Phosphopeptide Analyse av gnagere bitestiklenes Spermatozoa

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sædceller er ganske unik blant celletyper. Selv produsert i testiklene, er begge atom gentranskripsjon og oversettelse slått av når den pre-markøren runde celle begynner å forlenge og differensiere til hva som er morfologisk anerkjent som en spermatozoon. Imidlertid er spermatozoon veldig umoden, har ingen mulighet for motilitet eller egg anerkjennelse. Begge disse hendelsene oppstår når sædceller transitt en sekundær organ kalt bitestikkelen. I løpet av ~ 12 dagers passasje at det tar for en sædcelle å passere gjennom bitestikkelen, post-translasjonelle modifikasjoner av eksisterende proteiner spiller en sentral rolle i modningen av cellen. En viktig fasett av slikt er protein fosforylering. For å karakter fosforyleringsseter arrangementer som finner sted i løpet av sperm modning, må etableres både rene sperm celle populasjoner og pre-fraksjonering av fosforpeptidene. Ved hjelp tilbake spyleteknikk, en fremgangsmåte for isolering av rene spermatozoer of høy kvalitet og utbytte fra de fjerne eller caudal bitestiklene er skissert. Trinnene for oppløseliggjøring, fordøyelsen, og pre-fraksjonering av sperm fosforpeptidene gjennom TiO 2 affinitetskromatografering blir forklart. Når isolert, kan fosfor injiseres til MS for å identifisere både proteinfosforylering hendelser på spesifikke aminosyrerester og kvantifisere nivåene av fosforylering finner sted i løpet av sperm modningsprosesser.

Introduction

Etter å ha kommet ut av testiklene, er spermatozoer sterkt differensiert ennå bemerkelsesverdig, disse celler er umodne 1,2. Som sådan, de mangler fullstendig funksjonalitet, inkludert muligheten til å svømme og binder seg til en eggcelle tre. Selv om videre modning av sædcelle er nødvendig, kan dette ikke skje via kanoniske ruter, da på dette trinn av deres celledifferensiering prosessen, er de ute av stand til gentranskripsjon og ytterligere protein biosyntesen 4. Biologisk kompetanse er overdratt til sædceller som de forlater testis og angi en del av den mannlige reproduktive system kjent som bitestikkelen 5. Bitestikkelen er en tett sammenrullet, svært differensiert røret som forbinder de efferente kanalene (i testiklene) til sædlederen og er til stede i alle mannlige pattedyr 6. Sædceller gradvis overta deres gjødsling potensial under epididymal nedstigningen, avhengig av stadig skiftende luminal miljø som er crflere ganger av de lokale bitestiklenes epitelceller 7. De ulike sekretorisk og re-absorberende aktiviteter stede i epididymal miljøet handle for å endre sperm selv, endre protein, karbohydrat og lipid sammensetning 6. Betydningen av bitestikkelen, spesielt den første 'caput' regionen i denne strukturen er eksemplifisert ved hjelp av kirurgiske ligation teknikker 8. Sædceller beholdes i testikkel av efferent duct ligation er helt mangler i noen kapasitet til å befrukte egget 9-11.

I tillegg til den epididymal miljø, for å signaltransduksjonsveier innenfor spermatozoa arbeidet post-translasjonelt modifisere eksisterende sædcelle komplement. For eksempel, sædceller fra tidlig regioner i bitestikkelen vise ulike mønstre av protein fosforylering sammenlignet med de sistnevnte regioner 5,12. Dette er ikke overraskende siden det er store forskjeller i capability av sperm fra disse regionene. For eksempel, sædceller fra tidlig, caput bitestikkelen er immotilite. I kontrast, vil sædceller fra cauda regionen gjennomgå fremover progressiv motilitet gang plassert i isotonisk medium. Siden epididymal sædceller er ute av stand de-novo protein biosyntese, må alle de iboende trasé som regulerer sperm funksjon være gjennom post-translasjonelle modifikasjoner (PTM). Derfor står det til grunn at proteomikk, og spesielt etterforskningen av PTMs som fosforylering må være en stor skyvekraft hvis vi skal forstå sædcelle modning.

