Phosphopeptide Анализ грызунов придатка яичка сперматозоидов

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Сперматозоиды совершенно уникальны среди типов клеток. Хотя производятся в яичках, как ядерный транскрипционный генов и перевод выключены сразу предтечей круглый клетка начинает удлиняться и дифференцироваться в том, что морфологически признан сперматозоида. Тем не менее, сперматозоид очень незрелым, не имея возможности для подвижности или признания яиц. Оба эти события происходят раз сперматозоидов транзита вторичный орган, известный как придатка. В течение дня прохождения ~ 12, которое требуется для сперматозоид, чтобы пройти через придатка, после трансляционные модификации существующих белков играют ключевую роль в созревании клетки. Одним из основных граней такова фосфорилирование белков. Для того чтобы охарактеризовать фосфорилирования события, происходящие во время созревания сперматозоидов, должны быть установлены оба чистых популяций сперматозоидов и предварительно фракционирование фосфопептидов. Использование обратной промывки методы, метод для выделения чистого сперматозоидов OF высокого качества и выход из дистальных или хвостового придатка яичка изложена. Шаги для растворения, пищеварения, и пре-фракционирования спермы фосфопептидов через TiO 2 аффинной хроматографии объясняются. После выделения фосфопептиды может быть введен в MS определить как фосфорилирования белка мероприятия по конкретным аминокислотных остатков, и количественного определения уровней фосфорилирования, происходящих при процессах созревания сперматозоидов.

Introduction

Возникнув из яичка, сперматозоиды очень различались как ни удивительно, эти клетки являются незрелыми 1,2. Как таковые, они не имеют полную функциональность, включая возможность плавать и привязку к яйцеклетке 3. Хотя в дальнейшем созревание сперматозоида требуется, это не может происходить с помощью канонических путей, так как на данном этапе процесса их дифференцировки клеток, они не способны транскрипции гена и далее Биосинтез белка 4. Биологическая компетентность, возложенных на сперматозоидов, когда они покидают яичко и введите часть мужской репродуктивной системы, известной как придатка 5. Придатка плотно наматывается, сильно дифференцирована труба, которая соединяет выводных протоков (яичек), чтобы семявыносящих протоков и присутствует во всех самцов млекопитающих 6. Сперматозоиды постепенно приобретают оплодотворяющую потенциал во придатка происхождения, опираясь на постоянно меняющемся просвета среде, которая крeated местными придатка эпителиальных клеток 7. Различные секреторной и повторно поглощающие деятельности, присутствующие в среде придатка акта изменить саму сперму, меняя белка, углеводов и липидного состава 6. Важность придатка, в частности, начальное "Caput" область этой структуры была примере с помощью хирургических методов лигирования 8. Сперматозоиды остаются в пределах яичка по эфферентной канала перевязки полностью отсутствуют в любом качестве, чтобы оплодотворить яйцеклетку 9-11.

В дополнение к среде придатка, путей передачи сигнала в пределах сперматозоидов работы пост-трансляционной модификации существующего сперматозоида комплемент. Например, сперматозоиды, полученные из ранних регионах придатка отображения различных моделей фосфорилирования белков по сравнению с теми последних регионах 5,12. Это не удивительно, так как существуют огромные различия в Сapability спермы из этих регионов. Например, сперматозоиды с рано, капут придатка яичка являются immotilite. В отличие от этого, сперматозоиды из региона конского будет проходить вперед прогрессивная подвижность После размещения в изотоническом растворе. С придатка сперматозоидов не способны биосинтеза де-Ново белка, все внутренние пути, регулирующие функции спермы должно быть по посттрансляционных модификаций (PTM). Таким образом, само собой разумеется, что протеомики, в частности, исследование PTMs, таких как фосфорилирования должны быть одним из основных направлений, если мы хотим понять созревание сперматозоидов.

