ब्रेट परे एक कदम: अपार उत्तेजना प्रतिदीप्ति Luminescence से (ईंधन)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
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Bioengineering
 

Summary

प्रासंगिक सिद्धांतों के सर्वेक्षण और fluorophores और एंटीबॉडी लक्षित स्थितियों की एक भीड़ के साथ अपनी संगतता का प्रदर्शन करके luminescence (ईंधन) से अनबाउंड उत्तेजना से प्रतिदीप्ति की नींव और प्रयोज्यता विस्तार.

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Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

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Abstract

Luminescence (ईंधन) से अनबाउंड उत्तेजना प्रतिदीप्ति इन विट्रो और इन विवो में वृद्धि के संकेत और विपरीत वृद्धि का उत्पादन एक विकिरणवाला उत्तेजना उत्सर्जन प्रक्रिया है. Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट), अभी तक के रूप में ही अंतर्निहित सिद्धांतों के कई ईंधन के शेयरों में काफी luminescent स्रोत और फ्लोरोसेंट इकाई के बीच स्वीकार्य काम दूरी में अलग है. ब्रेट प्रभावी रूप से 2 बार फोरस्टर त्रिज्या, आमतौर पर कम से कम 14 एनएम का अधिकतम करने के लिए सीमित है, ईंधन एक ऑप्टिकल अवशोषक के अभाव में माइक्रोन की दूरी पर या यहाँ तक कि सेमी हो सकता है. यहाँ हम घटना के पीछे प्रासंगिक सिद्धांतों की समीक्षा करके ईंधन की नींव और प्रयोज्यता पर विस्तार और fluorophores और फ्लोरोसेंट नैनोकणों की एक विस्तृत विविधता के साथ अपनी संगतता प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, एंटीबॉडी लक्षित ईंधन की उपयोगिता का पता लगाया है. यहाँ दिखाए गए उदाहरण ईंधन Appl के लिए उपयोग किया जा सकता है कि सबूत प्रदानब्रेट ब्रेट और पारंपरिक पूरे पशु इमेजिंग के बीच मौजूद है कि स्थानिक शून्य को भरना संभव नहीं है, जहां ications.

Introduction

ऐसे वायरस 1, 2, बैक्टीरिया 3, या छोटे स्तनपायी जीवों की आनुवंशिक संशोधन 4 प्रेरित या अनिवार्यता से एक्सप्रेस bioluminescence या तो अत्यधिक सफल रहा है और व्यापक रूप से 5-7 का प्रदर्शन किया है. Bioluminescence, स्वाभाविक रूप से अभिकर्मकों शामिल vivo में chemiluminescent प्रतिक्रिया, एक बाहरी प्रकाश स्रोत की आवश्यकता के बिना प्रकाश उत्पादन का लाभ दिया है. जैसे, bioluminescent इमेजिंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग 8 से मिला ऑटो और गैर विशिष्ट संकेत के आम कमियों से ग्रस्त नहीं है. किसी भी पता चला संकेत इरादा स्रोत से केवल निकलती बाद नतीजतन, bioluminescence एक महत्वपूर्ण संकेत करने वाली शोर अनुपात है. कई मॉडल में इन विट्रो और इन विवो अनुप्रयोगों 9 में लिए Photorhabdus luminescens से लक्स operon (480 और 490 एनएम के बीच केंद्रित उत्सर्जन अधिकतम) का शोषण किया है, वहीं छोटे mamm में इसके उपयोगए एल एस के कारण इमेजिंग शर्तों के बहुत ही प्रकृति के लिए समस्याग्रस्त किया गया है; ऑप्टिकल ऐसे हीमोग्लोबिन के रूप में अवशोषक,, और इस तरह के ऊतक और हड्डी के रूप में बिखरने एजेंटों, सर्वव्यापी अस्तित्व, दृढ़ता से पीले रंग तरंग दैर्ध्य से 3 नीले प्रभावित करते हैं. एक इंजीनियर जुगनू luciferase (उत्सर्जन अधिकतम 617nm पर) की अभिव्यक्ति हाल ही में बहुत ऑप्टिकल अवशोषण 10 पर काबू, लेकिन अभी भी प्रभाव बिखरने के अधीन है कि एक उपकरण प्रदान करने, विकसित और शामिल किया गया है.

जवाब में, लाल शिफ्ट bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) 11-13 का उपयोग कर, 650-900 एनएम, कम से कम अवशोषण और बिखराव का एक क्षेत्र के वांछित ऑप्टिकल खिड़की में उत्सर्जित संकेत करने के कई प्रयास किए गए हैं. संकेत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए एक उपकरण के रूप में, स्वीकर्ता के रूप में दाता और एक जोड़ा fluorophore के रूप में एक bioluminescent स्रोत का उपयोग करता है जो ब्रेट, सीमित सफलता मिल गई है. इस घटना के एक लाभदायक उदाहरण, "आत्म रोशन क्वांटम डॉट्स के रूप में4; (SIQDs) 14 से मिलकर Renilla बाहरी बहुलक लाइसिन परत करने के लिए बाध्य luciferases reniformis संशोधित के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्वांटम डॉट्स (QDs). सब्सट्रेट अलावा पर, जिसके परिणामस्वरूप bioluminescent प्रतिक्रिया लाल फोटॉनों की एक महत्वपूर्ण उत्पादन पैदा करने, QDs से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन लाती है. हालांकि, इन SIQDs physiologically प्रासंगिक घटनाओं के विवो दृश्य में करने के लिए प्रयोज्यता सीमित है. इस सीमित प्रयोज्यता कारण SIQDs आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग नहीं किया जा सकता और इसलिए बहुलक खोल के एक माध्यमिक संशोधन की आवश्यकता होगी के बाद से, अंग, सेल या हित के जीन को दोहरी जांच जोड़ने की कठिनाई होने की संभावना है. उनकी प्रयोज्यता में सुधार, luciferases luminescent कोर करने के लिए सीधे बाध्य कर रहे हैं, जहां वैकल्पिक SIQDs,, हाल ही में 15 नियोजित किया गया है. SIQD अवधारणा के बंद का निर्माण, एक और अधिक लागू ब्रेट प्रणाली एक में करने के लिए Cypridina luciferase संलग्न द्वारा प्राप्त किया गया था675 एनएम के लिए 460 एनएम से एक बड़ा लाल पारी जबकि उत्पादन विशेष रूप से चूहों में ट्यूमर को निशाना बनाने में सक्षम था जो डाई 16, docyanine. गैर विकिरणवाला ऊर्जा हस्तांतरण गुजरना करने के लिए, ब्रेट अपनी फ्लोरोसेंट समकक्ष के रूप में एक ही प्राथमिक बाधाओं निम्नानुसार है: दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता उत्तेजना स्पेक्ट्रा और दो moieties के बीच काम दूरी के बीच एक मजबूत वर्णक्रमीय ओवरलैप होना चाहिए के आदेश पर होना चाहिए फोरस्टर त्रिज्या (5-14 एनएम दो बार फोरस्टर त्रिज्या 17 का एक प्रभावी अधिकतम दूरी के साथ, दाता स्वीकर्ता जोड़ी पर निर्भर करता है). इस दूरी निर्भरता काफी पता लगाने में वृद्धि करने के लिए एक साधन के रूप में ब्रेट उपयोग कर देखा जा सकता है कि घटनाओं के प्रकारों की सीमा.

हाल ही में एक नया दृष्टिकोण में इन विट्रो और इन विवो परिस्थितियों में दोनों की पहचान की और तहत प्रदर्शन किया गया. ब्रेट, luminescence (ईंधन) से 18, 19 अपार उत्तेजना से प्रतिदीप्ति की नींव बंद बिल्डिंग लक्स operon और QDs 18, 19 व्यक्त bioluminescent कोलाई के बीच होने की सूचना दी गई है. SIQDs को प्रयोगात्मक इसी तरह की है, जबकि एक बुनियादी अंतर मौजूद है: luminescent स्रोत के लिए अनुमति देता है जो fluorophore, करने के लिए शारीरिक रूप से बाध्य होने के लिए ईंधन में, यह आवश्यक नहीं हैluminescent जांच की आनुवंशिक एन्कोडिंग आर. कारण luminescent बैक्टीरिया और QDs के बीच ईंधन के सफल का पता लगाने के लिए, यह इस तकनीक सतही (त्वचा) और गहरी ऊतक (फेफड़े, जिगर) ऐसे Staphylococcus aureus और Klebsiellia निमोनिया जैसे संक्रमण दोनों के लिए लागू किया जा सकता है कि संभव है.

इसके प्रयोगात्मक महत्व की रिपोर्ट के बाद से, ईंधन स्वीकार्य luminescent और फ्लोरोसेंट जोड़े भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मजबूत गणितीय मॉडल 20 में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है, और उसके आवेदन जैसे क्वांटम उपज के रूप में photophysical विशेषताओं की पहचान करने में उपयोग में शामिल करने के लिए विस्तार किया है. हम ईंधन के बुनियादी तकनीकों में से कुछ का वर्णन नीचे दिया. सबसे पहले, हम कम (माइक्रोन) और लंबी (सेमी) दोनों के ऊपर मौलिक ब्रेट से ईंधन जो अलग काम दूरी, इस घटना के लिए सबूत दिखा. दूसरा, हम fluorophores और फ्लोरोसेंट नैनोकणों की एक विस्तृत विविधता का परीक्षण करके संभव ईंधन जोड़े पर विस्तार. Thirडी, ईंधन अनुप्रयोगों लक्षित और गैर लक्षित ईंधन जोड़े की तुलना द्वारा जांच कर रहे हैं.

Protocol

1. अभिकर्मकों

  1. खरीद या ऐसे लक्स ABCDE 21 व्यक्त संशोधित कोलाई के रूप में luminescent बैक्टीरिया और उपयुक्त संस्कृति मीडिया का विकास, विब्रियो fischeri, Photobacterium सपा. क्लेबसिएला निमोनिया 22.
  2. मानक व्यंजनों के अनुसार शारीरिक खारा (0.9% NaCl) और संस्कृति मीडिया समाधान तैयार करें. ई. कोली और लालकृष्ण निमोनिया 37 डिग्री सेल्सियस, और वी. पर Luria Bertani (पौंड) में बड़े हो रहे थे fischeri और लेग में Photobacterium सपा 22 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 एम NaCl के साथ पूरक
  3. खरीद या ऐसे क्यू ट्रैकर 705 के रूप में फ्लोरोसेंट जांच के अधिग्रहण, (40 एनएम व्यास, QD705 के रूप में) क्यू ट्रैकर 800 (40 एनएम व्यास, QD800 के रूप में), फ्लोरोसेंट (40 एनएम व्यास) और गैर फ्लोरोसेंट polystyrene microspheres ( 48 एनएम व्यास), और पारंपरिक फ्लोरोसेंट रंजक.
  4. बैक्टीरियल लेबलिंग के लिए आवश्यक अभिकर्मकों तैयार करें.
  5. के लिए उपयोग सुनिश्चितइस तरह के एक IVIS स्पेक्ट्रम के रूप में एक पूरे जानवर bioluminescence इमेजर, कि उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य और जोखिम बार की एक विस्तृत श्रृंखला के अंतर्गत संकेत पता लगाने में सक्षम है. Bioluminescence माप करने में सक्षम एक प्लेट रीडर यहाँ वर्णित प्रयोगों के अधिकांश के लिए पर्याप्त होगा.

ईंधन की 2. बेसिक संक्षिप्त

  1. मानक संस्कृति प्लेटों पर व्यक्तिगत कालोनियों से शुरू, luminescent बैक्टीरिया के रातोंरात संस्कृतियों शुरू करते हैं. इधर, वी. fischeri इस्तेमाल किया गया.
  2. प्रयोग के दिन, ताजा उपसंस्कृतियाँ आरंभ और एक आयुध डिपो 1-1.5 की 600 हासिल की है, जब तक उन्हें प्रगति के लिए अनुमति देते हैं. तुलनीय परिणाम का उत्पादन करने के लिए आदेश में यह वे तीव्र संकेतों जो उत्पादन में समान विकास राज्यों में बैक्टीरिया का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. यह 600 आयुध डिपो निरंतर रखने के द्वारा आश्वासन दिया जा सकता है.
  3. QD705 या शारीरिक खारा (पी एस) के 5 μl के साथ या तो प्रत्येक से 100 μl की aliquots का मिश्रण है, और फिर standa में पी एस के 895 μl को जोड़नेरोड स्पेक्ट्रोस्कोपी cuvettes. IVIS स्पेक्ट्रम में भरा cuvettes प्लेस और उपयुक्त फिल्टर सेट के तहत माप ले. इधर, 710-730 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का इस्तेमाल किया गया था.

3. ईंधन खत्म परिवर्तनीय दूरियाँ

  1. दो कम मात्रा (1 मिलीलीटर) भरें QD705 के 50 μl या 1 मिलीलीटर पी एस की कुल मात्रा में गैर फ्लोरोसेंट 48 एनएम polystyrene microspheres की 97.2 μl के साथ या तो प्लास्टिक भामिति cuvettes. यह दो संस्थाओं के बीच कुल मात्रा प्रति समान ठोस सतह क्षेत्र सुनिश्चित करता है.
  2. मानक काले टेप या प्रकाश अवरुद्ध करने में सक्षम कुछ अन्य अपारदर्शी सामग्री के साथ एक तिहाई क्युवेट encasing द्वारा एक प्रकाश स्रोत क्युवेट तैयार करें. ध्यान क्युवेट के विपरीत दिशा में दो समान ऑप्टिकल खिड़कियां तैयार करते हैं.
  3. सीधे प्रकाश स्रोत क्युवेट के दोनों ओर पर पहले से भरा cuvettes रखें. वी. के 1 मिलीलीटर विभाज्य जोड़ें fischeri या अन्य संस्कृति (यानी luminescent ई. कोलाई या Photobacterium हैप्रकाश स्रोत क्युवेट में एक ताजा उपसंस्कृति से पी) और किसी भी प्रकाश प्रदूषण को कम करने के लिए इस तरह के काले कागज के रूप में एक अपारदर्शी सामग्री, के साथ कवर.
  4. क्रमशः जोखिम 10 की बार, 30, और 30 सेकंड के साथ, इस तरह कुल प्रकाश और 710-730 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के रूप में उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर के तहत तीन cuvettes कल्पना.
  5. केंद्रीय क्युवेट से बराबर आगे की दूरी पर दोनों बाहरी cuvettes का स्थान बदलें, और उसके बाद फिर से कल्पना. 3cm के अंतिम सामना करने वाली चेहरा (कम मात्रा क्युवेट के लिए केंद्रीय) दूरी हासिल की है जब तक दोहराएँ. हर कदम पर, QD705 स्थान मान्य करने के लिए एक प्रतिदीप्ति छवि (450-480 एनएम उत्तेजना, 710-730 एनएम उत्सर्जन) के अधिग्रहण.

4. संभावित ईंधन जोड़े जांच

  1. अन्य में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ एक fluorophore या ब्याज की एक फ्लोरोसेंट nanoparticle एक में, और पी एस या पी एस जिसमें या तो 1 मिलीलीटर के समाधान के साथ दो कम मात्रा cuvettes भरें. वें मेंई काम तालिका 1 में उल्लिखित के रूप में संभावित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईंधन fluorophores और फ्लोरोसेंट नैनोकणों की एक किस्म की जांच की गई, यहां प्रदर्शन किया.
  2. ताजा वी. के 1 मिलीलीटर विभाज्य जोड़ें fischeri या विपरीत दिशा में स्थित दो शारीरिक रूप से बराबर ऑप्टिकल Windows युक्त एक बेहोश बाहर तीसरे क्युवेट करने के लिए अन्य luminescent बैक्टीरिया. जैसे काले कागज के एक टुकड़े के रूप में एक अपारदर्शी पदार्थ के साथ क्युवेट कवर.
  3. एक छोटी लेकिन समान दूरी जगह पर दो कम मात्रा बेहोश बाहर क्युवेट के दोनों तरफ cuvettes और उपयुक्त फिल्टर के तहत कल्पना. इधर, 0.7 सेमी की दूरी इस्तेमाल किया गया था. अन्य fluorophores से दोहराएँ.

5. लक्षित ईंधन

  1. Luminescent बैक्टीरिया को विशिष्ट biotinylated एंटीबॉडी तैयार करें. लालकृष्ण करने के लिए उदाहरण के लिए, यहां प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्ट निमोनिया (α-केपी) ईज़ी लिंक sulfo एन एच एस-नियंत्रण रेखा बायोटिन युक्त समाधान का उपयोग biotinylated थे. 2 मिनट के लिए centrifugation (1500 XG) के तहत desalting स्तंभों का उपयोग एंटीबॉडी से अतिरिक्त अभिकर्मक निकालें.
  2. प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और HABA परख द्वारा एंटीबॉडी biotinylation की डिग्री का निर्धारण करने के लिए एक मानक ब्रैडफोर्ड परख करें.
  3. 16 बायोटिन अब प्रति अवशेष और एक फाइनल के प्रतिस्थापन के अंतिम डिग्री परिणामस्वरूप, 40 μl α-के.पी. एंटीबॉडी के साथ 100 μl (1x पीबीएस में भंग 10 मिमी,) के मिश्रण से α-KP-Biot biotinylated एंटीबॉडी (अब) बैचों प्राप्त 10 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 के प्रोटीन एकाग्रता.
  4. कई का प्रयोग रातोंरात, संस्कृतियों को दोहराने उपयुक्त प्रोटोकॉल के बाद aforementioned एंटीबॉडी के साथ धोया बैक्टीरिया लक्ष्य.
    1. विशेष रूप से, लालकृष्ण धोने 1x पीबीएस में निमोनिया, और 4 के एक आयुध डिपो के लिए 1x पीबीएस में Resuspend (सी ए 4 x 10 8 CFU मिलीलीटर -1 आयुध डिपो -1).
    2. प्रत्येक को दोहराने के लिए, 100 μl पीबीएस सेते हैं, α -के.पी. एंटीबॉडी (नियंत्रण के लिए 10 μl α-KP-biotB या 10 μl पीबीएस) और 30 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 100 μl कोशिकाओं 196 μl पीबीएस में 1x पीबीएस में कोशिकाओं तीन बार धोएं, और resuspend.
  5. QD705 streptavidin संयुग्म के साथ कोशिकाओं लेबल और दो बराबर खंडों में विभाजित.
  6. एक समाधान तीन बार धोएं और फिर उचित मात्रा में resuspend.
  7. एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में धोया और गंदा समाधान के 100 μl वितरित करें. परिणामस्वरूप कुल प्रकाश के तहत luminescence, 490-510 एनएम, और 710-730 एनएम फिल्टर उपाय. Fluorophore एकाग्रता 450-480 एनएम उत्तेजना और 710-730 एनएम उत्सर्जन का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है.

Representative Results

प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (रेत) एक luminescent दाता और बाहर हुआ दाता से ऊर्जा एक मजबूत द्विध्रुवीय द्विध्रुवीय बातचीत 13 के माध्यम से स्वीकर्ता से एक प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया उत्प्रेरण के लिए सक्षम है, जिसके तहत एक फ्लोरोसेंट स्वीकर्ता, के बीच एक गैर विकिरणवाला बातचीत है. Chemiluminescent फ्लोरोसेंट 23, 24, और bioluminescent 13 दाताओं, का उपयोग वर्णित किया गया है, जो रेत, मुख्य आवश्यकता है: दाता उत्सर्जन और सकारी उत्तेजना स्पेक्ट्रा के बीच 1 सशक्त वर्णक्रमीय ओवरलैप;. 2 दो संस्थाओं के बीच उचित घूर्णी संरेखण.; और 3. 0.5 से 2 बार से अधिक नहीं दूरी काम कर दाता और स्वीकर्ता 17 के बीच फोरस्टर त्रिज्या, आर 0,. रेत के साथ विषम, ईंधन एक bioluminescent बैक्टीरिया के रूप में एक luminescent स्रोत,, इस तरह के एक fluorophore या एक फ्लोरोसेंट nanoparticle, के रूप में अवशोषित और एक दूसरे इकाई द्वारा फिर से उत्सर्जित होता है कि एक फोटान, उत्सर्जन करता है तब होता है जब लाल बदलने वाले उत्सर्जन SPECTमूल luminescent स्रोत के रम. इस प्रकार, ईंधन एक केंद्रित उत्तेजना के उपयोग के बिना अभी तक, मानक epifluorescent स्थितियों के सदृश एक मानक उत्तेजना उत्सर्जन की प्रक्रिया के बाद. इस बात का सबूत आसानी luminescent बैक्टीरिया और अत्यधिक फ्लोरोसेंट क्वांटम डॉट्स की साधारण मिश्रण से देखा जा सकता है. QD705 एक गैर फ्लोरोसेंट polystyrene microsphere नियंत्रण (चित्रा 1 ए) की तुलना में समाधान में भी थे जब विब्रियो सपा की उपस्थिति में, लाल सिग्नल में एक उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई है. bioluminescence, अनिवार्य रूप से एल्डिहाइड सब्सट्रेट, luciferase, और एटीपी बनाने के लिए आवश्यक घटकों, सभी उत्पादन और कोशिका द्रव्य के भीतर समाहित कर रहे हैं. इसके अलावा, एंजाइमी luminophore उत्पादन बैक्टीरियल कोशिका द्रव्य (चित्रा 1 बी) के भीतर होता है. कहीं सूचित किया गया है, बैक्टीरिया की भीतरी और बाहरी झिल्ली के बीच की दूरी को आम तौर पर अधिक से अधिक से अधिक 30 एनएम 25-27, महत्वपूर्ण रेत के लिए अनुमति नहीं है कि एक दूरी हैके लिए होते हैं. कोई endocytosis या तेज के अन्य साधनों के बाद से वहाँ के रूप में अच्छी तरह से, फ्लोरोसेंट नैनोकणों बैक्टीरियल कोशिका द्रव्य में पार नहीं करते. साथ में, इन बाधाओं ईंधन luminescent बैक्टीरिया फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ मिश्रित कर रहे हैं तब होता है जब प्रमुख उत्तेजना उत्सर्जन घटना है कि संकेत मिलता है.

पहले से दिखाया गया था, ईंधन रेत की सीमा से परे मौजूद है. दूरी पर ईंधन पर निर्भरता की जांच करने के लिए, मानक कम मात्रा spectrophotometric cuvettes एक fluorophore समाधान युक्त एक, तितर बितर करने के लिए नियंत्रित कर सकते हैं कि एक उचित नियंत्रण से युक्त एक दूसरा, और तीसरे ताजा luminescent समाधान के एक विभाज्य को रोकने के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. यह केंद्रीय क्युवेट luminescent स्रोत से किसी भी संभावित प्रकाश प्रदूषण को कम करने के लिए, विपरीत चेहरों पर स्थित कम से कम दो समान ऑप्टिकल खिड़कियों के लिए बचाने के लिए, काला टेप या एक और अपारदर्शी सामग्री का उपयोग कर छा जाना आवश्यक है. इसके अलावा, दो शेष cuvettes करने की जरूरत हैकेंद्रीय क्युवेट के दोनों ओर पर equidistantly रखा जाना. अंत में, एक ताजा luminescent समाधान, बैक्टीरिया या chemiluminescence का उपयोग, अधिकतम प्रकाश उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए एक प्रयोग के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए. उचित स्थान पर, वांछित फिल्टर के तहत luminescence संकेत प्राप्त. उत्तरार्द्ध से ही डेटा से पता चला है, हालांकि कुल प्रकाश और 710-730 एनएम फिल्टर, इस मामले में इस्तेमाल किया गया. प्रत्येक अधिग्रहण के बाद, 3 सेमी (चित्रा 2) के लिए 1.0 सेमी से संवर्द्धित का सामना करने वाली चेहरा दूरी वृद्धि हुई है. अंत में, छात्रों को इंगित करने के लिए सभी डेटा मानक के अनुसार. यहां इस्तेमाल उदाहरणों में, इस luminescent स्रोत और QD705 युक्त क्युवेट के बीच कम से कम दूरी (डी = 1 सेमी) पर हुई. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, व्यवहार्य ईंधन संकेत अंतिम अधिग्रहण किसी भी ऑप्टिकल अवशोषक के अभाव में, ईंधन किसी भी संभव प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण परे दूरी पर हो सकता है, सुझाव है कि और केवल एक विशुद्ध विकिरणवाला होने के लिए समझाया जा सकता है अप करने के लिए मनाया जा सकता हैप्रभाव. डेटा फिटिंग एक डी -1 डी -2 निर्भरता के लिए निम्न दूरी डी के एक समारोह के रूप में संकेत में कमी का पता चलता है. ज्यामितीय विन्यास पर निर्भर करता है, संधारित्र दूरी निर्भरता और बिंदु स्रोतों के लिए व्युत्क्रम वर्ग कानून को बाद के लिए पूर्व से मेल खाती है. इस परिणाम क्युवेट एपर्चर के आकार और luminescent स्रोत और fluorophore के बीच की दूरी को देखते हुए, इसलिए हमारे समग्र अधिग्रहण सेटअप के अनुरूप है.

ईंधन क्वांटम डॉट्स पर लागू होता है, लेकिन यह भी एलेक्सा श्रृंखला से फ्लोरोसेंट microspheres (तालिका 2) को लेकर fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर देखा जा सकता है न केवल. नियंत्रण के बराबर हो करने के लिए, विभिन्न fluorophores के बराबर सांद्रता इस्तेमाल किया जाना चाहिए और नैनोकणों की कुल सतह क्षेत्र (तालिका 1) लगातार आयोजित. उनके उचित नियंत्रण गैर फ्लोरोसेंट साथ (पी एस या पी एस fluorophores और नैनोकणों तुलना करकेpolystyrene microspheres), सिग्नल में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रत्येक फ्लोरोसेंट इकाई के उत्सर्जन अधिकतम पर मनाया जाता है. संकेत में सबसे बड़ी रिश्तेदार वृद्धि फ्लोरोसेंट उत्सर्जन अधिकतम luminescent उत्सर्जन अधिकतम से अधिक दूर था जहां घटित पाया गया. इस कारण luminescent स्रोत के व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की तुलना में फ्लोरोसेंट संकेत की वृद्धि की विशिष्टता के लिए सबसे अधिक संभावना है. दो उत्सर्जन Maxima अच्छी तरह से अलग नहीं कर रहे थे, जब इसके विपरीत, कम से कम विश्वसनीय ईंधन संकेत पाया गया था. दिलचस्प है, एक discernable ईंधन संकेत मनका (350 fluorescein समकक्ष) के अनुसार वर्तमान फ्लोरोफोरे की पर्याप्त मात्रा के कारण सबसे अधिक संभावना वर्णक्रमीय अंतर बहुत कम है, भले ही पीला microspheres, साथ पाया गया था. यहाँ दिखाए गए परिणामों उपयुक्त परिस्थितियों में ईंधन मैं दोनों के तहत और अधिक प्रासंगिक अनुप्रयोगों के लिए चुना जांच की सिलाई जो सक्षम बनाता है fluorophores की एक किस्म के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि संकेत मिलता हैn इन विट्रो और इन विवो परिस्थितियों में. मनाया ईंधन संकेत के महत्व को एक मानक दो पूंछ विद्यार्थी t-परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. जैसे, केवल Alexa555 इस्तेमाल किया luminescent स्रोत के साथ असंगत हो पाया था.

ईंधन पर निशाना बनाने का प्रभाव का पता लगाने के लिए आदेश में, biotinylated एंटीबॉडी luminescent बैक्टीरिया और streptavidin से जुड़े QDs लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. यह बैक्टीरिया या luminescence स्रोत luminophore और इसी fluorophore के बीच रेत की संभावना को कम करने के लिए पर्याप्त मोटी परत प्रदान जरूरी है. ऊष्मायन और अनबाउंड एंटीबॉडी को दूर करने के लिए धोने के बाद, बायोटिन लेबल बैक्टीरिया तो नियंत्रण के रूप में, विभाजित और समाधान निकालने के लिए आगे washes के संपर्क में एक सेट किसी भी गैर पालन streptavidin संयुग्मित QD705 या गैर क्रियाशील QD705 या तो सामने आ रहे हैं QD705. यहाँ सभी चार स्थितियों के लिए, जिसके परिणामस्वरूप luminescence कुल प्रकाश, 490-510 एनएम, के तहत मनाया गया एकडी केवल बाद के दो फिल्टर डेटा विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, हालांकि 710-730 एनएम फिल्टर,. QD705 की उपस्थिति 450-480 एनएम उत्तेजना और 710-730 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करने की तुलना में था. समाधान एक गंदा राज्य (चित्रा 3) में छोड़ दिया गया जब जांच करने पर हम लाल स्थानांतरित संकेत में कोई अंतर को कम पाया गया है. इस शर्त के तहत परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति संकेत भी QD705 की संख्या बराबर दोनों लक्षित और गैर लक्षित राज्य के अंतर्गत मौजूद थे, सुझाव है कि काफी समान हो पाया है. हालांकि, किसी भी अपार QD705 दूर करने के लिए नमूने धोने उनके गैर लक्षित नियंत्रण की तुलना में लक्षित बैक्टीरिया के लिए रिश्तेदार लाल सिग्नल में एक लगभग दो गुना वृद्धि प्रदान करता है. प्रतिदीप्ति द्वारा जांच QD705 की उपस्थिति या अनुपस्थिति को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तुलनात्मक रूप से, लक्षित धोया हालत लगभग तीन गुना मैला हालत की तुलना में कम है, अभी तक केवल की कमी हुई जिसके परिणामस्वरूप लाल पारी था कि एक प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिणामस्वरूप30%, विशुद्ध रूप से बाध्य परिस्थितियों में बैक्टीरिया के लक्ष्य लाल स्थानांतरित उत्सर्जन में वृद्धि का परिणाम देगा सुझाव है कि. यह दृढ़ता से भविष्य अनुप्रयोगों के लिए लक्षित ईंधन की उपयोगिता implicates.

चित्रा 1
चित्रा 1. Luminescent बैक्टीरिया और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्वांटम डॉट्स के बीच एक ईंधन बातचीत लाल फोटॉन उत्पादन में वृद्धि हो जाती है. दो spectrophotometric cuvettes ताजा वी. के 100 μl aliquots युक्त समाधान से भर गया एक IVIS स्पेक्ट्रम और अधिग्रहण उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में रखा जा रहा से पहले एक 1-1.5 के आयुध डिपो 600, पी एस के 895 μl, और QD705 या शारीरिक खारा (पी एस) के 5 μl, या तो साथ fischeri संस्कृति. लाल संकेत में एक उल्लेखनीय वृद्धि के कारण की उपस्थिति के लिए हासिल की हैQD705, 710-730 एनएम उत्सर्जन फिल्टर (ए) के तहत नियंत्रण की तुलना में सेकंड -1 • सेमी -2 (पी • सेकंड -1 • सेमी -2) • पता चला फोटॉनों में वृद्धि से उल्लेख किया जा सकता है. इधर, बैक्टीरिया की दोहरी झिल्ली luminescent moieties (नीले हलकों) की बातचीत और QD705 (काला हलकों) शामिल नहीं है. बाद के लिए स्वतंत्र रूप से थोक समाधान (बी) में वितरित कर रहे हैं, जबकि पूर्व ही बैक्टीरियल कोशिका द्रव्य में पाए जाते हैं. प्रत्येक बैक्टीरियल समाधान के लिए = 3 एन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
ईंधन की चित्रा 2. साक्ष्य दूरी compl पर होने वालीetely प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण को छोड़कर. spectrophotometric cuvettes QD705 के 50 μl और शारीरिक खारा के 950 μl (पी एस) या गैर फ्लोरोसेंट 48 एनएम polystyrene microspheres की 97.2 μl और पी एस के 902.8 μl जिसमें या तो समाधान के साथ भरा है, और विपरीत दिशा में equidistantly रखा गया एक आयुध डिपो 1-1.5 600 पर ताजा luminescent Photobacterium सपा के 1 मिलीलीटर युक्त केंद्रीय काला क्युवेट की. केंद्रीय क्युवेट उत्सर्जित फोटॉनों आज़ादी को फैलाने के लिए अनुमति दो समान ऑप्टिकल Windows था. 1.0 सेमी से 3 सेमी से लेकर दूरी (डी) पर छवियों को प्राप्त करने, लाल बत्ती का मनाया उत्पादन ईंधन प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के द्वारा प्राप्त नहीं दूरी पर हो सकता है कि सबूत प्रदर्शित दूरी के एक समारोह के रूप में कम किया है. तीव्रता व्युत्क्रम वर्ग कानून (बाएं) के लिए इसी तरह डी -2 निर्भरता, नहीं दिखाई दिया. एक ही प्रोटोकॉल ई. के लिए पीछा किया गया था कोली (दाएं). परिणामस्वरूप प्रवृत्ति लाइनों अवधारणा था करने के लिए प्रपत्र पकड़टी बैक्टीरिया प्रकाश के बिंदु स्रोत के रूप में कार्य कर रहे हैं. तीन स्वतंत्र दूरी माप के कुल एक अद्वितीय उपसंस्कृति का उपयोग कर प्रत्येक के साथ हासिल किया गया. त्रुटि सलाखों के प्रत्येक बिंदु पर मौजूद हैं. कुछ मामलों में त्रुटि सलाखों सामान्यीकृत तीव्रता से संकेत मिलता है कि इस्तेमाल किया प्रतीकों की तुलना में छोटे थे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. लक्षित (विशिष्ट) और गैर लक्षित (थोक समाधान) ईंधन. लालकृष्ण बीच एक तुलना निमोनिया biotinylated एंटीबॉडी के साथ क्रियाशील है और फिर streptavidin लेबल (लक्षित) या गैर लेबल (गैर लक्षित) QD705 या तो खुल गए थे. परिणामस्वरूप समाधान भी उतना ही प्रखंड थेded और एक सेट पीबीएस में अपनी आरंभिक मात्रा में resuspended किए जाने से पहले पीबीएस के साथ तीन बार धोया. समाधान तो एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली और (नीले सलाखों के रूप में इंगित) 490-510 एनएम (500 एनएम) और 710-730 एनएम (720 एनएम) उत्सर्जन फिल्टर के तहत मनाया bioluminescence की व्यक्तिगत कुओं में तिरस्कृत किया गया. पी • सेकंड -1 • सेमी -2 प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से 720 एनएम फिल्टर से पाया संबंधित पी • सेकंड में एक ही अच्छी तरह से 500 एनएम से -1 • सेमी -2 bioluminescence तीव्रता से सामान्यीकृत था. एक epifluorescent उत्तेजना से उत्पन्न रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता 450-480 एनएम उत्तेजना और 710-730 एनएम उत्सर्जन फिल्टर (लाल सलाखों के संकेत के रूप में) का उपयोग निर्धारित किया गया था. Bioluminescent या फ्लोरोसेंट संकेत में कोई अंतर को थोड़ा गंदा शर्तों (गंदा गैर लक्षित और गंदा लक्षित) के तहत मनाया गया. इस बाध्य और मुक्त अस्थायी QD705 bioluminescent फोटॉनों द्वारा समान रूप से उत्साहित थे कि पता चलता है. धोने, एन अपॉनरिश्तेदार लाल सिग्नल में जल्दी एक दो गुना अंतर नियंत्रण (गैर लक्षित धोया) की तुलना में (धोया लक्षित) QD705 लेबल बैक्टीरिया के लिए मनाया गया. गैर लक्षित धोया में QD705 के अभाव फ्लोरोसेंट संकेत के अभाव से इसकी पुष्टि की और लक्षित धोया राज्य में QD705 लेबलिंग सत्यापित किया गया था. डेटा कश्मीर के चार स्वतंत्र संस्कृतियों से है निमोनिया. स्पष्टता के लिए, कथा QD705 उत्तेजना का स्रोत इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चौड़ाई: 108px; "> एलेक्सा 700 ऊँचाई: 22px; चौड़ाई: 108px; "> QD800
Fluorophore एकाग्रता μl पुनश्च (μl) λ अधिकतम पूर्व / उन्हें (एनएम) उत्सर्जन फिल्टर (एन एम)
एलेक्सा 555 37.2 माइक्रोन 4.77 995.23 555/565 570-590
एलेक्सा 568 37.2 माइक्रोन 4.77 995.23 578/603 590-610
एलेक्सा 633 37.2 माइक्रोन 4.77 995.23 632/637 650-670
37.2 माइक्रोन 4.77 995.23 702/723 710-730
Nonfluorescent 2.62% ठोस 9.72 990.28
μSph गुलाबी 5% ठोस 4.77 995.23 580/605 610-630
μSph पीला 5% ठोस 4.77 995.23 505/515 510-530
QD705 2 माइक्रोन 5 995 465/705 710-730
2 माइक्रोन 5 995 465/705 790-810

तालिका 1. ईंधन प्रदर्शनों के दौरान इस्तेमाल किया fluorophores के गुण.

<टीडी> 6.05 x 10 4
नियंत्रण फिल्टर फ्लोरोफोरे नियंत्रण पी मूल्य
पी · सेकंड -1 · सेमी -2 एसडी पी · सेकंड -1 · सेमी -2 एसडी
A555 पुनश्च 580 1.08 10 x 7 3.31 x 10 6 9.09 x 10 6 1.75 x 10 6 0.233
A568 पुनश्च 600 8.47 x 10 6 4.23 x 10 6 4.49 x 10 6 9.71 x 10 5 0.094
A633 पुनश्च 660 2.40 x 10 6 1.25 x 10 6 7.85 x 10 5 2.39 x 10 5 0.046
A700 पुनश्च 720 5.53 x 10 5 2.46 x 10 5 1.54 x 10 5 0.026
MSPH पीला गैर फ्लोरोसेंट μspheres 520 1.19 x 10 8 4.85 10 x 7 5.79 10 x 7 1.99 10 x 7 0.057
MSPH गुलाबी गैर फ्लोरोसेंट μspheres 620 2.37 10 x 7 1.36 10 x 7 2.16 x 10 6 8.00 x 10 5 0.026
QD705 गैर फ्लोरोसेंट μspheres 720 1.76 10 x 7 7.33 x 10 6 2.08 x 10 5 7.16 x 10 4 0.007
QD800 गैर फ्लोरोसेंट μspheres 800 7.79 x 10 6 4.72 x 10 6 3.60 x 10 4 1.52 x 10 4 0.023

Fluorophores और ईंधन के साथ संगत फ्लोरोसेंट नैनोकणों की तालिका 2. पहचान.

Discussion

ईंधन की मौलिक प्रदर्शन बस फ्लोरोसेंट नैनोकणों या QDs साथ luminescent बैक्टीरिया के मिश्रण से प्राप्त किया जा सकता है. दो संस्थाओं शारीरिक रूप से अलग कर दिया और किसी भी कुशल रेत दूरी से बाहर रहना हो जाएगा. और ज्यादा मुश्किल में इन विट्रो और इन विवो दोनों में ईंधन संकेत अनुकूलन है. इन विट्रो शर्तों के तहत, के साथ और एक ऑप्टिकल अवशोषक उपस्थित बिना दोनों, आमतौर पर अतिरिक्त fluorophore के अलावा ईंधन प्रतिक्रिया को अधिकतम करने के लिए पर्याप्त होगा. हालांकि, इस तरह स्थिर या collisional शमन के रूप में उच्च सांद्रता घटना पर फ्लोरोसेंट संकेत का नुकसान हो सकता है. स्वतंत्र रूप से luminescent स्रोत और फ्लोरोफोरे की एकाग्रता अलग से एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के प्रदर्शन वांछित सांद्रता का अनुकूलन करने में मदद मिलेगी. विवो सांद्रता में के तहत स्थापना और ईंधन के अनुकूलन और अधिक कठिन है और एक मामले दर मामले के आधार पर ध्यान देने की जरूरत. यह एक सह बनाने के लिए मुश्किल हो सकता हैndition फ्लोरोसेंट इकाई luminescent स्रोत से ऑप्टिकली पहुँचा जा सकता है. जैसे, दो moieties के प्रत्यक्ष सह इंजेक्शन के साथ शुरुआत इष्टतम शर्तों के तहत ईंधन की सफलता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं.

मानक प्रोटोकॉल ऐसे एलेक्सा श्रृंखला और QDs के रूप में फ्लोरोसेंट संस्थाओं के साथ लेबलिंग बैक्टीरिया और कोशिकाओं के लिए मौजूद हैं. अक्सर यह कम सेल व्यवहार्यता या बदल चयापचय गतिविधि की तरह अवांछित प्रभाव पैदा कर सकते हैं जो एंटीबॉडी के साथ सतह functionalization या सक्रियण की आवश्यकता है. इस पर काबू पाने के लिए, यह एंटीबॉडी या सक्रियण एजेंट के इष्टतम राशि फ्लोरोसेंट लेबलिंग जबकि अधिकतम कि सेलुलर perturbations कम से कम जरूरत निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. QDs के उपयोग की वजह से उनकी विशेषता से व्यापक उत्तेजना स्पेक्ट्रा, संकीर्ण और tunable उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, और एक बड़े स्टोक्स बदलाव की संभावना से लाभप्रद है. हालांकि, QDs साइटोटोक्सिक हो सकता है और कुछ मामलों में वांछित नहीं हो सकता है.

13 में मौजूद है और luminescent और फ्लोरोसेंट स्रोतों की विविधता के लिए लागू है कि एक घटना है. अब तक, ईंधन से उत्पन्न फोटॉनों गैर विशिष्ट बातचीत या खराब डिजाइन ब्रेट प्रयोगों से उत्पन्न एक दुर्भाग्यपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत के उत्पाद पर विचार किया गया. यह हम इस अवांछित संकेत की उपयोगिता की पहचान करने में सक्षम थे कि यहाँ का प्रदर्शन प्रयोगों के प्रकार के साथ ही है. पता चला उदाहरणों में, luminescent बैक्टीरिया फ्लोरोसेंट संस्थाओं की एक विस्तृत विविधता से एक मानक फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया जानने में सक्षम फैलाना उत्तेजना स्रोत के रूप में कार्य. इसके अलावा, के कारण पर्याप्त दूरी काम करने के लिए, यह ईंधन ब्रेट की घटना के बिना निर्माण किया जा सकता है, जबकि सामान्य ब्रेट में ईंधन से एक योगदान के बिना नहीं देखा जा सकता है कि समाप्त करने के लिए सुरक्षित है. महत्वपूर्ण बात है, की वजह से एक को लक्षित आवश्यकता की कमी के कारण, ईंधन ब्रेट और सी के बीच मौजूद है कि स्थानिक अंतर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैonventional पूरे पशु इमेजिंग तकनीक.

Disclosures

लेखकों वित्तीय हितों प्रतिस्पर्धा की घोषणा. जद, एस.बी., KLR और SLS यूरोपीय पेटेंट EP10290158.4 के लिए योगदान दिया है और विश्व बौद्धिक संपदा संगठन पेटेंट आवेदन WO/2011/117847.

Acknowledgements

लेखकों जद, आह ((SLS के लिए), यूरोपीय संघ के FP7 कार्यक्रम "स्वचालन", Institut कार्नोट कार्यक्रम 11 (जद, सीएस, सीएस के लिए) न्यूयॉर्क के पाश्चर फाउंडेशन की ओर से वित्तीय सहायता के लिए उनके प्रति आभार का विस्तार करना होगा , एआर, आरटी, SLS) और आर टी, SLS के लिए परियोजना IMNOS (), Conny-Maeve चैरिटेबल फाउंडेशन (एसएलएस), आण्विक इमेजिंग में यूरोपीय मास्टर्स (आईटी), क्षेत्र Ile डी फ्रांस कार्यक्रमों MODEXA (एसएलएस), तिल (SLS) और DimMalInf (SLS, आर टी), Biologie-Sante एन ANR कार्यक्रम Grandes Investissement डी ल AVENIR इंफ्रास्ट्रक्चर्स Nationales: फ्रांस LifebioImaging (FLI) फ्रांस जीवन इमेजिंग (आर टी, SLS), फ्रांस Bioimaging (जद, SLS) और Institut पाश्चर, पेरिस. इसके अलावा, लेखकों अभिकर्मकों के लिए, जोस Bengoechea और हर्बर्ट Schweizer धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, लेखकों एंटीबॉडी उत्पन्न जो सिंडी Fevre धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

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References

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