En alternativ metode for å skaffe sædceller fra epididymidies å bruke retrotilbakespyling 13-16. Selv om denne teknikken er sikkert mer tidkrevende og tar en større grad av dyktighet av operatøren, spermatozoa oppnådd konsekvent vise renhet på mer enn 99,99%. I tillegg, i motsetning til alle de andre teknikker, spermatozoer ca.n isoleres i en hviletilstand, slik at det er mulig å studere hvordan sperm motilitet initieres. Som prøveopparbeidelse er det viktigste aspektet for proteomikk analyse, har isolering av sædceller blitt en av de viktigste aspektene av sperm-proteomikk studier. Denne protokollen gir en forklaring på hvordan sædceller er isolert fra cauda bitestikkel. Etter dette er TiO 2 phosphopeptide anrikningsfremgangsmåte skissert, med spesifikk referanse på hvordan du kan hente peptider fra de svært differensierte sædceller. MS tilnærming kan brukes til å skille skiftende fosforpeptidene hvis man skulle sammenligne hale epididymal sædceller i en stat (immotile eller ikke-capacitated) til en annen (motile, capacitated, acrosome reagerte, etc.) gjør dette til en kraftig tilnærming for å studere sperm funksjon.

Protocol

1. Utarbeidelse av Kultur Media og Retter

  1. Gjør 200 ml Biggers Whitten og Whitten (BWW) 17 arbeidsløsning ved tilsetning av 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl2, 0,162 g H 2 KO 4 P, og 0,294 g MgSO 4 til 1 L av Milli-Q-vann . Dette er stamløsningen og kan oppbevares ved 4 ° C i opp til en måned.
  2. Fra stamløsning, tilsett 420 mg NaHCO3 -, 200 mg glukose, 6 mg natriumpyruvat, 600 mg bovint serumalbumin, 0,74 ml natriumlaktat, og 4,0 ml HEPES-buffer til 193 ml av BWW lager. Dette er en arbeidsløsning og er alltid gjort frisk på dagen og ekvilibrert til 37 ° C før bruk.
  3. For å gjøre kanylen, kan polyetylen (PE) rør med en indre diameter på 0,4 mm og en ytre diameter på 1,1 mm og holder over lav varme (typisk metanol flamme), slik at røret begynner å smelte. Trekk umiddelbart slangen outward å strekke og gjøre den ytre diameter smalere.
  4. Snitt for å frembringe en innsnevring av den ene ende, som gir enklere kanylering av vas deferens.
  5. Skjær den andre enden av kanylen til ca. 15 cm. Sett en 30 G nål inn den butte enden, og legge ved en 3 ml sprøyte til det (helt inntrukket).
  6. Foreta en sugemunnstykket ved å kutte en 20 cm lengde av PE-rør (4,2 mm indre diameter, 6,4 mm ytre diameter). Sett et talerør inn i den ene enden.
  7. Sett inn mikro-kapillær glassrørholder og glass mikro-kapillær selv (typisk 3 mL for en mus, 40 mL for en rotte).

2. Fjerning av bitestiklene fra Mouse

  1. Avlive mus ifølge IACUC-godkjente prosedyrer som er spesifikke for den enkelte institusjon.
  2. Ta dyret og lage et lite snitt i pungen for å avsløre bitestikkelen. Trekk testikkel og bitestikkel ut av hulrommet ved hjelp av et par urmakeri # 5 tang.
  3. Skjær sædlederen slik at minst 1-2 cm forbli festet til cauda bitestikkelen. I tillegg kuttet de proksimale efferente kanaler og vev som kobler bitestikkelen til testis og fjerne hele mannlige reproduktive spor.
  4. Plasser hele den mannlige reproduktive spor under et disseksjonsmikroskop med et forstørrelsesområde i størrelsesorden 5-40X.

3. kanylerør bitestikkelen

  1. Tape nedover kanyle til mikroskopet, slik som 1-2 cm av det innsnevrede (kjegleformet) ende er fri og er synlig gjennom linsen.
  2. Ta et par urmakeri # 5 tang og forsiktig lås hver side av sædlederen og trekke sædlederen på kanylen, slik at kanylen går inn sædlederen.
  3. Ta en lengde på ikke-absorberbare svart flettet behandlet silke (størrelse 5-0) og knyt en knute rundt kannulerte sædlederen. Sikre knuten er trukket stramt for å holde kanylen inne sædlederen når lufttrykket from sprøyten er brukt.

4. Retrograde eller Tilbakespyling av Caudal bitestiklenes Spermatozoa

  1. Ved hjelp av urmakere # 5 pinsett, ta tak i distal ende av cauda bitestiklene og fjerne tunica albuginea for å avsløre en enkelt epididymal tubule.
  2. Ved hjelp av pinsett, trekke forsiktig tubule ut til å avsløre og deretter erte hverandre slik som å lage en åpning for sædcellene å bli utgitt.
  3. Trykk forsiktig på de 3 ml (mus) eller 20 ml (rotte) sprøyte slik som å drive ut luft fra sprøyten inn sædlederen. Ved passende trykk, vil spermatozoer begynne å sakte komme ut av den ødelagte tubuli ved den distale ende av cauda epididymis. På dette tidspunkt anvende suging på munnstykket for å trekke spermatozoer i glasset kapillar. Merk: Typisk i en mus, kan oppnås 2-3 ul av spermatozoer avhengig av alderen til dyret. En rotte vilje, på gjennomsnittlig yield 30-40 mikroliter.

5. Vaskeog Lysing den Sædceller i Forberedelse for proteomikk

  1. Utvise sædceller fra glasskapillært inn i 1 ml oppløsning av BWW oppløsning (37 ° C) ved forsiktig å blåse inn i munnstykket eller festing av en sprøyte og utstøter luft for derved å presse spermatozoa tilbake ut av kapillaren.
  2. Når sædcellene er diffust, vaske 3x (300 xg, 5 min) med 1 ml BWW å fjerne forurensende proteiner. Etter den siste vaskingen, fjern supernatanten. Merk: På dette punktet, kan sædcellene fryses for senere bruk.
  3. Solubilisere proteiner ved anvendelse av 4% CHAPS, 2 M tiourea, og 50 mM Tris, pH 7,4 i 1 time med intermitterende virvling.
  4. Etter lysering av cellene, sentrifuge (10 000 xg, 20 min), supernatanten ta og overføre til et nytt rør. Merk: På dette punktet, kan protein kvantifisering utføres.

6. Disulfide Bond Reduksjon og Alkylering

  1. Tilsett 10 mM DTT som en sluttkonsentrasjon på lyserte proteiner, vortex og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
  2. Tilsett 50 mM idodoacetamide som en sluttkonsentrasjon på lysat, vortex og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter i mørket.

7. Nedbør

  1. Metanol kloroform utfelles prøven ved å tilsette 1 volum av lysat (400 ul som et eksempel), legge til et volum (400 ul) av metanol og 0,5 volum (200 pl) kloroform.
  2. Vortex prøven og spinn (10 000 xg, 2 min).
  3. Legg merke til at to faser vises etter sentrifugering. Forkaste alle, men 2 mm av det øverste laget (være forsiktig for ikke å forstyrre grensesnittet).
  4. Tilsett 1 volum (400 ul) av metanol, forsiktig 1-2x invert rør for å blande og igjen spinner (10 000 xg, 15 min). Kast supernatant til avfall og lufttørke pellet for 3-4 min.

8. Trypsin Fordøyelse

  1. Rekonstituere trypsin i 25 mM ammoniumbikarbonat som inneholdt 1 M urea til et forhold på 50: 1 (vekt / vekt; protein: trypsin) og inkubert overnight ved 37 ° C, fortrinnsvis ved 700 rpm på en termomikser.
  2. Sentrifugering (10 000 xg, 15 min) for å pelletere ufordøyd materiale. Overfør supernatanten til ny tube.

9. Phosphopeptide Enrichment

  1. Utføre rensing og berikelse av fosforpeptidene fra tryptiske fordøye som tidligere beskrevet 18. Fortynn tryptiske peptider 10-fold i DHB buffer [DHB-buffer består av: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic syre (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitril), 2% (v / v) TFA (trifluoreddiksyre syre)], og gjelder for tørke TiO 2 perler (200 mikrogram).
  2. La på en rotator ved romtemperatur i 1 time.
  3. Vask prøven med DHB buffer, spinne og fjerne supernatant. Deretter vaskes prøven tre ganger med vaskebuffer [80% ACN (v / v), 2% TFA (v / v)] for å fjerne DHB.
  4. Etter sentrifugering, direkte eluere fosforpeptidene ved hjelp av elueringsbuffer ved tilsetning av 25 ul av en 2,5% ammoniumhydroksid, pH ≥ 10.5 løsning. Spin og fjern supernatanten. Umiddelbart nøytralisere med ~ 0,3 ul maursyre.

Representative Results

Kvaliteten av resultatene fra en hvilken som helst proteomikk analyse er sterkt avhengig av utgangsmaterialet. Med moderne MS, er små forurensninger i eksempel forberedelser lett plukket opp. Derfor er det viktig, i tilfelle av spermcelle proteomforskning, å velge en metode som gir meget rent spermatozoer. Som illustrert i figur 1, er retrograd tilbakespyling benyttes til å hente sædceller fra cauda epididymis. Dette innebærer kanylerør sædlederen med PE rør som tillater en å sakte gjelder lufttrykket fra sprøyten vedlagt. Figur 1A demonstrerer cauda bitestikkelen sammen med sædlederen. Figur 1B er et nærbilde skutt av hvordan sædlederen er bundet der føres inn. Ved å gjøre, så er sædceller utgitt på utskårede slutten av ett tubule fra hale bitestiklene. Som vist i figur 2A, er spermatozoa ekstrahert fra topp regioner av cauden bitestikkel og blir sugd opp i et glass kapillær i en hvilende tilstand (figur 2B). Dette har flere fordeler i forhold til tradisjonelle "svømme-up" metoder, ikke minst som er evnen til å utføre en phoshoproteomic analyse av sædceller før og etter aktivering av motilitet. Den sædceller kan deretter bli utvist i media av ens valg. Figur 2C (venstre side) demonstrerer hvordan sæden ser umiddelbart etter utvisning til BWW media. Mange av cellene har klumpet seg sammen. Men etter 10 min kompetanse cellene demonstrert fordi de svømmer ut til homogenitet i løsningen (Figur 2C, høyre side celler). Siden tilbakespyling teknikken har svært liten innvirkning på sædcellene, vi får nær 100% motilitet og cellene spre seg raskt inn i media uten ytre provokasjon. I en typisk tilbakespyling eksperiment, sperm utvinnes fra Swiss-mus inneholdermellom 1-5 x 10 6 celler. Dette er i høy grad avhengig av alderen til dyret, og kan variere fra forskjellige stammer av mus. I en norsk Rat, vi vanligvis skaffe 200 x 10 6 sædceller, ± 20%. Figur 2D representerer renhet av sædceller hentet fra rotte cauda bitestikkelen.

Foruten selve prøven, en av de store spørsmålene om prøveopparbeidelse er utbyttet av trypsin fordøyelsen. Proteinutfelling spiller en viktig rolle, ikke bare i å fjerne uønskede vaskemidler og salter, som begge er uforenlig med MS, men også denaturere proteiner. Vi har funnet metanolkloroform nedbør å fungere best. Ikke bare har denne fremgangsmåten er rapportert å utfelle lave rikelig proteiner bedre enn andre, inkludert TCA-utfelling 19, men den har flere fordeler. Etter TCA-utfelling, er det ofte nødvendig å justere pH-verdien etter at suspensjonen av TCA pellet som kan forbli ganskesyrlig. Selv om utfelt pellet av TCA kan vaskes i høye organiske løsninger for å fjerne syre, legger dette til å smake håndtering og ureproduserbarhet av resultater. Unnlatelse av å nøytralisere syren vil resultere i fattige tryptiske peptid avkastning. Metanol-kloroform utfelling er ikke bare raskt, men vil ikke surgjøre prøven. Figur 3 illustrerer protein pellet typisk sett av 100 ug av prøven mellom de nedre og øvre mellomfase.

Isoleringen av fosforpeptidene kan forekomme på en rekke måter; men reproduserbarhet avhenger av hvordan prøven er håndtert frem til og med dette stadiet. En av de mer vanlige, utvikle metoder er TiO 2, opprinnelig utviklet av gruppen av Martin Larsen 18,20,21. Selv om beskrevet som en prosess for å bruke i microcolumns, kan vi få reproduserbare data ved hjelp av batch kromatografi. Suksessen av prosessen er sterkt avhengig av elueringsbuffer, må som være gal e med den riktige sammensetning; ellers fosforpeptidene ikke elueres i det hele tatt.

Reproduserbarheten av protokollen og representative data fra TiO 2 beriket fosforpeptidene fra cauda epididymal sperm i en ikke-bevegelige (figur 4 øverst) og bevegelige (figur 4 nederst) state fra m / kan z 650-670 bli sett. Vi har vist at dette er en svært reproduserbar teknikk selv ved bruk av biologiske replikater 17. De blå striper som opptrer over tid er peptider som eluerte fra en C18 nano-kolonne som den konsentrasjon av acetonitril øker. Åpenbart i motile populasjonen (n = 3 er vist, n = 8 typisk kjøre), det er et peptid klynge, med en monoisotopic masse rundt 651,5 Da området som er fullstendig fraværende i de ikke-motile rekkevidde. Tandem massespektrometri blir så brukt til å identifisere dette peptid.

546 / 51546fig1highres.jpg "/>
Figur 1:. Kanylering av cauda bitestikkelen (A) Bilde av cauda bitestikkel. Kanylen i seg selv er tapet ned for å eksponere omkring 1-2 cm av det pre-trukket ende. Dette føres inn i sædlederen hjelp av gode # 5watchmakers tang. (B) Kanylen blir holdt på plass ved å knytte silke rundt et segment som inneholder både sædlederen og kanylen. Fra mus, er ca. 2-3 ul av caudal bitestiklenes celler og væske samles i en konsentrasjon på 1 x 10 6 / ul. Fra rotte (vist), er ca 30-40 mikroliter væske oppnådd ved tilsvarende konsentrasjoner.

Figur 2
Figur 2: Glass kapillær brukes til å samle kompetent epididymal sædceller. (A) En tubule fra toppen av cauda e pididymis er isolert og ødelagt. Den omtrentlige posisjon fra hvilken dette skjer er vist. (B) Toppen av bildet viser en tom glass kapillarrør og nedentil har en fra en tidligere tilbakespyles rotte. Det er ingen blodsøl og minimal epitelcelle forurensning. (C) Som sædceller er fortsatt ufortynnet i epididymal væske, har de ikke begynt å aktivere. Når sædceller blir først utvist inn en BWW løsning, de kommer ut som en kompakt "streng" (venstre side). Kompetansen av cellen er lett etablert, siden etter 10 min mesteparten av sædceller svømmer inn løsning uten ytre forstyrrelser (høyre side). (D) Et bilde av en delmengde av caudal bitestiklenes celler umiddelbart etter at de har blitt liggende å svømme ut demonstrerer renheten til cellene.

g3highres.jpg "/>
Fig. 3: Metanol-kloroform utfelling Når spermatozoa har blitt oppløst, er den løselige fraksjon metanol-kloroform utfelt å sikre denaturering av proteinene og fjerning av forurensende stoffer. Proteinet pellet vises på grenseflaten mellom metanol / vann og kloroform-faser. Det øverste laget fjernes forsiktig for ikke å forstyrre denne pellet. Det er vanlig å la ca 2-3 mm fra den øvre fase, slik som ikke-protein er tapt.

Figur 4
Figur 4:. Typisk TiO 2 -anriket phosphopeptide profil Bruke beskrevet protokollen, ble Caudal epididymal sædceller isolert i enten immotile (topp, N = 3) eller bevegelige stater (nederst, N = 3). Et peptid klynge med en mono-isotoper masse av ~ 651,5 Den er vist å være til stede i de bevegelige populasjoner, men helt fraværende i de immotile de (pil). Sammenligninger av denne art er omtalt som "label-fri (MS-basert)". Peptidet masse og retensjonstid blir så brukt til å målrette forbindelsen til tandem-massespektrometri og identifisere proteinet hvorfra peptidet er avledet.

Discussion

De kritiske trinn for en vellykket og reproduserbar proteomikk analyse av spermatozoer er: 1) renheten av utgangsmaterialet; 2) fjerning av uønskede salter og vaskemidler; 3) å denaturere proteiner i sin fulle utstrekning, slik som å tillate trypsin å fordøye et høyt utbytte av proteiner, og 4) å minimalisere håndtering av prøver for å redusere tap av peptid.

For å kunne tilbakespyle cauda bitestikkelen, er det viktig å finne området hvorfra sædceller vil avslutte. I tilfellet med både rotte og mus, er dette på toppen av det konkave område, i midten av kaudal region av epididymis (se figur 2A). Hvis man kommer videre mot sædlederen, er tilbakespyling enklere og suksessraten er generelt høyere. Men kommer dette til tap av spermtall. Alternativt, hvis man forsøker å bevege seg mer proksimalt til corpus, da mengden av trykk som er nødvendig for å skyve spermatozoa tilbake gjennom epididymal kanaler er ofte så høy, at skader på bitestikkelen uunngåelig oppstår.

Tilbakespyling av epididymis er tradisjonelt utført ved hjelp av vannmettet mineralolje og en balansert saltoppløsning i sprøyten i seg selv som et medium for å fjerne spermatozoa 22-25. Begge fremgangsmåter er potensielt problematisk av LC-MS. For det første, er mineral sannsynlig å blokkere nano-C18 nano-kolonner som er utgangspunktet brukes over hele verden for proteomikk analyse og omsorg må tas slik at ingen blir båret frem i prosedyren. Hvis dette skjer, er det umulig å fortsette og prøven i det vesentlige tapt. Dette kan overvinnes ved bruk av BWW eller andre balanserte saltoppløsninger i sprøyten, men selv om dette er vellykket, vi snart klar over at mange av spermatozoa bli motile så snart BWW løsning kom i kontakt og blandes med hale epididymal celler. For å omgå dette problemet vi rett og slett tilbakespyle den sædceller med luft. Ikke bare er den qualligheten av spermatozoer sammenlignbar med væskebaserte metoder, men antallet er identiske.

Phosphoproteomics er kanskje en av de eneste måtene å etablere hvilke signalveier er forekommende i sædceller etter utløsning. En av de store trasé Vi undersøker er prosessen med capacitation. Spermatozoer må gjennomgå "capacitation" før det er i stand til å binde til et egg. I praksis oppnås dette i hovedsak ved inkubering av spermatozoer for en tidsperiode (40 min mus, rotte 1,5 timer, human 3-24 timer) i BWW løsning med serum-albumin. Tidligere har vi og andre vist en rolle i flere kinaser som er involvert i capacitation. Av interesse, sletting av PKA μ II produsere mus som sædceller svømmer spontant in vitro, men kan ikke gjennomgå hyperaktive 26. Sistnevnte er et kjennetegn på capacitation, der sædceller endre sin svømmemønster fra en høy hastighet, lav amplitude, til en lavhastighet, høy amplitude slå frekvens. Vi har vist nedstrøms kinaser involvert i denne prosessen inkluderer pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-ja 28 og c-ABL 14. Interessant, inhibering av SRC stopper capacitation avhengig tyrosinfosforylering 13. Dette kan imidlertid overvinnes med okadainsyre, noe som tyder på at SRC ikke er direkte involvert i den generelle utbruddet av tyrosinfosforylering 29, men kan regulere en fosfatase 29. Problemet med å bruke BWW som et medium for å tvinge sædceller ut av bitestikkelen er at når aktivert, mus sædceller bare ta ca 40 min å capacitate. Gitt at isolering av spermatozoer kan ta 5 min / mus, og ofte flere mus blir brukt i et eksperiment, og spermatozoer vil være på forskjellige stadier av modenhet ved starten av forsøket. For å overvinne dette, kan lufttrykket kan brukes til å skyve sædceller fra hale epididymis i et glass kanyle. Ikke bare er alle sperm inaktivive og i hovedsak som de ville bli funnet i hale miljøet, det gjør det mulig å sammenligne ikke-bevegelige og bevegelige phosphoproteomics.

Håndtering av prøver til phosphoproteomics bør holdes til et minimum når man sammenligner sædceller i to ulike funksjonelle tilstander. Bruken av metanol kloroform i løpet av andre tradisjonelle metoder for proteinutfelling 1) minsker behovet for ekstra vasketrinn, 2) fjerner nesten alle spor av salter og fettsyrer, og 3) har vist evne til å utfelle lav overflod proteiner i løpet av TCA 19. Protein nedbør før trypsin fordøyelsen anbefales siden ikke bare er dette bidra til å denaturere proteiner (som hjelpemidler trypsin fordøyelsen), men fjerner mange av de MS-inkompatible metabolitter stede i cellen.

Sammenligningen av sperm fosforpeptidene kan gjøres på en rekke måter. På det grunnleggende nivå, en enkel sammenligning av de identifiserte phosphopeptide i en prøve, som i en annenPrøven i fremgangsmåten kjent som "spektral telling" kan gjøres. Men kritikken har vært på denne tilnærmingen i utgangspunktet fordi tidlige proteomikk studier brukte lave replikater (for en fyldigere diskusjon se Lundren et al. 30). En mer avansert metode er å se på intensiteten av peptidet opphavs-massen, og sammenligne dette med de andre prøver (label fritt sammenligning). I eksempelet vist i figur 4, kan et peptid fraværende fra det fra ikke-motile (figur 4 øverst), men er tilstede i motile (figur 4 nederst) spermatozoer fra m / z 650 til 670 ses. Denne prosess, som kalles MS-baserte label free kvantifisering er en etikett fritt strategi.

En alternativ strategi som vanligvis brukes for å redusere mengden av kjøringer som kreves for proteomikk kvantifisering er å bruke isotoper. Ettersom massen av en isotop er forskjellige, kan massespektrometer brukes til å sammenligne intensitetene av Eluting peptider. Men i motsetning til de fleste andre celletyper, noen isotoper merking kan ikke brukes til sædceller. For eksempel, tilsetning av stabile isotoper (en tung isotop blir tilsatt til en prøve, mens et lettere versjon blir overført til en annen) kan brukes i vevskultur. Når isotoper blir innlemmet i proteinet, kan et proteomforskning analyse utføres ved å kombinere de to prøvene (multipleksing). Men i tilfelle av spermatozoer, kan dette ikke gjøres, ganske enkelt på grunn av det faktum at 1) isotop merking krever flere passeringer (opp til 8) i vevskultur og 2) sædcellene har ingen atom gen transkripsjon og translasjon, og dermed de kan ikke innlemme isotoper i all sin protein uansett. En måte å omgå dette på er å bestille radiomerkede mus, men disse er som kjent dyrt. En alternativ metode er å bruke en kjemisk tag. Dette har blitt gjort når ikke-capacitated mus ble sammenlignet med capacitated mus. I dette tilfellet er en D 0 og D 31. Andre metoder kan omfatte bruken av iTRAQ (isobar tag for relativ og absolutt kvantifisering), hvorved lysiner er merket kjemisk med forskjellige masse isotoper; ICAT (isotop kodet affinitetsmarkør) der cysteiner er merket med ulike masse isotoper og tunge og lette vannmerking.

I hvert enkelt tilfelle, men trenger en ting å være oppmerksom på. MS bare rapporterer hva som er til stede i en prøve, og dette er en refleksjon av alt som har skjedd med den prøven opp til det punktet. Minimere prøvehåndtering samtidig maksimere avkastningen på hvert trinn er nødvendig for en vellykket proteomikk analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75, (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10, (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69, (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics