Fosfopeptiden Analys av gnagare Epididymal Spermier

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spermier är ganska unik bland celltyper. Även produceras i testiklarna, båda kärnvapen gen transkription och translation avstängd när den förelöpare runda cellen börjar långsträckt och differentiera till vad som morfologiskt erkänd som en spermie. Dock är sädescell väldigt omogen, inte har någon förmåga till motilitet eller ägget erkännande. Båda dessa händelser inträffar när spermier transitering en sekundär orgel kallas bitestikeln. Under ~ 12 dagars passage som det tar för en spermie att passera genom bitestiklarna, post-translationella modifieringar av existerande proteiner spelar en central roll i mognaden av cellen. En viktig aspekt av en sådan är proteinfosforylering. För att karakterisera fosforylering evenemang som äger rum under spermiemognad, måste såväl rena spermier cellpopulationer och pre-fraktionering av fosfopeptider upprättas. Använda tillbaka spolningsteknik, en metod för isolering av ren spermatozo of hög kvalitet och avkastning från de distala eller caudal bitestiklar beskrivs. Stegen för solubilisering, matsmältning, och pre-fraktionering av spermier fosfopeptider genom TiO 2 affinitetskromatografi förklaras. När isolerat, kan fosfopeptider injiceras i medlemsstaterna att identifiera både proteinfosforylering händelser specifika aminosyror och kvantifiera nivåerna av fosforylering sker under spermier mognadsprocesserna.

Introduction

Efter att ha vuxit fram ur testiklarna, är spermier högt differentierade ännu anmärkningsvärt, dessa celler är omogna 1,2. Som sådan, de saknar fullständig funktionalitet, inklusive möjligheten att simma och binder till en äggcell 3. Även det krävs ytterligare mognaden av spermie, detta inte kan ske via kanoniska vägar, eftersom i detta skede av sin celldifferentiering process, de är oförmögna att gentranskription och ytterligare protein biosyntesen 4. Biologisk behörigheten tilldelas spermier när de lämnar testikeln och ange en del av det manliga reproduktiva systemet kallas bitestiklarna 5. Bitestikeln är en tätt lindad, mycket differentierade röret som förbinder de efferenta kanalerna (i testiklarna) till sädesledaren och finns i alla manliga däggdjur 6. Spermier successivt förvärva deras gödsling potential under epididymal härkomst, att förlita sig på den ständigt föränderliga luminala miljö som är speated av de lokala epididymala epitelceller 7. De olika sekretoriska och åter absorberande aktiviteter som finns i epididymal milieu agera för att ändra spermier själv, ändra dess protein, kolhydrater och fett sammansättning 6. Vikten i bitestiklarna, speciellt den inledande "caput" region i denna struktur har exemplifierats med kirurgiska ligeringstekniker 8. Spermier kvar i testiklarna genom efferent kanal ligering saknas helt i någon egenskap att befrukta äggcellen 9-11.

Förutom epididymal miljön, till signaltransduktionsvägar inom spermiema arbete post-translationellt modifiera existerande spermie komplement. Till exempel, spermier från tidigt regioner bitestiklarna visa olika mönster av proteinfosforylering jämfört med de sistnämnda områdena 5,12. Detta är inte förvånande eftersom det finns stora skillnader i capability av spermier från dessa regioner. Till exempel, spermier från tidigt, caput bitestiklarna är immotilite. Däremot kommer spermier från cauda regionen genomgå framåt progressiv motilitet gång placerats i isoton medium. Eftersom epididymal spermierna är oförmögna att de-novo proteinbiosyntes måste alla de inneboende signalvägar som reglerar spermiefunktion ske genom post-translationella modifieringar (PTM). Därför är det förståeligt att proteomik, särskilt utredningen av PTMs såsom fosforylering måste vara en viktig drivkraft för att vi ska förstå spermie mognad.

En alternativ metod för att få spermier från epididymidies att använda retroåterspolnings 13-16. Även om denna teknik är definitivt mer tidskrävande och tar en större grad av skicklighet av operatören, spermier erhålls konsekvent visa renhet på över 99,99%. Dessutom, till skillnad från alla andra tekniker, spermatozo CAn isoleras i ett vilotillstånd, vilket gör det möjligt att studera hur spermierörlighet initieras. Som provberedning är den viktigaste aspekten för proteomik analys, har isolering av spermier blivit en av de viktigaste aspekterna av spermier-proteomik studier. Protokollet ger en förklaring på hur spermier är isolerade från cauda epididymis. Efter detta är TiO 2 fosfopeptiden förfarande anrikning skiss, med särskild hänvisning om hur man extraherar peptider från de mycket differentierade spermier. Kan användas MS metod för att särskilja föränderliga fosfopeptider om man skulle jämföra den kaudala epididymala spermier i ett tillstånd (immotile eller icke-capacitated) till en annan (motila, capacitated, akrosom reagerade, etc.) vilket gör detta en kraftfull metod för att studera sperma funktion.

Protocol

1. Beredning av Kultur Media och Rätter

  1. Gör 200 ml Biggers Whitten och Whitten (BWW) 17 arbetslösning genom att tillsätta 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl2, 0,162 g H 2 KO 4 P, och 0,294 g MgSO 4 till 1 L av Milli-Q-vatten . Detta är stamlösningen och kan hållas vid 4 ° C i upp till en månad.
  2. Från stamlösningen, tillsätt 420 mg NaHCOa 3 -, 200 mg glukos, 6 mg natriumpyruvat, 600 mg bovint serumalbumin, 0,74 ml natriumlaktat och 4,0 ml HEPES-buffert till 193 ml av BWW lager. Detta är den arbetslösning och görs alltid färskt på dagen och ekvilibreras till 37 ° C före användning.
  3. För att göra kanylen, ta polyeten (PE) rör med en inre diameter på 0,4 mm och en yttre diameter på 1,1 mm och håll på låg värme (vanligtvis metanol flamma) så att slangen börjar smälta. Dra genast slangen outward att sträcka och göra ytterdiameter smalare.
  4. Klipp för att producera en förträngning av ena änden som gör det enklare kanyle av sädesledaren.
  5. Skär den andra änden av kanylen till ca 15 cm. Sätt i en 30 G nål i den trubbiga änden, och bifoga en 3 ml spruta till den (helt indragen).
  6. Gör en sugmunstycke genom att skära en 20 cm längd av PE-slang (4,2 mm innerdiameter, 6,4 mm ytterdiameter). Sätt i ett munstycke i ena änden.
  7. Sätt i mikro-kapillär glasrör hållare och glasmikro kapillär själv (typiskt 3 ul för en mus, 40 pl för en råtta).

2. Borttagning av bitestiklar från mus

  1. Euthanize möss enligt IACUC-godkända förfaranden som är specifika för varje institution.
  2. Ta djuret och göra ett litet snitt i pungen för att exponera bitestikeln. Dra testiklar och bitestiklar ur kaviteten med hjälp av ett par av urmakare # 5 pincett.
  3. Skär sädesledaren så att åtminstone 1-2 cm sitter kvar på cauda epididymis. Dessutom skär de proximala efferenta kanaler och vävnad som förbinder bitestikeln till testiklarna och ta bort hela manliga reproduktiva spår.
  4. Placera hela manliga reproduktiva spår under ett dissekera mikroskop med en förstoring intervall i storleksordningen 5-40X.

3. kanyle bitestikeln

  1. Tejpa ner kanylen till mikroskopet, så att 1-2 cm av minskat (konformade) änden är gratis och syns genom linsen.
  2. Ta ett par urmakare # 5 pincett och försiktigt knäppa varje sida av sädesledaren och dra sädesledaren på kanylen, så att kanylen går in sädesledaren.
  3. Ta en längd av icke-absorber svart flätat behandlad silke (storlek 5-0) och knyt en knut runt kannulerade sädesledaren. Säker knuten dras tätt för att hålla kanylen inne sädesledaren när lufttrycket frabout sprutan anbringas.

4. Retrograd eller Motspolning av Stjärt Epididymal Spermier

  1. Använda urmakare # 5 pincett, greppa den distala änden av cauda epididymis och avlägsna tunica albuginea i syfte att exponera en enda epididymal tubuli.
  2. Med hjälp av pincett, försiktigt dra tubuli ut att exponera och sedan retas isär för att skapa en öppning för spermierna att släppas.
  3. Tryck försiktigt på de 3 ml (mus) eller 20 ml (råtta) spruta så att driva ut luft från sprutan i sädesledaren. Vid lämpligt tryck kommer spermier börja sakta komma ut ur den brutna tubuli vid den distala änden av cauda epididymis. Vid denna tid, avsugning till munstycket för att dra spermiema i glaskapillären. Obs: Normalt i en mus, kan 2-3 pl av spermier erhållas beroende på djurets ålder. En råtta kommer, i genomsnitt avkastningen 30-40 pl.

5. Tvättningoch lysera Spermier i Förberedelse för proteomik

  1. Utvisa sädescellerna från glaset kapillär i en ml lösning av BWW-lösning (37 ° C) genom att försiktigt blåsa i munstycket eller fästa en spruta och utdrivning luft för att trycka spermiema tillbaka ut ur kapillären.
  2. När spermierna är diffust, tvätta 3x (300 xg, 5 min) med 1 ml BWW att avlägsna förorenande proteiner. Efter den slutliga tvätten, avlägsna supernatanten. Notera: Vid denna punkt, kan spermierna frysas för senare användning.
  3. Solubilisera proteiner med användning av 4% CHAPS, 2 M tiokarbamid och 50 mM Tris, pH 7,4 under 1 h med intermittent virvling.
  4. Efter lyse cellerna, centrifug (10.000 xg, 20 min), ta supernatanten och överför till ett nytt rör. Notera: Vid denna punkt, kan utföras protein kvantifiering.

6. disulfidbindningen Minskning och alkylering

  1. Lägg 10 mM DTT som en slutlig koncentration till lyserade proteiner, vortex och inkubera vid RT i 30 min.
  2. Lägg 50 mM idodoacetamide som en slutlig koncentration till lysat, virvel och inkubera vid RT i 30 minuter i mörker.

7. Nederbörd

  1. Metanol kloroform utfälla provet genom att tillsätta en volym av lysat (400 | il som ett exempel), tillsätt en volym (400 pl) av metanol och 0,5 volym (200 pl) kloroform.
  2. Vortex provet och spinn (10.000 xg, 2 min).
  3. Observera att två faser visas efter centrifugering. Släng alla men 2 mm av övre lagret (var försiktig så att inte störa gränssnittet).
  4. Lägg en volym (400 pl) av metanol, 1-2x invertera röret försiktigt för att blanda och återigen spinner (10.000 xg, 15 min). Kassera supernatanten till avfall och lufttorka pellets för 3-4 min.

8. trypsindigerering

  1. Bered trypsin i 25 mM ammoniumbikarbonat innehållande 1 M urea till ett förhållande av 50: 1 (vikt / vikt; protein: trypsin) och inkuberades overnight vid 37 ° C, företrädesvis vid 700 rpm på en Thermomixer.
  2. Spin (10.000 xg, 15 min) för att pelle osmält material. Överför supernatanten till nya rör.

9. fosfopeptid Anrikning

  1. Utför rening och anrikning av fosfopeptider från tryptiska smälta som tidigare beskrivits 18. Späd tryptiska peptider 10-faldigt i DHB buffert [DHB bufferten består av: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic syra (DHB), 80% (vol / vol) ACN (acetonitril), 2% (v / v) TFA (trifluorättiksyra syra)] och applicera i torrt TiO 2 pärlor (200 ug).
  2. Lämna på en rotator vid rumstemperatur under en timme.
  3. Tvätta provet med DHB buffert, snurra och ta bort supernatanten. Tvätta sedan provet tre gånger med tvättbuffert [80% ACN (volym / volym), 2% TFA (volym / volym)] för att avlägsna DHB.
  4. Efter den sista spinn, direkt eluera fosfopeptider använder elueringsbuffert genom att tillsätta 25 pl av en 2,5% ammoniumhydroxid, pH ≥ 10,5 lösning. Sstift och avlägsna supernatanten. Omedelbart neutralisera med ~ 0,3 l myrsyra.

Representative Results

Kvaliteten på resultaten från alla proteomic analys är starkt beroende av utgångsmaterialet. Med moderna MS, är små föroreningar i beredningar prov lätt plockas upp. Därför är det viktigt, när det gäller spermie proteomik, att välja en metod som ger högren spermier. Såsom illustreras i fig 1, är retrograd motspolning används för att hämta sädesceller från cauda epididymis. Detta innebär kanyle sädesledaren med PE slang som gör att man kan sakta tillämpa lufttryck från sprutan bifogas. Figur 1A visar cauda epididymis tillsammans med sädesledaren. Figur 1B är en närbild skott av hur sädesledaren är knuten där kanylen är införd. Genom att göra så, är spermier släpps i utskurna änden av en tubuli från stjärtfenan bitestiklar. Såsom visas i fig 2A, är spermiema heras från spetsen regioner av cauden epididymis och sugs upp i en glaskapillär i ett vilotillstånd (figur 2B). Detta har flera fördelar jämfört med traditionella "simma-up" metoder, inte minst som är förmågan att utföra en phoshoproteomic analys av spermier före och efter aktiveringen av motilitet. Den spermier kan sedan utvisas till media av ens val. Figur 2C (vänster) visar hur spermierna ser direkt efter utvisning till BWW medier. Många av cellerna är hopklumpade tillsammans. Dock är efter 10 min kompetens av cellerna visade att de simma ut till homogenitet i lösningen (Figur 2C, höger sida celler). Eftersom återspolningstekniken har mycket liten inverkan på spermierna, vi får nära 100% motilitet och cellerna sprider snabbt in i media utan yttre provokation. I ett typiskt backspolning experiment återvunna spermier från Swiss-mus innehållermellan 1-5 x 10 6 celler. Detta är i hög grad beroende på djurets ålder och kan variera från olika stammar av möss. I en norsk råtta, får vi typiskt 200 x 10 6 spermatozoer, ± 20%. Figur 2D representerar renhet av spermier som erhålls från råttan cauda epididymis.

Förutom själva provet, är en av de stora frågorna som rör provberedning utbytet av trypsin matsmältningen. Proteinutfällning spelar en viktig roll, inte bara i att ta bort oönskade detergenter och salter, som båda är oförenliga med MS, men också i denaturera proteiner. Vi har upptäckt att metanol-kloroform utfällning för att fungera bäst. Inte bara har detta förfarande rapporterats att fälla låga rikliga proteiner bättre än andra inklusive TCA nederbörd 19, men det har ytterligare fördelar. Efter TCA nederbörd, är det ofta nödvändigt att justera pH efter upphävandet av TCA pellets som kan förbli ganskasurt. Även om den utfällda pellet av TCA kan tvättas i höga organiska lösningar för att ta bort syran, tillägger detta till prov hantering och reproducerbarhet av resultaten. Underlåtenhet att neutralisera syran kommer att resultera i dåliga tryptiska peptid utbyten. Metanol-kloroform utfällning är inte bara snabbt, men kommer inte surgöra provet. Figur 3 illustrerar proteinpellet typiskt sett från 100 ^ g av provet mellan den nedre och övre interfas.

Isoleringen av fosfopeptider kan ske på ett antal sätt; Men reproducerbarhet beror på hur provet har hanterats till och med detta skede. En av de mer vanliga, utveckla metoder är TiO 2, som ursprungligen utvecklades av den grupp av Martin Larsen 18,20,21. Även beskrivas som en process för att använda i mikrokolonner, kan vi få reproducerbara data med sats kromatografi. Framgången för processen är starkt beroende av elueringsbufferten, vilket måste vara galen e med rätt sammansättning; annars fosfopeptider inte elueras alls.

Den reproducerbarhet av data protokoll och representativa från TiO 2 berikad fosfopeptider från cauda epididymis spermier i en icke-rörliga (Figur 4 överst) och rörliga (Figur 4 botten) tillstånd från m / z 650-670 kan ses. Vi har visat att detta är en extremt reproducerbar teknik även när du använder biologiska replikat 17. De blå stråk över tiden är peptider som eluerar från en C18 nano-kolonn såsom koncentrationen av acetonitril ökar. Tydligt, i den rörliga populationen (n = 3 visad, n = 8 typiskt kör), finns det en peptidkluster, med en monoisotopiska massa runt 651,5 Da området som är helt frånvarande i det icke-motila intervallet. Tandem-masspektrometri används sedan för att identifiera denna peptid.

546 / 51546fig1highres.jpg "/>
Figur 1:. Kanyle av cauda epididymis (A) Bild på cauda epididymis. Kanylen själv tejpas ned för att exponera ca 1-2 cm av pre-drog ände. Detta införes i sädesledaren med fin # 5watchmakers pincett. (B) Kanylen hålles på plats genom att binda fint silke runt ett segment som innehåller både sädesledaren och kanylen. Från mus, ligger ungefär 2-3 pl av caudal epididymala celler och vätska uppsamlades vid en koncentration av 1 x 10 6 / il. Från råtta (visad), är ungefär 30 till 40 pl av fluid erhålles vid liknande koncentrationer.

Figur 2
Figur 2: Glas kapillär används för att samla kompetent epididymal spermier. (A) En tubuli från spetsen på cauda e pididymis är isolerad och bruten. Den ungefärliga position från vilken detta sker visas. (B) Den övre delen av bilden visar ett tomt glas kapillärrör och botten visar en från en tidigare återspolas råtta. Det finns ingen blodsmitta och minimal förorening epitelceller. (C) Eftersom spermier fortfarande outspätt i epididymal vätskan, har de inte börjat att aktivera. När spermier initialt utvisas till ett BWW lösning, kom de ut som en kompakt "sträng" (vänster). Kompetensen hos cellen lätt etablerad, eftersom efter 10 min mesta av spermier simmar i lösning utan någon yttre störning (höger sida). (D) En bild av en delmängd av caudal epididymala celler direkt efter att de har kvar att simma ut demonstrerar renheten hos cellerna.

g3highres.jpg "/>
Figur 3:. Metanol-kloroform utfällning När spermatozo varit solubiliserade, är den lösliga fraktionen metanol-kloroform utfälldes att säkerställa denaturering av proteinerna och avlägsnande av kontaminerande ämnen. Protein pelleten visas på gränssnittet mellan metanol / vatten och kloroformfaserna. Det övre skiktet avlägsnas försiktigt för att inte störa denna pellet. Det är vanligt att lämna omkring 2-3 mm från den övre fasen så inget protein förloras.

Figur 4
Figur 4:. Typisk TiO 2 berikad fosfopeptid profil användning av den beskrivna protokollet fick kaudal epididymal spermier isoleras i antingen immotile (topp, N = 3) eller motila stater (botten, N = 3). En peptid kluster med en mono-isotopmassa ~ 651,5 Den visas vara närvarande i de motila populationer men helt frånvarande i immotile ettor (pil). Jämförelser av detta slag hänvisas till som "märkningsfri (MS-baserad)". Den peptidmassa och retentionstid används sedan för att rikta föreningen för tandem-masspektrometri och identifiera protein från vilket peptiden härrörde.

Discussion

De kritiska stegen för en lyckad och reproducerbar proteomic analys av spermier är: 1) renhet hos utgångsmaterialet; 2) avlägsnande av oönskade salter och rengöringsmedel; 3) denaturera proteiner i full utsträckning så att trypsin för att smälta ett högt utbyte av proteiner och 4) minimera provhantering för att minska förlust av peptid.

För att framgångsrikt backspola cauda epididymis, är det viktigt att hitta det område från vilket spermier avslutas. I fallet med både råtta och möss, detta är vid spetsen av den konkava ytan, i mitten av den kaudala området av epididymis (se Figur 2A). Om man kommer vidare mot sädesledaren är backspolning lättare och framgången är generellt högre. Dock kommer denna vid förlust av siffror spermier. Alternativt, om man försöker att röra sig mer proximalt till corpus, då mängden tryck som krävs för att trycka spermiema tillbaka genom epididymal kanaler är ofta så höga, att skador på bitestikeln sker oundvikligen.

Backspolning i bitestiklarna traditionellt utförs med hjälp av vattenmättad mineralolja och en balanserad saltlösning i sprutan själv som ett medium för att ta bort spermier 22-25. Båda förfarandena är potentiellt problematiskt av LC-MS. För det första kommer sannolikt att blockera nano C18 nano kolumner som i grunden används över hela världen för proteomik analys och omsorg måste tas så att ingen överförs i förfarandet mineral. Om detta inträffar, är det omöjligt att fortsätta och provet huvudsak förlorat. Detta kan övervinnas genom användning av BWW eller andra balanserade saltlösningar i sprutan, men, även om detta är framgångsrikt, vi medgav snart att många av spermiema bli rörliga så snart BWW lösningen kom i kontakt och blandas med den kaudala epididymal celler. För att kringgå detta problem har vi backspola enkelt spermiema med luft. Inte bara är qualten av spermier som är jämförbar med vätskebaserade metoder, men mängden är identisk.

Phosphoproteomics är kanske en av de enda sätten att fastställa vilka signalvägar förekommer i spermier efter utlösning. En av de stora vägarna som vi undersöker är processen för capacitation. Spermier måste genomgå "kapacitering" innan det är i stånd att binda till ett ägg. I praktiken uppnås detta i huvudsak genom att inkubera spermatozo under en tidsperiod (mus 40 min; råtta 1,5 h; humant 3-24 h) i BWW-lösning med serumalbumin. Tidigare har vi och andra visat en roll i flera kinaser involverade i capacitation. Av intresse, radering av PKA μ II producerar möss vars spermier simma spontant in vitro, men kan inte genomgå aktivering 26. Det senare är ett kännetecken för kapacitering, vari spermatozoer ändra sitt simning mönstret från en hög hastighet, låg amplitud, till en låghastighet, hög amplitud slå frekvens. Vi har visat nedströms kinaser är involverade i denna process inkluderar pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-ja 28 och c-ABL 14. Intressant hämning av SRC stoppar capacitation beroende tyrosinfosforyleringen 13. Detta kan dock lösas med okadainsyra, vilket tyder på att SRC inte är direkt involverad i den allmänna uppkomsten av tyrosinfosforylering 29 men kan reglera en fosfatas 29. Problemet med att använda BWW som ett medium för att tvinga spermier ur epididymis är att när de väl aktiverats, mus spermatozoer endast ta cirka 40 min till capacitate. Med tanke på att isolering av spermier kan ta 5 min / mus och ofta flera möss används i ett experiment, då spermier blir i olika stadier av förfall i början av experimentet. För att övervinna detta, kan lufttryck användas för att trycka sädescellerna från svans epididymis i ett glas kanyl. Inte bara är alla spermierna inaktIve och i huvudsak som de skulle finnas i kaudala miljön, det gör det möjligt att jämföra icke-rörliga och rörliga phosphoproteomics.

Prov hantering för phosphoproteomics bör hållas till ett minimum när man jämför spermier i två olika funktionella stater. Användningen av metanol kloroform över andra traditionella metoder för protein nederbörd 1) minskar behovet av extra tvättsteg, 2) tar bort nästan alla spår av salter och fetter samt 3) har en bevisad förmåga att fälla låga överflöd proteiner över TCA 19. Protein nederbörd före trypsindigerering rekommenderas eftersom inte bara gör denna hjälp att denaturera protein (som stöd trypsindigerering), men tar bort många av de MS-inkompatibla metaboliter som finns i cellen.

Jämförelsen av sperma fosfopeptider kan göras på ett antal sätt. På grundläggande nivå, en enkel jämförelse mellan den identifierade fosfopeptiden i ett prov, för ett i en annanprov i processen som kallas "spektral räkning" kan göras. Kritiken har dock varit på detta tillvägagångssätt i grunden eftersom tidiga proteomikstudier använde låga replikat (För en utförligare diskussion se et al. Lundren 30). En mer sofistikerad metod är att titta på intensiteten av peptiden modermassan och jämför detta med de andra proverna (märkningsfri jämförelse). I exemplet som visas i figur 4 kan t ex en peptid frånvarande från den från icke-motila (Figur 4 överst) men förekommer hos den rörliga (fig 4 botten) spermatozoer från m / z 650 till 670 ses. Denna process, kallad MS-baserade etikett fri kvantifiering är en etikett fritt strategi.

En alternativ strategi som vanligen används för att minska mängden av körningar som erfordras för proteomic kvantifiering är att använda isotoper. Eftersom massan av en isotop är annorlunda, kan masspektrometern användas för att jämföra intensiteterna för eluting peptider. Men till skillnad från de flesta andra celltyper, vissa isotopmärkning kan inte tillämpas på spermier. Till exempel, tillsats av stabila isotoper (en tung isotop läggs till ett prov, medan en lättare version läggs till en annan) kan användas i vävnadskultur. När isotoper får införlivas i proteinet, kan en proteomik analys utföras genom att kombinera de två prover (multiplexing). Men i fallet med spermier, kan detta inte ske, enbart på grund av det faktum att 1) ​​isotopmärkning kräver flera passager (upp till 8) i vävnadskultur och 2) spermierna saknar nukleär gen transkription och translation och därmed, de kan inte infoga isotoper i all sin protein ändå. Ett sätt runt detta är att beställa radiomärkta möss, men dessa är notoriskt dyra. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda en kemisk tagg. Detta har gjorts när icke-capacitated möss jämfördes med capacitated möss. I det här fallet, en D 0 och en D 31. Andra metoder kan omfatta användning av iTRAQ (isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering), vari lysiner märks kemiskt med olika mass isotoper; ICAT (isotop kodad affinitetsmarkör) vari cysteiner är märkta med olika mass isotoper och tung och lätt vattenmärkning.

I varje enskilt fall måste dock en sak att komma ihåg. MS rapporterar bara vad som är närvarande i ett prov, och detta är en återspegling av allt som har hänt med det provet fram till den punkten. Minimera provhantering samtidigt maximera avkastningen på varje steg är nödvändigt för en lyckad proteomik analys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75, (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10, (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69, (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics