illustrato nella figura 4, un peptide assente dal da non mobili (figura 4 in alto), ma presenti nella mobili (Figura 4 in basso) spermatozoi da m / z 650-670 può essere visto. Questo processo, denominato etichetta MS quantificazione libera è una strategia senza etichetta.

Una strategia alternativa comunemente usato per ridurre la quantità di piste richiesti per la quantificazione proteomica è utilizzare isotopi. Poiché la massa di un isotopo è diverso, lo spettrometro di massa può essere utilizzata per confrontare le intensità del Eluting peptidi. Tuttavia, a differenza di molti altri tipi di cellule, alcune etichettatura isotopica non può essere applicato a spermatozoi. Ad esempio, l'aggiunta di isotopi stabili (un isotopo pesante viene aggiunto un campione, mentre una versione più leggera viene aggiunto ad un altro) può essere utilizzato in coltura tissutale. Quando gli isotopi vengono incorporati nella proteina, un'analisi proteomica può essere eseguita combinando i due campioni (multiplazione). Tuttavia, nel caso di spermatozoi, ciò non può essere fatto, semplicemente in virtù del fatto che 1) marcatura isotopica richiede diversi passaggi (fino a 8) in coltura tissutale e 2) gli spermatozoi senza trascrizione genica nucleare e traduzione e quindi, essi non possono incorporare comunque isotopi in tutte le loro proteine. Un modo per aggirare questo è quello di ordinare i topi radiomarcati, tuttavia, questi sono notoriamente costosi. Un approccio alternativo è di utilizzare un tag chimica. Questo è stato fatto quando i topi non capacitati sono stati confrontati con i topi capacitati. In questo caso, un D 0 e D 31. Altri approcci possono includere l'uso di iTRAQ (tag isobarica per la quantificazione relativa e assoluta), per cui lisine sono etichettati chimicamente con diversi isotopi di massa; iCAT (isotopo codificato tag affinità) per cui cisteine ​​sono etichettati con diversi isotopi di massa e l'etichettatura di acqua pesante e leggero.

In ogni caso, comunque, una cosa deve essere tenuto a mente. La MS riporta solo ciò che è presente in un campione, e questo è un riflesso di tutto ciò che è accaduto a quel campione fino a quel momento. Minimizzare la manipolazione del campione, mentre massimizzando il rendimento ad ogni passo è necessario per un successo analisi proteomica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

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References

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75, (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10, (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69, (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

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