Альтернативный метод получения сперматозоидов из epididymidies использовать ретро-обратной промывки 13-16. Хотя этот метод, безусловно, более трудоемким и занимает большую степень мастерства оператором, сперматозоиды получают последовательно демонстрируют чистоту свыше 99,99%. Кроме того, в отличие от всех других методов, сперматозоиды CAп быть выделены в состоянии покоя, что позволяет изучить, как инициируется подвижность сперматозоидов. Как пробоподготовка является наиболее важным аспектом для протеомики анализа, выделение сперматозоидов стал одним из самых важных аспектов спермы протеомный исследований. Этот протокол дает объяснение о том, как сперматозоиды выделяют из конского придатка. После этого, TiO 2 Процедура обогащения фосфопептид изложен, с конкретной ссылкой на том, как извлекать из пептидов высокой дифференцированных клеток спермы. Подход МС может быть использован, чтобы отличить изменение фосфопептиды, если бы нужно было сравнить хвостовой придатка сперматозоидов в одном состоянии (неподвижные или не капаситированных) к другому (подвижных, капаситированных, акросомой взаимодействию и т.д.), что делает этот мощный подход к изучению спермы функция.

Protocol

1. Подготовка питательных сред и блюда

  1. Сделайте 200 мл Бигерс Виттен и Виттен (КДО) 17 Рабочий раствор путем добавления 5,54 г NaCl, 0,356 г KCl, 0,25 г CaCl 2, 0,162 г H 2 КО 4 P, и 0,294 г MgSO 4 к 1 л Milli-Q воды , Это раствор и может быть сохранена при 4 ° С на срок до одного месяца.
  2. Из маточного раствора, добавления 420 мг NaHCO 3 - 200 мг глюкозы, 6 мг пирувата натрия, 600 мг бычьего сывороточного альбумина, 0,74 мл лактат натрия и 4,0 мл HEPES буфере до 193 мл КДО наличии. Это рабочий раствор и всегда свежий в день и уравновешивали до 37 ° С перед использованием.
  3. Для того, чтобы канюли, принять полиэтилена (ПЭ) труб с внутренним диаметром 0,4 мм и внешним диаметром 1,1 мм и удерживайте на медленном огне (как правило, метанола пламя), что трубка начинает таять. Сразу вытащить трубку outwARD, чтобы растянуть и сделать наружный диаметр сужается.
  4. Cut для получения сужение одном конце, который предназначен для облегчения катетеризации семявыносящих протоков.
  5. Вырезать другой конец канюли до примерно 15 см. Вставьте 30 G иглу в тупой конец, и приложите 3 мл шприц к нему (полностью втянут).
  6. Сделать всасывания мундштук путем разрезания 20 см длины полиэтиленовой трубки (4,2 мм внутренний диаметр, 6.4 мм наружный диаметр). Вставка мундштук в одном конце.
  7. Вставьте микро-капиллярной держатель стеклянной трубки и само стекло микро-капилляр (как правило, 3 мкл для мыши, 40 мкл для крысы).

2. Удаление придатков от Mouse

  1. Эвтаназии мышей в соответствии с IACUC утвержденных процедур, характерных для каждого учреждения.
  2. Возьмите животное и сделать небольшой разрез в мошонке, чтобы разоблачить придатка. Потяните яичка и придатка яичка из полости с помощью пары # 5 пинцетом часовщика.
  3. Вырезать семявыносящих протоков, что по меньшей мере на 1-2 см остаются прикрепленными к конского придатка. Кроме того, сократить проксимальных выводных протоков и ткани, соединяющие придатки в яичко и удалить всю мужскую репродуктивную дорожки.
  4. Поместите всю мужскую репродуктивную трек под микроскопом рассекает с увеличением диапазона в порядке 5-40X.

3. Cannulating придатка

  1. Лента вниз канюли в микроскоп, например, что на 1-2 см от суженной (конусной) конец свободен и видна через объектив.
  2. Возьмите пару # 5 пинцетом часовщика и осторожно прижать каждую сторону семявыносящих протоков и тянуть семявыносящих протоков на канюли, так что канюля переходит в семявыносящий проток.
  3. Возьмите длину нерассасывающегося черный плетеный обработанной шелка (размер 5-0) и завяжите узел вокруг канюлированными семявыносящих протоков. Убедитесь, узел вытащил плотно удерживать канюлю внутри семявыносящих протоков, когда FR давление воздухаOM шприц применяется.

4. ретроградная или промывки фильтров хвостового придатка яичка сперматозоидов

  1. Использование часовщиков # 5 щипцы, захватите дистальный конец конского придатков и удалить белочную оболочку, чтобы разоблачить одну придатка трубочку.
  2. Использование щипцов, осторожно потяните трубочку, чтобы разоблачить и затем дразнить, кроме того, чтобы создать отверстие для спермы должен быть освобожден.
  3. Аккуратно надавите на 3 мл (мыши) или 20 мл (крыса) шприца таким образом, чтобы удалить воздух из шприца в семявыносящих протоков. При соответствующем давлении, сперматозоиды начнет медленно выйти из разбитого трубочку на дистальном конце конского придатка. В это время, применяются всасывания мундштука обратить сперматозоидов в стеклянного капилляра. Примечание: Как правило, у мыши, 2-3 мкл сперматозоидов может быть получено в зависимости от возраста животного. Крыса, в среднем доходность 30-40 мкл.

5. Стиральнаяи Лизирующий сперматозоидов в рамках подготовки к протеомики

  1. Извергните сперматозоидов из стеклянного капилляра в 1 мл раствора раствора КДО (37 ° C), осторожно дуть в мундштук или есть шприц и удаления воздуха таким образом, чтобы толкать сперматозоидов обратно из капилляра.
  2. После того, как сперматозоиды рассеянный, мыть 3 раза (300 XG, 5 мин) с 1 мл КДО, чтобы удалить загрязняющие белки. После последней промывки, удалить супернатант. Примечание: В этот момент клетки спермы могут быть заморожены для дальнейшего использования.
  3. Солюбилизации белков с использованием 4% CHAPS, 2 М тиомочевины и 50 мМ Трис, рН 7,4 в течение 1 ч с прерывистым вортексе.
  4. После лизиса клеток, центрифуги (10000 XG, 20 мин), принять супернатант и перенести в новую пробирку. Примечание: В этот момент белок количественное может быть выполнена.

6. дисульфид Снижение Бонд и Алкилирование

  1. Добавить 10 мМ DTT в конечной концентрации, чтобы лизированных белков, VORTэкс и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Добавить 50 мМ idodoacetamide как конечной концентрации в лизата, вихря и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.

7. Осадки

  1. Метанол хлороформ осаждения образца путем добавления 1 объем лизата (400 мкл в качестве примера), добавить один объем (400 мкл) в метаноле и 0,5 объема (200 мкл) в хлороформе.
  2. Vortex образец и спина (10000 мкг, 2 мин).
  3. Обратите внимание, что две фазы появятся После центрифугирования. Отменить все, но 2 мм верхнего слоя (будьте осторожны, чтобы не нарушить интерфейс).
  4. Добавить 1 объем (400 мкл) в метаноле, инвертный трубки осторожно перемешать 1-2X и снова вращаться (10000 мкг, 15 мин). Удалите супернатант для отходов и воздуха сухой осадок в течение 3-4 мин.

8. Трипсин Пищеварение

  1. Развести трипсин в 25 мМ бикарбоната аммония, содержащего 1 М мочевину в соотношении 50: 1 (вес / вес; белков: трипсина) и инкубировали ÖVErnight при 37 ° С, предпочтительно при 700 оборотах в минуту на термомиксер.
  2. Спин (10000 мкг, 15 мин) для осаждения непереваренной материала. Трансфер супернатант в новую пробирку.

9. Phosphopeptide Обогащение

  1. Выполнение очистки и обогащение фосфопептидов от расщепления трипсином, как описано выше 18. Развести триптических пептидов в 10 раз в буфере DHB [DHB буфера состоит из: 350 мг / мл 2,5 dihydrobenzesulfonic кислоты (DHB), 80% (об / об) ACN (ацетонитрил), 2% (об / об) ТФК (трифторуксусной кислота)] и относятся к сухому TiO 2 бусины (200 мкг).
  2. Оставьте на ротатор при комнатной температуре в течение 1 часа.
  3. Вымойте образца с DHB буфера, спина и удалить супернатант. Затем промыть образец три раза промывочным буфером [80% ACN (об / об), 2% ТФК (объем / объем)], чтобы удалить DHB.
  4. После окончательного отжима, непосредственно элюируют фосфопептидов использованием буфера для элюции при добавлении 25 мкл 2,5% -ного раствора гидроксида аммония в, рН ≥ 10,5 раствор. SПИН-код и удалить супернатант. Сразу нейтрализуют ~ 0,3 мкл муравьиной кислоты.

Representative Results

Качество результатов от любого протеомики анализа в значительной степени зависит от исходного материала. В современных МС, небольшие загрязнения в опытных препаратов легко взял. Поэтому, очень важно, в случае сперматозоида протеомики, выбрать метод, который дает очень чистый сперматозоидов. Как показано на рисунке 1, ретроградная обратной промывки используется для получения сперматозоидов из конского придатка. Это включает в себя cannulating семявыносящих протоков с PE труб, которая позволяет одним медленно применять давление воздуха из шприца прилагается. демонстрирует конского придатка вместе с семявыносящих протоков. Рисунок 1В крупным планом выстрел, как семявыносящих протоков связано, где канюля вводится. При этом, так, сперматозоиды выходят в свет в вырезанной конце одного трубочку от хвостового придатка яичка. Как показано на фиг.2А, сперматозоиды взяты из апекса регионах caudпридатки и всасывается в стеклянного капилляра в состоянии покоя (фиг.2В). Это имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными "плыть вверх" методам, не последним из которых является возможность производить phoshoproteomic анализ сперматозоидов до и после активации подвижности. Сперматозоиды могут быть высланы в средствах массовой информации по своему выбору. Рис 2С (левая сторона) показывает, как сперма смотреть сразу после изгнания в КДО СМИ. Многие из клеток слипаются вместе. Тем не менее, после 10 мин компетентность клеток показали, потому что они выплывают до однородности в раствор (рис 2С, правая часть клеток). С техникой обратной промывки имеет очень небольшое влияние на клетки спермы, мы получаем близко к 100% моторики и клетки быстро рассеяться в СМИ без внешнего повода. В типичном эксперименте обратной промывки, сперма оправился от Swiss-мышь содержитмежду 1-5 × 10 6 клеток. Это в значительной степени зависит от возраста животного и могут варьироваться в зависимости от различных штаммов мышей. В Норвегии крысы, мы, как правило, получить 200 х 10 6 сперматозоидов, ± 20%. Рисунок 2D представляет чистоту сперматозоидов, полученную из крысы конского придатка.

Кроме самого образца, один из главных вопросов, связанных с подготовкой образца выход трипсина пищеварения. Белок осадков играет важную роль не только в устранении нежелательных моющих средств и соли, оба из которых являются несовместимые с РС, но и в денатурирующих белки. Мы обнаружили, осаждение смесью метанол-хлороформ работать лучше. Мало того, что эта процедура сообщалось, чтобы осадить низкие обильные белки лучше, чем другие в том числе TCA осадков 19, но имеет дополнительные преимущества. После ТСА осадков, часто бывает необходимо скорректировать рН после приостановки ТСА гранул, которые могут оставаться довольнокислой. Несмотря на то, осажденный осадок TCA можно мыть в высоких органических растворов, чтобы удалить кислоту, это добавляет к образцу обработки и невоспроизводимости результатов. Неспособность нейтрализации кислоты может привести к ухудшению триптических пептидов выходами. Метанол-хлороформ осадков не только быстро, но не подкислить образец. Рисунок 3 иллюстрирует белка гранул, как правило, видно из 100 мкг образца между нижней и верхней границы раздела.

Выделение фосфопептидов может происходить в разными способами; Однако воспроизводимость зависит от того, как образец был обработан вплоть до этой стадии. Один из наиболее распространенных, развивающихся методов является TiO 2, изначально разработанный группой Мартина Ларсена 18,20,21. Хотя описано как процесс для использования в микроколонках, мы можем получить воспроизводимые данные с помощью пакетного хроматографии. Успех процесса в значительной степени зависит от буфера для элюции, который должен быть сумасшедшим е с правильной композиции; в противном случае фосфопептиды не элюируют вообще.

Воспроизводимость данных протокола и представитель от TiO 2, обогащенный фосфопептиды из конского придатка спермы в неподвижные (Рисунок 4 вверху) и подвижные (рис 4 внизу) государство, с м / з 650-670 можно увидеть. Мы показали, что это чрезвычайно воспроизводимые техники даже при использовании биологических повторяет 17. Синие полосы, возникающие с течением времени являются пептиды элюирующие из C18 нано-колонны в виде концентрации ацетонитрила увеличивается. Очевидно, что в подвижных населения (N = 3 показано, п = 8 обычно работают), есть пептид кластера, с моноизотопного массы вокруг диапазоне 651,5 Da, что полностью отсутствует в неподвижных диапазоне. Тандемной масс-спектрометрии затем используется, чтобы идентифицировать этот пептид.

546 / 51546fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1:. Катетеризации конского придатка яичка () Изображение конского придатка. Сам канюли выявляется вниз, чтобы выставить примерно 1-2 см от предварительно вытащил конца. Это вставляется в семявыносящих протоков с использованием тонких # 5watchmakers щипцами. (B) канюля удерживаются на месте путем привязывания тонкий шелк вокруг сегмента, содержащего оба семявыносящих протоков и канюли. С помощью мыши, примерно 2-3 мкл хвостовых придатка клеток и жидкости собирают в концентрации 1 × 10 6 / мл. Из крыс (показаны), приблизительно 30-40 мкл жидкости получены при подобных концентрациях.

Фиг.2
Рисунок 2: Стеклянная капиллярная используется для сбора компетентный придатка сперматозоидов. (А) один канальцев от вершины конского е pididymis изолирован и работает. Приблизительное положение, из которого это происходит, показано на рисунке. (В) В верхней части изображение показывает пустой стеклянной капиллярной трубки, а нижний показывает один из ранее самоочистку обратным потоком крысы. Там нет заражение крови и минимальное загрязнение эпителиальных клеток. (C) Как сперматозоиды еще в неразбавленном виде в придатке яичка жидкости, они еще не начали, чтобы активировать. Когда сперматозоиды изначально исключен в раствор КДО, они выходят в виде компактного "строка" (левая сторона). Компетенция клетки легко устанавливается, так как после 10 мин большую часть сперматозоидов плавать в раствор без какого-либо внешнего воздействия (правая сторона). (D) картина аликвоты хвостовых придатка клеток сразу же после их осталось плавать из демонстрирует чистоту клеток.

g3highres.jpg "/>
Рисунок 3:. Метанол-хлороформ осадков После сперматозоидов были солюбилизированного, растворимая фракция является смесью метанол-хлороформ осаждают обеспечить денатурации белков и удаления загрязняющих веществ. Белок осадок на границе раздела между метанол / воду и хлороформ фаз появляется. Верхний слой осторожно удалить, чтобы не нарушить эту таблетку. Это принято оставлять около 2-3 мм от верхней фазы, так как белок не теряется.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Типичный TiO 2 обогащенного профиль фосфопептид с использованием описанного протокола, хвостового придатка сперматозоидов выделяли в любом неподвижны (верхней, N = 3) или подвижные Америки (снизу, N = 3). Пептид кластер с моно-изотопного масс ~ 651,5 DПоказано, что присутствует в подвижных популяций, но полностью отсутствует в тех неподвижны (стрелка). Сравнения такого рода называют "свободной этикетки (МС основе)". Масса пептида и время удерживания затем используются для целевого соединения для тандемной масс-спектрометрии и идентификации белка, из которого пептид, производный.

Discussion

Критические шаги для успешного и воспроизводимого протеомного анализа сперматозоидов являются: 1) чистота исходного материала; 2) удаление нежелательных солей и моющих средств; 3) денатурации белков в их полном объеме с тем, чтобы позволить трипсина переварить высокий выход белков и 4) сведение к минимуму образец обработки, чтобы уменьшить потерю пептида.

Для того чтобы успешно обратной промывки конского придатка, важно, чтобы найти область, из которой сперматозоиды выйдет. В случае как крысы и мыши, это на вершине вогнутой области, в середине хвостовой части придатка (рис 2а). Если человек приходит в дальнейшем к семявыносящих протоков, обратной промывки проще и вероятность успеха, как правило, выше. Тем не менее, это происходит из-за потери чисел спермы. С другой стороны, если попытаться переместить более проксимально к корпусу, то количество давление, необходимое, чтобы подтолкнуть сперматозоидов обратно через epididymAl каналы часто настолько высока, что повреждение придатка неизбежно происходит.

Обратной промывки из придатка традиционно выполняется с использованием насыщенного водой минеральное масло и сбалансированный солевой раствор в самой шприца в качестве средства для удаления сперматозоидов 22-25. Обе процедуры являются потенциально проблематично из LC-MS. Во-первых, минерал, скорее всего, блокировать нано-C18 нано-столбцы, используемые в основном во всем мире для протеомики анализа и ухода должны быть приняты, чтобы никто не переносится в порядке. Если это происходит, то невозможно, чтобы продолжить, и образец, по существу, теряется. Эту проблему можно решить за счет использования КДО или других сбалансированных солевых растворов в шприц, однако, хотя это успешно, мы вскоре признано, что многие из сперматозоидов стать подвижными, как только раствор КДО вошел в контакт и смешивают с хвостового придатка клетки. Чтобы обойти эту проблему, мы просто с обратной промывкой сперматозоиды с воздухом. Мало того, что каченость сперматозоидов сравнима с методами на основе жидких, но количество совпадает.

Phosphoproteomics, пожалуй, один из немногих способов установить, какие сигнальные пути происходят в сперматозоидах после эякуляции. Одним из основных путей, которые мы исследуем это процесс капацитации. Сперматозоиды должны пройти "капацитации", прежде чем он способен связываться с яйцом. На практике это достигается в основном путем инкубации сперматозоидов в течение периода времени (40 мин мыши; крысы 1,5 ч; человек 3-24 ч) в растворе КДО с сывороточным альбумином. Ранее мы и другие показали роль киназ, участвующих в капацитации. Интересно, что удаление ПВА μ II производят мышей, сперматозоиды плавают спонтанно в пробирке, но не может пройти гиперактивацию 26. Последнее отличительной чертой капацитации, в результате чего изменить сперматозоиды их бассейн шаблон с высокой скоростью, низкой амплитуды, чтобы низкийскорость, высокая амплитуда частоты биений. Мы показали, ниже по течению киназ, участвующих в этом процессе, включают pp60-регулированию рынка ценных бумаг (SRC) 13,27 C-да 28 и С-ABL 14. Интересно, что ингибирование SRC останавливается капацитации-зависимой фосфорилирование тирозина 13. Тем не менее, это может быть преодолено с окадаевой кислоты, предполагая, что SRC не принимает непосредственного участия в общем начала фосфорилирования тирозина 29, но может регулировать фосфатазы 29. Проблема с использованием КДО в качестве средства, чтобы заставить сперматозоиды из придатка яичка является то, что после активации, мыши сперматозоиды только занимает приблизительно 40 минут, чтобы правомочным. Учитывая, что изоляция сперматозоидов может занять 5 мин / мыши и часто несколько мышей используются в эксперименте, то сперматозоиды будут находиться на разных стадиях зрелости в начале эксперимента. Чтобы преодолеть это давление воздуха может быть использован, чтобы подтолкнуть сперматозоидов из хвостовой придатка в стеклянную канюлю. Не только все Inact спермыив и, по сути, как они будут найдены в хвостовой среде, он позволяет сравнить неподвижные и подвижные phosphoproteomics.

Пример обработки для phosphoproteomics должно быть сведено к минимуму при сравнении сперматозоидов в двух разных функциональных состояниях. Использование метанола хлороформа по сравнению с другими традиционными методами осаждения белка 1) уменьшает потребность в дополнительных стадий промывки, 2) удаляет почти все следы солей и жиров и 3) имеет доказал свою способность к осаждению низкие белки обилие над ГТС 19. Белок осадков до трипсина пищеварения рекомендуется, так как не только делает эту помощь для денатурации белка (который помогает трипсин-переваривание), но снимает многие из MS-несовместимых метаболитов, присутствующих в клетке.

Сравнение спермы фосфопептидов может быть сделано в ряде направлений. На базовом уровне, простого сравнения выявленного фосфопептидом в одном образце того, в другомобразец в процессе, известном как "спектральной подсчета" может быть сделано. Однако критика была в таком подходе в основном тем, что ранние протеомные исследования с использованием низких повторов (более подробное обсуждение см Lundren и др. 30). Более сложный способ смотреть на интенсивность пептидной материнской массы и сравнить это с другими образцами (без наклеек сравнения). В примере, показанном на фиг.4, пептид отсутствует в от неподвижных (фиг.4 вверху), но присутствует в подвижных (фиг.4 снизу) сперматозоидов из м / г 650-670 могут быть видны. Этот процесс, называемый этикетки МС на основе свободного количественного стратегия этикетки свободной.

Альтернативной стратегией обычно используется, чтобы уменьшить количество трасс, необходимых для количественного протеомики заключается в использовании изотопов. Как масса изотопа отличается, масс-спектрометр может быть использован для сравнения интенсивности в Elutчисле пептидов. Тем не менее, в отличие от большинства других типов клеток, некоторые изотопной метки не могут быть применены к сперматозоидов. Например, добавление стабильных изотопов (один тяжелый изотоп будет добавлен в одном образце, в то время как более легкий вариант будет добавлен к другому) могут быть использованы в культуре ткани. При изотопы получают включены в белка, анализ протеомики могут быть выполнены с помощью комбинирования двух образцов (мультиплексирования). Тем не менее, в случае сперматозоидов, это не может быть сделано, просто в силу того, что 1) изотопной метки требуется несколько проходов (до 8) в культуре ткани и 2) клетки спермы не имеет ядерного транскрипцию генов и перевод, и, следовательно, они не могут включать изотопов во всех их белка в любом случае. Один из способов обойти это заказать меченые мышей, однако, они, как известно, дорого. Альтернативный подход состоит в использовании химическую метку. Это было сделано, когда не-капаситированных мышей по сравнению с капаситированных мышей. В этом случае, D 0 и D 31. Другие подходы могут включать в себя использование iTRAQ (изобарической тега для относительного и абсолютного количественного), в результате чего остатки лизина помечены в химическую реакцию с различными массовыми изотопов; ICAT (изотоп закодированы аффинная метка), причем цистеина помечены различными массовых изотопов и тяжелой и легкой маркировки воды.

В каждом конкретном случае, однако, одна вещь, нужно иметь в виду,. MS сообщает только то, что присутствует в образце, и это отражение всего, что случилось с этим дискретизации до этой точки. Минимизация обработки образца при максимальном выход на каждом шаге необходимо для успешного протеомики анализа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75, (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10, (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69, (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics