BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.

Cite this Article

Copy Citation

Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lüminesans (yakıt) ikinci, bağlanmamış Uyarma floresans in vitro ve in vivo olarak artan bir sinyal ve kontrast üreten bir ışıma uyarma emisyonu bir süreçtir. Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (Bret), henüz aynı temel ilkeleri birçok YAKIT hisseleri büyük ölçüde Işıklı kaynağı ve floresan varlık arasında kabul edilebilir çalışma mesafeleri farklıdır. BRET etkili bir şekilde 2 kez Förster yarıçapı, genel olarak en az 14 nm'lik bir maksimum sınırlı olsa da, yakıt bir optik emme yokluğunda um kadar mesafelerde cm ya da oluşabilir. Burada fenomen arkasındaki ilgili ilkeleri gözden YAKIT temeli ve uygulanabilirliği üzerine genişletmek ve floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede ile uyumluluğunu göstermek. Ayrıca, antikor hedefli YAKIT yarar keşfedilmeden. Burada gösterilen örnek YAKIT Appl için kullanılabilir olduğunu kanıtlarBRET BRET ve geleneksel bütün hayvan görüntüleme arasında bulunan uzaysal boşluğu doldurmak mümkün değildir ications.

Introduction

Bu tür virüsler, 1, 2, 3 bakteri ya da küçük memeliler gibi organizmaların genetik modifikasyon 4 neden olan veya yapısal olarak ifade biyoluminesans ya da, son derece başarılı olmuştur ve yaygın olarak 5-7 göstermiştir. Bio-ışıldama, doğal olarak meydana gelen reaktif içeren bir in vivo kemilüminesan reaksiyon, harici bir ışık kaynağı için gerek kalmadan ışık üretme avantajına sahiptir. Bu nedenle, biyolojik olarak ışık veren görüntüleme flüoresan görüntüleme 8 mesafede oto-ve spesifik olmayan sinyalin ortak sakıncaları muzdarip değildir. Tespit edilen bir sinyal amaçlanan kaynağından kaynaklanan sadece tarihi Sonuç olarak, biyoışıldama önemli bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Birçok model in vitro ve in vivo uygulamaları için 9'da Photorhabdus luminescens, lux operon'u (480 ve 490 nm arasında ortalanmış emisyon maksimum) yararlanan da, küçük bir memeli konakçının olarak kullanımıals nedeniyle görüntüleme koşulların doğası sorunlu olmuştur; optik hemoglobin gibi emiciler, ve bu doku ve kemik gibi saçılma ajanların pervading varlığı, güçlü sarı dalga boylarındaki 3 mavi etkiler. Işlenmiş bir ateşböceği lusiferaz (617nm emisyon en az) ait ekspresyon son zamanlarda büyük ölçüde optik absorpsiyon 10 üstesinden gelir, ama yine de etkiler saçılma tabi olan bir araç sağlayan, geliştirilmiş ve dahil edilmiştir.

Buna karşılık, kırmızı-shift biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) 11-13 kullanılarak, 650-900 nm, minimize emilim ve dağılım bir bölgenin istenilen optik penceresinin içine yayılan sinyal birden girişimleri olmuştur. Sinyal algılama geliştirmek için bir araç olarak, alıcı olarak donör ve ilave floroforun olarak biyolüminesens kaynağını kullanan Bret, sınırlı başarı buldu. Bu olayın bir seminal örneği, "kendini aydınlatıcı kuantum noktalar olarak4; (SIQDs) 14 oluşur Renilla dış polimer-lizin tabakaya bağlanmış lusiferazlar reniformis modifiye piyasada mevcut kuantum noktaları (QDS). Ayrıca alt-tabaka üzerine, sonuçtaki biyolüminesans reaksiyon kırmızı bir foton önemli üretim üreten, QDS gelen floresan emisyon neden olur. Bununla birlikte, bu SIQDs fizyolojik olarak ilgili olayların vivo görselleştirme için uygulanabilirliği sınırlıdır. Bu sınırlı uygulanabilirlik nedeniyle SIQDs genetik olarak kodlanmış edilemez ve bu nedenle polimer kabuğun ikinci bir değişiklik gerektirir, çünkü, organ, hücre veya ilgi duyulan gen için çift sonda bağlama zorluğu muhtemeldir. Bunların uygulanabilirliğini geliştirmek için, lusiferazların parlak iç ye direkt olarak bağlı olan alternatif SIQDs, yakın zamanda 15, kullanılmıştır. SIQD kavramının kapalı bina, bir daha uygulanabilir Bret sistem bir in'e Cypridina lüsiferoz ekleyerek elde edildi675 nm ile 460 nm arasında önemli bir kırmızı bir değişim üretirken özellikle farelerde tümörler hedefleme yeteneğine sahip olduğunu boya 16, docyanine. -Olmayan ışıma enerji transferi geçmesi, Bret onun floresan muadili olarak aynı birincil kısıtlamaları aşağıdaki gibidir: donör emisyon ve alıcı uyarım spektrumları ve iki yarımlar arasında çalışma mesafesi arasında güçlü bir spektral örtüşme olmalıdır sırasına olmalıdır Förster yarıçapı (5-14 nm iki Förster yarıçapı 17 etkili bir maksimum mesafe ile, verici-alıcı çifti bağlı olarak). Bu mesafe bağımlılık büyük ölçüde artırmak için bir algılama aracı olarak Bret kullanılarak gözlemlenebilir olay türlerini kısıtlar.

Son zamanlarda yeni bir yaklaşım, in vitro ve in vivo koşullarında hem de tanımlanmış ve altında gösterilmiştir. Bret, Lüminesans (yakıt) 18, 19, bağlanmamış Uyarma tarafından Floresans temel kapalı Binası lux operon ve QDS 18, 19 ifade eden biyolüminesans Escherichia coli arasında meydana bildirilmiştir. SIQDs deneysel benzer olsa da, temel bir fark var: Işıklı kaynak fo sağlar florofora, fiziksel sınır olduğu için YAKIT, bu gerekli değildirparlak prob genetik kodlama r. Nedeniyle, ışık yayan bakterilerin ve QDS arasında yakıtın başarılı tespiti için, bu teknik, yüzeysel (deri) ve derin doku (akciğer, karaciğer), örneğin Staphylococcus aureus ve Klebsiellia pneumoniae gibi enfeksiyonlar hem de uygulanabilir mümkündür.

Deneysel önemi rapordan bu yana, YAKIT kabul Işıklı ve floresan çiftleri tahmin etmek için kullanılır olabilir sağlam bir matematiksel model 20 içerecek şekilde gelişti ve uygulamaları gibi kuantum verimi gibi fotofiziksel özelliklerinin belirlenmesinde kullanımını kapsayacak şekilde genişlettik. Biz YAKIT temel bazı teknikler aşağıda açıklanmaktadır. Öncelikle, kısa (um) ve uzun (cm) hem de üzerinde temelden Bret YAKIT ayıran çalışma mesafeleri, bu olay için kanıt gösterebilir. İkincisi, biz floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede inceleyerek olası YAKIT çiftleri üzerine genişletmek. Third, YAKIT uygulamaları hedefli ve hedefli olmayan YAKIT çiftleri karşılaştırılarak incelenmiştir.

Protocol

1.. Reaktifler

  1. Satın alma ya da lux ABCDE 21 ifade değiştirilmiş Escherichia coli gibi ışıldayan bakteri ve uygun kültür ortamı geliştirmek, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22..
  2. Standart tariflere göre, fizyolojik tuzlu su (% 0.9 NaCl) ve kültür ortamı çözelti hazırlayın. E. coli ve K. pneumoniae 37 ° C arasında ve V'de Luria Bertani (LB) içinde büyütülmüştür fischeri ve LB içinde Photobacterium sp 22 ° C 'de 0.5 M NaCI ile takviye edilmiş
  3. Satın alma veya Q-izci 705 floresan probları kazanmak, (40 nm çapında, QD705 olarak anılacaktır) Q-800 izci (40 nm çapında, QD800 olarak anılacaktır), floresan (40 nm çapında) ve floresan olmayan bir polistiren mikro-küreler ( 48 nm çapında) ve geleneksel floresan boyalar.
  4. Bakteriyel etiketleme için gerekli reaktifleri hazırlayın.
  5. Erişimlerini sağlamakBöyle bir IVIS Spektrumu olarak bir bütün hayvan biyoışıldama görüntüleme, bu emisyon dalga boyları ve pozlama süresi geniş bir yelpazede altında sinyalini saptayabilir. Biyoışıldama ölçümleri edebilen bir levha okuyucu, burada açıklanan deneylerin çoğu için yeterli olacaktır.

YAKIT 2. Temel Rekapütülasyon

  1. Standart kültür plakaları üzerinde tek koloniler başlayarak, luminesan bakteri kültürleri, gece boyunca başlar. Burada, V. fischeri kullanılmıştır.
  2. Deney günü taze altkültürler başlatmak ve OD 1-1,5 600 sağlanana kadar onları ilerleme sağlar. Karşılaştırılabilir sonuçlar üretmek için onlar yoğun sinyalleri üretmek olduğu benzer büyüme eyalette bakteri kullanmak en iyisidir. Bu OD 600 sabit tutarak emin olabilirsiniz.
  3. QD705 ya da fizyolojik tuzlu su (PS) 5 ul ya da her bir 100 ul alikotları birleştirin ve daha sonra Standa içine PS 895 ul eklerd spektroskopik küvetler. IVIS Spectrum içine doldurulan küvetler yerleştirin ve uygun filtre setleri altında ölçümler almak. Burada, 710-730 nm emisyon filtresi kullanılmıştır.

3.. YAKIT fazla Değişen Mesafeler

  1. Iki düşük hacmi (1 mi) doldurun QD705 50 ul ya da 1 ml PS bir toplam hacim içinde floresan olmayan 48 nm polistiren mikro 97,2 ul ya da plastik fotometrik küvetleri. Bu iki taraf arasındaki toplam hacmi başına benzer katı bir yüzey alanı sağlamaktadır.
  2. Standart siyah bant veya ışığı bloke edebilen diğer bazı opak malzeme ile üçüncü bir küvet kaplayarak bir ışık kaynağı küvet hazırlayın. Dikkatlice küvet ters tarafta iki özdeş optik pencere hazırlar.
  3. Doğrudan ışık kaynağı küvet her iki yanı üzerine önceden doldurulmuş küvetler yerleştirin. V'luk bir 1 ml'lik bir şişe ekleme fischeri veya diğer kültür (yani ışıldayan E. coli veya Photobacterium sışık kaynağı küvete taze altkültürlerden p) ve herhangi bir ışık kirliliği azaltmak için böyle siyah kağıt gibi opak bir malzeme ile örtün.
  4. Sırasıyla maruz kalma süreleri 10, 30, ve 30 saniye ile birlikte, bu tür toplam ışık ve 710-730 nm emisyon filtreleri gibi uygun emisyon filtreleri altında üç küvetler görselleştirmek.
  5. Merkez küvetten gelen eşdeğer ileri mesafelerde hem dış küvetler yeniden konumlandırmak ve yeniden görselleştirmek. 3cm son yüz-yüze (azaltılmış hacmi küvete merkezi) mesafe elde edilinceye kadar tekrarlayın. Her adımda, QD705 yerini doğrulamak için bir floresan görüntü (450-480 nm uyarma, 710-730 nm emisyon) kazanır.

4. Potansiyel YAKIT Çiftleri Araştırılması

  1. Diğer negatif kontrol olarak floresan olmayan nanopartiküller ile bir flüorofor ya da ilgi konusu bir floresan nanoparçacık birinde ve PS veya PS birini içeren 1 ml çözümler ile iki azaltılmış hacimli küvetler doldurun. The çalışma Tablo 1 'de gösterildiği gibi potansiyel ticari olarak temin edilebilen YAKIT florofor ve floresan nanopartiküllerin çeşitli incelenmiştir, burada gösterdi.
  2. Taze V'luk bir 1 ml'lik bir şişe ekleme fischeri veya ters tarafta bulunan iki fiziksel olarak eşit optik pencerelerini içeren bir karartılmış üçüncü küvete diğer ışıldayan bakteri. Bu siyah bir kağıt parçası gibi bir opak madde ile küvet örtün.
  3. Kısa ama eşit mesafe yerde iki hacminde karartılmış küvetin iki tarafında küvetler ve uygun filtrelerin altında görselleştirmek. Burada, 0.7 cm'lik bir mesafe kullanılmıştır. Diğer fluoroforlar tekrarlayın.

5.. Hedeflenen YAKIT

  1. , Işık yayan bakterilerin özgü biyotinlenmiş antikorlar hazırlayın. K. Örneğin, burada birincil antikorlar spesifik pneumoniae (α-Kp) EZ-link Sülfo-NHS-LC-Biotin ihtiva eden bir çözelti kullanılarak biyotinile edilmiştir. 2 dakika boyunca santrifüje (1,500 x g) altında tuz giderme sütunları kullanılarak antikorlardan fazla reaktif çıkarın.
  2. Protein konsantrasyonunu belirlemek ve HABA tahlili ile antikor biyotinilasyon derecesini belirlemek için standart Bradford tahlili kullanarak.
  3. 16 biotin Ab başına artıkları ve nihai bir ikame son derece ile sonuçlanan, 40 ul α-Kp antikor ile 100 ul (1 x PBS içinde çözülmüş 10 mM,) karıştırılarak α-Kp-biot biyotinile antikor (Ab) toplu halde elde edilir 10 mg ml -1 protein konsantrasyonu.
  4. Birden kullanılarak gece boyunca kültürler çoğaltmak uygun protokol aşağıdaki belirtilen antikorlar ile yıkandı bakterileri.
    1. Özel olarak, yıkama K. 1x PBS pneumoniae ve 4 OD'ye 1x PBS içinde tekrar süspansiyon (yaklaşık 4 x 10 ml 8 CFU -1 OD -1).
    2. Her çoğaltmak için, 100 ul PBS inkübe, α -Kp antikorları (kontrol için 10 ul α-Kp-biotB ya da 10 | il PBS) ile 30 ° C'de 90 dakika boyunca 100 ul hücre 196 ul PBS 1x PBS içinde hücreleri üç kez yıkayın ve tekrar süspansiyon.
  5. QD705 streptavidin bağı ile hücreleri etiketlemek ve iki eşdeğer ciltlik bölün.
  6. Bir çözüm üç kez yıkayın ve sonra uygun hacim içine tekrar süspansiyon.
  7. , Siyah 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine içine yıkanmış ve yıkanmamış çözümler 100 ul dağıtın. Çıkan toplam Işığında ışıldama, 490-510 nm ve 710-730 nm filtreler ölçün. Florofor konsantrasyon 450-480 nm eksitasyon ve 710-730 nm emisyon kullanılarak belirlenebilir.

Representative Results

Rezonans Enerji Transferi (RET) parlak bir verici ile ayrıldığı vericiden enerji kuvvetli dipol-dipol etkileşimi 13 yoluyla kabul eden bir floresan tepkisi indükleyebilen sayede bir flüoresan alıcıya arasında bir radyatif olmayan etkileşimdir. Kemilüminesan floresan 23, 24, 13 ve biyo-lüminesan donörler kullanılarak tarif edilmiş olmasına RET, temel olarak gereken: verici emisyon ve uyarım kabul eden spektrumları arasındaki 1 güçlü spektral örtüşme;. 2 iki taraf arasında uygun dönme hizalama.; ve 3. 0.5-2-kat daha büyük bir çalışma mesafesi verici ve alıcı 17 arasında Förster yarıçapı, R 0,. RET aksine, yakıt bir biyolojik olarak ışık veren bakteri gibi bir lüminesan kaynağı, bir florofor ya da bir floresan nanopartikül olarak emilir ve ikinci bir kuruluş tarafından yeniden yayılan foton yayar zaman meydana gelen kırmızı değiştiren emisyon SPECTOrijinal Işıklı kaynağının rum. Bu nedenle, yakıt odaklanmış bir uyarım kullanılmadan henüz epifluorescent standart koşullara benzer bir standart uyarma emisyonu işlemi takip eder. Bu kanıtı, ışık yayan bakterilerin kolayca ve son derece fluoresan noktaların basit karıştırma ile gözlenebilir. QD705 olmayan bir floresan polistiren mikro küre kontrol (Şekil 1A) ile karşılaştırıldığında, aynı zamanda çözelti içinde iken Vibrio sp varlığında, kırmızı sinyalinde önemli bir artış gözlenmiştir. Işıldaması, esas olarak aldehit alt tabaka, lusiferaz, ve ATP oluşturmak için gerekli parçalar, tüm üretilen ve sitoplazma içinde yer alır. Ayrıca, enzimsel luminofor üretim bakteriyel sitoplazmada (Şekil 1 B) içinde gerçekleşir. Başka bir yerde rapor edildiği gibi, bakteri, iç ve dış membran arasındaki mesafe, tipik olarak 30 nm 25-27, önemli RET izin vermez bir mesafedeoluşmaya. Hiçbir endositoz veya alımının diğer araçlar olmadığından yanı sıra, floresan nanopartiküller bakteri sitoplazma içine geçmez. Birlikte, bu kısıtlamalar YAKIT ışık yayan bakteriler floresan nano partiküller ile karıştırılır oluşur baskın uyarma emisyonu fenomen olduğunu göstermektedir.

Daha önce görüldüğü gibi, YAKIT RET aralığının ötesinde var. Mesafe YAKIT bağımlılığını incelemek için, standart spektrofotometrik küvetleri azaltılmış hacimli bir çözeltiyi içeren bir flüorofor, dağılım için kontrol edilebilir, uygun bir kontrol içeren bir ikinci, ve üçüncü, taze lüminesan çözeltisi bir kısım içeren, kullanılabilir. Bu, merkezi küvet lüminesan kaynaktan herhangi bir potansiyel açık kirlenmeyi azaltmak için, karşıt yüzeylerinde bulunan en az iki adet optik pencere ayarları, siyah bant veya başka bir opak malzeme kullanılarak saran esastır. Ayrıca, geri kalan iki küvetleri gerekmerkezi küvetin her iki tarafına eşit uzaklıkta yerleştirilir. Son olarak, yeni bir lüminesan çözelti, bakteri veya kemilüminesans kullanılarak, maksimum ışık üretimi sağlamak için her bir deney ile kullanılmalıdır. Uygun yerleştirilmesi üzerine, arzu edilen filtrelerin altında lüminesans sinyali elde. Ikincisi sadece veriler gösterilmektedir olsa da toplam ışık ve 710-730 nm filtreler, bu durumda kullanılmıştır. Her kazanılmasından sonra, 3 cm (Şekil 2) 1.0 cm'den aşamalı yüz yüze mesafeyi artırın. Son olarak, parlak noktaya tüm verileri normalleştirmek. Burada kullanılan örneklerde, bu parlak kaynağı ile QD705 içeren küvet arasındaki en kısa mesafe (D = 1 cm) meydana geldi. Bu yaklaşımı kullanarak, uygun bir YAKIT sinyali son elde etme herhangi bir optik emme yokluğunda, yakıt olası rezonans enerji transferi ötesinde uzaklıklarda gerçekleşebilir, öne ve yalnızca tamamen ışınımsal olarak açıklanabilir kadar gözlemlenebiliretkisi. Verileri takılması bir D -1 D -2 bağımlılığı aşağıdaki D mesafesinin bir fonksiyonu olarak bir sinyal bir azalma ortaya koymaktadır. Geometrik konfigürasyonuna bağlı olarak, kondansatör mesafe bağımlılığı ve nokta kaynaklar için ters kare yasasına ikincisine eski karşılık gelir. Bu sonuç, küvet açıklığın boyutu ve parlak kaynağı ve fluorofor arasındaki mesafe göz önüne alındığında, bu nedenle genel olarak satın alma kurulumu ile tutarlıdır.

YAKIT kuantum noktaları için de geçerlidir, fakat, aynı zamanda seri Alexa floresan mikroküreler (Tablo 2) arasında değişen florofor geniş bir yelpazede kullanılarak gözlenebilir değil. Denetim benzer olduğu için, çeşitli florofor eşit konsantrasyonlarda kullanılmalıdır ve nanopartiküllerin toplam yüzey alanı (Tablo 1) sabit tutulur. Onların uygun kontrollerin olmayan floresan (PS veya PS için florosforlar ve nanopartikülleri karşılaştırarakpolistiren mikro-), sinyalde önemli bir artış, her bir varlık floresan emisyon maksimum görülmektedir. Sinyal en büyük nispi artış, floresan emisyon en fazla ışık yayan en fazla emisyon en uzak olduğu yerde meydana geldiği bulunmuştur. Bu, parlak kaynağının geniş emisyon spektrumu ile karşılaştırıldığında, floresan sinyalinin artan özgüllüğüne muhtemeldir. Maksimum emisyon değerleri, iki iyi ayrılmış değildi zaman Aksine, en az güvenilir YAKIT sinyali bulundu. İlginç bir şekilde ayırt edilebilir YAKIT sinyal kordonu (350 fluorescein eşdeğer) başına mevcut fluorofor önemli miktarda nedeniyle büyük olasılıkla spektral fark çok az olsa da Sarı mikrosferler ile bulunmuştur. Burada gösterilen sonuçlar, uygun koşullar altında, Yakıt i altında hem daha uygun uygulamalar için seçilen probların Uyarlama sağlayan florofor çeşitli ile elde edilebileceğini göstermektedirn vitro ve in vivo koşullarında. Gözlenen YAKIT sinyalinin önemi, bir standart iki-kuyruklu Student t-testi kullanılarak tespit edilmiştir. Bu nedenle, sadece Alexa555, kullanılan ışık yayan kaynağı ile uyumlu olduğu bulunmuştur.

Yakıtla hedefleme etkilerini araştırmak amacıyla, biyotinlenmiş antikorlar parlak bakteri ve streptavidin-bağlı QDS hedeflemek için kullanılmıştır. Bu, bakteriler ya da lüminesans kaynak luminofor ve karşılık gelen fluorofor arasında RET olasılığını en aza indirmek için yeterli kalınlıkta bir tabaka sağlamak önemlidir. Inkübasyon ve bağlanmamış antikor kaldırmak Yıkama işleminden sonra, biotin etiketli bakteriler kontrol olarak, bölünmüş çözeltiler ve çıkarmak için daha fazla yıkama maruz kalan bir seti, her bir non-yapışık streptavidin-konjuge QD705 veya non-fonksiyonalize QD705 ya maruz QD705. Burada, dört koşulları için, elde edilen toplam ışık ışık yayılması, 490-510 nm altında gözlendi bird sadece son iki filtreler veri analizi için kullanılan olsa 710-730 nm filtreler. QD705 mevcudiyeti 450-480 nm eksitasyon ve 710-730 nm emisyon filtreleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Çözümleri yıkanmamış devlet (Şekil 3) sol zaman soruşturma sırasında biz kırmızı-kaymıştır sinyal hiçbir farkı çok az bulduk. Bu şartlar altında, elde edilen flüoresan sinyali de QD705 eşit sayıda hem de hedefli ve hedefli olmayan durum altında mevcut olduğunu düşündürmektedir, oldukça benzer olduğu bulunmuştur. Ancak, herhangi bir bağlanmamış QD705 çıkarmak için yıkama bunların örnekleri hedefli olmayan kontrol ile karşılaştırıldığında hedeflenen bakteriler için göreli kırmızı sinyalinde yaklaşık iki kat bir artış sağlar. Floresan tarafından incelenmesi QD705 varlığını ya da yokluğunu doğrulamak için kullanılabilir. Nispeten, hedeflenen yıkandı durum neredeyse üç kat yıkanmamış durum daha az, ancak sadece azalmıştır edilen kırmızı-kayma bir floresan yoğunluğu ile sonuçlanmıştır% 30, tamamen bağlanmış koşullar altında bakteri hedefleme kırmızı kaydırılır emisyonunda bir artışa neden olur olduğunu düşündürmektedir. Bu güçlü gelecekteki uygulamalar için hedeflenen YAKIT yarar etkisi altına alıyor.

Şekil 1
Şekil 1., Işık yayan bakterilerin ve ticari olarak temin edilebilen kuantum noktaları arasında bir etkileşim YAKIT kırmızı foton üretiminde bir artışa yol açar. Iki spektrofotometrik küvetleri taze V'in 100 ul alikotları içeren çözeltiler ile doldurulmuştur Bir IVIS Spectrum ve kazanılmış emisyon spektrumu içine yerleştirilmeden önce bir 1-1,5 arasında OD 600, PS 895 ul ve QD705 ya da fizyolojik tuzlu su (PS) 5 ul, ya ile fischeri kültürü. Kırmızı sinyalindeki anlamlı bir artış nedeniyle varlığına elde edilirQD705, 710-730 nm emisyon filtresi (A) altında kontrol ile karşılaştırıldığında sn -1 • cm -2 (p • sn -1 • cm -2) • saptanan fotonların artış kaydedilmiştir gibi. Burada, bakterilerin iki zar lüminesan kısımların (mavi daireler) etkileşimini ve QD705 (siyah daireler) içermez. Ikinci serbestçe yığın solüsyonu (B) dağıtılır ise eski tek bakteriyel sitoplazmada bulunurlar. Her bakteri çözüm için = 3 N. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
YAKIT Şekil 2.. Kanıt mesafeleri İndr'leri üzerinde meydana gelenetely rezonans enerji transferi hariç. spektrofotometrik küvetleri QD705 50 ul ve fizyolojik tuzlu su içinde 950 ul (PS) veya floresan olmayan bir 48 nm polistiren mikro 97,2 ul ve PS 902,8 ul ya da ihtiva eden çözeltileri ile doldurulmuş, ve zıt tarafta eşit uzaklıkta yerleştirildi OD 1-1,5 600 taze ışıldayan Photobacterium sp 1 ml içeren merkezi bir siyah küvetin. Merkezi küvet yayılan foton serbestçe dağılmasını sağlayan iki özdeş optik pencere vardı. 1.0 cm den 3 cm'ye kadar değişen mesafeleri (D) de görüntü edinme, kırmızı ışık gözlenen üretim YAKIT rezonans enerji transferi ile başarılamayan uzaklıklarda gerçekleşebilir kanıtlar gösteren mesafenin bir fonksiyonu olarak düşmüştür. Yoğunluğu ters kare kanunu (sol) benzer D -2 bağımlılığı, sahip çıktı. Aynı protokol E için izlenmiştir coli (sağ). Oluşan trend çizgileri kavram tha form tutunt bakteriler ışık nokta kaynak olarak hareket edilmektedir. Üç bağımsız mesafe ölçümleri toplam benzersiz bir altkültür kullanarak her ile elde edildi. Hata çubukları, her noktada bulunmaktadır. Bazı durumlarda hata çubukları normalize yoğunluğunu belirtmek kullanılan semboller daha küçük idi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3.. Hedefli (spesifik) ve non-hedefli (dökme çözelti) YAKIT. K. arasında bir karşılaştırma pneumoniae biyotinlenmiş antikorlar ile fonksiyonalize ve daha sonra streptavidin-etiketli (Hedeflenen) veya etiketli olmayan (non-Hedefli) QD705 ya maruz bırakıldı. Elde edilen çözeltiler, eşit divi idided ve bir set PBS içinde başlangıç ​​hacminin içine yeniden süspansiyon haline önce üç kez PBS ile yıkanmıştır. Çözeltiler daha sonra siyah 96 oyuklu plaka (mavi bar olarak gösterilen) 490-510 nm (500 nm) ve 710-730 nm (720 nm) emisyon filtreleri altında gözlenen biyolüminesensin ayrı gözlere dağıtıldı. P • sn -1 • cm -2, her bir kuyu için 720 nm filtreye bulundu ilgili p • sn aynı kuyunun 500 nm -1 • cm -2 biyoışıldama şiddeti normalize edildi. Bir epifluorescent uyarma kaynaklanan nispi flüoresan yoğunluğu 450-480 nm eksitasyon ve 710-730 nm emisyon filtreleri (kırmızı çubukları olarak gösterilmiştir) kullanılarak belirlendi. Biyolüminesan veya floresan sinyal hiçbir farkı az yıkanmamış koşullarında (Unwashed Non-Hedefli ve Unwashed Hedefli) altında gözlendi. Bu sınır ve serbest yüzen QD705 biyolüminesens fotonlar tarafından eşit heyecanlı olduğunu göstermektedir. Yıkama, n üzerinegöreceli kırmızı sinyal erken bir, iki kat fark kontrol (Non-Hedefli Yıkanmış) ile karşılaştırıldığında (Yıkanmış Hedeflenen) QD705 etiketli bakteriler için gözlenmiştir. Non-Hedefli Yıkanmış in QD705 olmaması flüoresan sinyal eksikliği ile teyit ve Hedefli Yıkanmış halde QD705 etiketleme doğrulandı. Veriler, K. dört bağımsız kültürlerden olan pneumoniae. netlik için, efsane QD705 uyarma kaynağını gösterir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

width: 108px; "> Alexa 700 height: 22px; width: 108px; "> QD800
Fluoroforun Konsantrasyon ul PS (ul) λ max ex / em (nm) Emisyon Filtre (n m)
Alexa 555 37.2 iM 4.77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37.2 iM 4.77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37.2 iM 4.77 995,23 632/637 650-670
37.2 iM 4.77 995,23 702/723 710-730
Nonfluorescent % 2.62 katı 9.72 990,28
μSph Pink % 5 katı 4.77 995,23 580/605 610-630
μSph Sarı % 5 katı 4.77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 mcM 5 995 465/705 710-730
2 mcM 5 995 465/705 790-810

Tablo 1.. YAKIT gösteriler boyunca kullanılan Flüoroforlann Özellikleri.

<td> 6.05 x 10 4
Kontrol filtre Fluorofor Kontrol p değeri
p · sn -1 · cm -2 SD p · sn -1 · cm -2 SD
A555 PS 580 1.08 x 10 7 3.31 x 10 6 9.09 x 10 6 1.75 x 10 6 0.233
A568 PS 600 8.47 x 10 6 4.23 x 10 6 4.49 x 10 6 9.71 x 10 5 0.094
A633 PS 660 2.40 x 10 6 1.25 x 10 6 7.85 x 10 5 2.39 x 10 5 0.046
A700 PS 720 5.53 x 10 5 2.46 x 10 5 1.54 x 10 5 0.026
MSPH Sarı non-floresan μspheres 520 1.19 x 10 8 4.85 x 10 7 5.79 x 10 7 1.99 x 10 7 0.057
MSPH Pink non-floresan μspheres 620 2.37 x 10 7 1.36 x 10 7 2.16 x 10 6 8.00 x 10 5 0.026
QD705 non-floresan μspheres 720 1.76 x 10 7 7.33 x 10 6 2.08 x 10 5 7.16 x 10 4 0.007
QD800 non-floresan μspheres 800 7.79 x 10 6 4.72 x 10 6 3.60 x 10 4 1.52 x 10 4 0.023

Fluoroforlar ve YAKIT ile uyumlu floresan nanopartikülleri Tablo 2.. Tanımlama.

Discussion

Yakıtın temel gösterilmesi sadece flüoresan nanopartiküller ya da QDS ile lüminesan bakteri karıştırılarak elde edilebilir. İki kişiler fiziksel olarak ayrılmış ve herhangi bir etkili RET mesafe ötesinde kalır edilecektir. Daha zor in vitro ve in vivo hem de YAKIT sinyal iyileştirmedir. In vitro koşullar altında, ve bir optik absorber mevcut olmadan, hem de genellikle aşırı fluorofor eklenmesinin YAKIT tepkisini maksimuma çıkarmak için yeterli olacaktır. Ancak, bu tür statik veya çarpışma su verme gibi yüksek konsantrasyonlarda olgulara floresan sinyalinin bir kaybına yol açabilir. Bağımsız bir şekilde, ışık yayan kaynağı ve fluorofor konsantrasyonu değiştirilerek bir seyreltme serisi yapılması istenen konsantrasyonları optimize etmek için yardımcı olacaktır. Vivo konsantrasyonlarda altında kurulması ve yakıt optimizasyonu çok daha zordur ve bir vaka-by-case bazında ele alınması gerekiyor. Bir co oluşturmak zor olabilirndition floresan varlık ışıldayan kaynağı tarafından optik ulaşılabilir nerede. Bu nedenle, her iki kısımların doğrudan eş enjeksiyonu ile başlayan ve optimal koşullar altında YAKIT başarısı ile ilgili bilgiler sağlayabilir.

Standart protokoller örneğin Alexa serisi ve QDS gibi floresan elemanlar ile etiketleme bakteri ve ökaryotik hücreler için vardır. Genellikle bu azalması hücre canlılığı veya değiştirilmiş metabolik aktivite gibi istenmeyen etkilere yol açabilir antikorlarla yüzey işlevselleştirilmesini veya aktivasyon gerektirir. Bunun üstesinden gelmek için, bu antikor veya aktivasyon maddesinin optimal miktarı flüoresan etiketleme maksimize ederken, hücresel bozulmaları en aza indirir gerekli belirlemek için önemlidir. QDS kullanılması nedeniyle tipik olarak geniş uyarma spektrumları, dar ve ayarlanabilir emisyon spektrumları ve büyük bir Stokes kayması olasılığı avantajlıdır. Bununla birlikte, QDS sitotoksik olabilir ve bazı durumlarda arzu edilir olmayabilir.

13 bulunur ve Işıklı ve floresan çeşitli kaynaklardan için geçerli bir olgudur. Şimdiye kadar, yakıt edilen fotonlar, spesifik olmayan etkileşimleri ya da kötü tasarlanmış deneylerden elde edilen BRET talihsiz bir arka plan sinyalinin ürün olarak kabul edildi. Biz bu istenmeyen sinyalin programını belirlemek mümkün Burada gösterilen deney türü ile sadece. Gösterilen örneklerde, ışık yayan bakteriler floresan birimlerinin çeşitli standart bir floresan tepkisi ortaya çıkarma yeteneğine sahip bir yaygın uyarım kaynağı olarak hareket ederler. Üstelik, önemli bir çalışma mesafesine, bu YAKIT BRET oluşumu olmadan inşa edilebilir olsa da, genel olarak BRET yakıt katkısı olmadan gözlemlenemeyen sonucuna güvenlidir. Önemli bir şekilde, bir hedef ihtiyacının olmaması nedeniyle, yakıt BRET ve c arasında bulunan uzaysal açığı için kullanılabilironventional bütün hayvan görüntüleme teknikleri.

Disclosures

Yazarlar mali çıkarlarının rekabet beyan. JD, SB, KLR ve SLS Avrupa Patent EP10290158.4 katkıda ve Dünya Fikri Mülkiyet Örgütü Patent Başvurusu WO/2011/117847.

Acknowledgements

Yazarlar JD, AH ((SLS), AB-FP7 programı "Otomasyon", Institut Carnot Programı 11 (JD, CS, CS) New York Pasteur Vakfı'nın maddi destek için şükranlarını sunarım , AR, RT, SLS) ve RT, SLS Projesi IMNOS (), Conny-Maeve Vakfı (SLS), Moleküler Görüntüleme European Masters (BT), Bölge Ile de France programları MODEXA (SLS), SUSAM (SLS) ve DimMalInf (SLS, RT), Biologie-Santé en ANR Program Grandes Investissement de L'Avenir Altyapılar Nationales: Fransa LifebioImaging (FLI) Fransa Yaşam Görüntüleme (RT, SLS), Fransa Biyogörüntüleme (JD, SLS) ve Institut Pasteur, Paris. Ayrıca, yazarlar reaktifler için, José Bengoechea ve Herbert Schweizer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, yazarlar antikorları oluşturulan Cindy FEVRE teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats