En Step Beyond BRET: Fluorescens af Unbound Ekscitation fra Luminescence (BENZIN)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Udvidelse af fundament og anvendelighed af fluorescens ved Ubundet Ekscitation fra Luminescence (BENZIN) ved at kortlægge de relevante principper og demonstrere dens forenelighed med et væld af fluorophores og antistofbaserede målrettede betingelser.

Cite this Article

Copy Citation

Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens af Unbound Ekscitation fra Luminescence (BENZIN) er en radiativ excitation-emission proces, der producerer øget signal og kontrastforbedring in vitro og in vivo. FUEL deler mange af de samme grundlæggende principper som Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET), endnu i høj grad adskiller sig i de acceptable arbejdsvilkår afstandene mellem selvlysende kilden og fluorescerende enhed. Mens BRET reelt er begrænset til maksimalt 2 gange Förster radius, almindeligvis mindre end 14 nm, kan BRÆNDSTOF forekomme ved afstande på op til pm eller endog cm i mangel af en optisk absorber. Her er vi udvide fundamentet og anvendeligheden af ​​FUEL ved at gennemgå de relevante principper bag fænomenet og vise sin kompatibilitet med en bred vifte af fluorophores og fluorescerende nanopartikler. Yderligere er nytten af ​​antistof-målrettede BRÆNDSTOF udforsket. De her viste eksempler dokumenterer, at FUEL kan anvendes til applaf tekniske data, hvor BRET ikke er muligt, fylde den rumlige tomrum, der eksisterer mellem BRET og traditionel hele dyr billeddannelse.

Introduction

Den genetiske modifikation af organismer, såsom virus 1, 2, bakterier 3 eller små pattedyr 4 til enten fremkalde eller konstitutivt udtrykker bioluminescens, har været meget vellykket og bredt demonstreret 5-7. Bioluminescens, en in vivo kemiluminescerende reaktion, der involverer naturligt forekommende reagenser har den fordel at frembringe lys uden behov for en ekstern lyskilde. Som sådan, er selvlysende billedbehandling ikke lider under de almindelige ulemper ved auto-og ikke-specifikt signal fundet fra fluorescensimagografi 8. Følgelig bioluminescens har en betydelig signal-til-støj-forholdet, da enhver detekterede signal alene hidrører fra den tiltænkte kilde. Mens mange modeller har udnyttet lux operon fra Photorhabdus luminescens (maksimal emission centreret mellem 480 og 490 nm) til in vitro og in vivo-applikationer 9, dets anvendelse i små mammals har været problematisk på grund af selve karakteren af ​​de billeddannende betingelser; pervading eksistens af optiske absorbere, såsom hæmoglobin, og scattering midler, såsom væv og knogler, i høj grad påvirker blå til gul bølgelængder 3. Udtrykket af en manipuleret ildflueluciferase (maksimal emission ved 617nm) er for nylig blevet udviklet og indarbejdet, hvilket giver et værktøj, der i høj grad overvinder optisk absorption 10, men er stadig genstand for spredning effekter.

Som reaktion herpå har der været flere forsøg til rød-skift det udsendte signal til den ønskede optiske vindue af 650-900 nm, en region i minimeres absorption og spredning ved hjælp af bioluminescens resonans energi overførsel (BRET) 11-13. Som et middel til at forbedre detekteringssignal, BRET, som bruger en bioluminescerende kilde som donor og en ekstra fluorofor som acceptor har fundet begrænset succes. Som en skelsættende eksempel på dette fænomen, "selvlysende kvantepunkter4.; (SIQDs) 14 består af modificeret Renilla reniformis luciferaser bundet til den ydre polymer-lysin lag af kommercielt tilgængelige kvantepunkter (QDs). Efter substrat desuden den resulterende bioluminescensreaktion inducerer fluorescensemission fra QDs, genererer en betydelig produktion af røde fotoner. Imidlertid har disse SIQDs begrænset anvendelighed in vivo visualisering af fysiologisk relevante begivenheder. Denne begrænsede anvendelse er sandsynligvis på grund af vanskeligheden ved at forbinde to probe til det organ, celle eller genet af interesse, da SIQDs ikke kan være genetisk kodet, og derfor ville kræve en sekundær modifikation af polymeren skallen. For at forbedre deres anvendelighed, alternative SIQDs, hvor luciferaserne er bundet direkte til selvlysende kerne, er for nylig blevet ansat 15. Opbygning off af SIQD-koncept blev en mere anvendelig BRET systemet opnås ved at knytte Cypridina luciferase til en idocyanine farvestof 16, som var i stand til specifikt at målrette tumorer i mus, mens der producerer en væsentlig rødforskydning fra 460 nm til 675 nm. At gennemgå ikke-radiativ energioverførsel, BRET følger de samme primære begrænsninger som sin fluorescerende modstykke: Der skal være en stærk spektral overlapning mellem donor emissionen og acceptor excitationsspektre og arbejdsmiljø afstanden mellem de to dele skal være på rækkefølgen af ​​de Förster radius (5-14 nm afhængig af donor-acceptor pair, med en effektiv maksimal afstand på to gange Förster radius 17). Denne afstand afhængighed i høj grad begrænser de typer af begivenheder, der kan observeres ved hjælp BRET som et middel til at øge afsløring.

For nylig blev en ny fremgangsmåde blev identificeret og påvist under både in vitro og in vivo. Opbygning off grundlaget for BRET, Fluorescens af Unbound Ekscitation fra Luminescence (BENZIN) 18, 19 Escherichia coli, der udtrykker lux operonet og QDs 18, 19. Mens eksperimentelt ligner SIQDs eksisterer en fundamental forskel: i FUEL, er det ikke nødvendigt for selvlysende kilde til at være fysisk bundet til fluoroforen, som giver mulighed for genetisk kodning af det luminescerende probe. På grund af den vellykkede påvisning af brændstof mellem selvlysende bakterier og QDs, er det muligt, at denne teknik kunne anvendes til både overfladisk (hud) og dybe væv (lunge, lever) infektioner såsom Staphylococcus aureus og Klebsiellia pneumoniae.

Siden rapporten fra sin eksperimenterende betydning har FUEL udviklet sig til at omfatte en robust matematisk model 20, der kan bruges til at forudsige acceptabel selvlysende og fluorescerende par, og dens anvendelsesmuligheder er udvidet til at omfatte brug i identifikation af fotofysiske karakteristika såsom kvantumudbyttet. Vi beskriver nedenfor nogle af de grundlæggende teknikker for brændstof. Først viser vi bevis for dette fænomen over både korte (um) og lang (cm) arbejder afstande, der fundamentalt adskiller FUEL fra BRET. For det andet, vi udvide de mulige FUEL par ved at undersøge en bred vifte af fluorophores og fluorescerende nanopartikler. Omfatd, er FUEL applikationer undersøges ved at sammenligne målrettede og ikke-målrettede FUEL par.

Protocol

1. Reagenser

  1. Køb eller udvikle selvlysende bakterier og egnede dyrkningsmedier såsom modificeret Escherichia coli, der udtrykker lux ABCDE 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22..
  2. Forbered fysiologisk saltvand (0,9% NaCl) og kultur medieløsninger ifølge standard opskrifter. E. coli og K. pneumoniae blev dyrket i Luria Bertani (LB) ved 37 ° C, og V. fischeri og Photobacterium sp i LB suppleret med 0,5 M NaCI ved 22 ° C.
  3. Køb eller erhverve fluorescerende prober såsom Q-tracker 705 (40 nm i diameter, kaldet QD705), Q-tracker 800 (40 nm i diameter, kaldet QD800), fluorescerende (40 nm i diameter) og ikke-fluorescerende polystyrenmikrosfærer ( 48 nm i diameter), og konventionelle fluorescerende farvestoffer.
  4. Forberede de nødvendige reagenser til bakteriel mærkning.
  5. Sikre adgang tilet helt dyr bioluminescens billeddanner, såsom en IVIS Spectrum, som er i stand til at detektere signal under en bred vifte af emissionsbølgelængder og eksponeringstider. En Pladelæser bioluminescens målinger vil være tilstrækkeligt for de fleste af de eksperimenter der er beskrevet her.

2.. Grundlæggende sammenfatning af brændstof

  1. Begyndende fra individuelle kolonier på standard dyrkningsplader starte overnatskulturer af selvlysende bakterier. Her V. fischeri blev brugt.
  2. Dagen for eksperimenter, indleder friske subkulturer og give dem mulighed for at udvikle sig, indtil en OD600 på 1-1,5 er opnået. For at frembringe sammenlignelige resultater er det bedst at bruge bakterier i lignende vækst stater, hvor de producerer intense signaler. Dette kan sikres ved at holde OD600 konstant.
  3. Kombiner portioner af 100 gl fra hver med enten 5 ul QD705 eller fysiologisk saltvand (PS), og derefter tilføje til 895 ul PS i standard spektroskopiske kuvetter. Placer de fyldte kuvetter i IVIS Spectrum og tage målinger under de relevante filter sæt. Her blev emission filter 710-730 nm anvendes.

3.. FUEL Over varierende afstande

  1. Fyld to reducerede volumen (1 ml) plastik fotometriske kuvetter med enten 50 ul QD705 eller 97,2 pi ikke-fluorescerende 48 nm polystyrenmikrosfærer i et samlet volumen på 1 ml PS. Dette sikrer lignende fast overfladeareal pr samlede volumen mellem de to enheder.
  2. Forbered en lyskilde kuvette ved at omslutte en tredje kuvette med standard sort tape eller andet uigennemsigtigt materiale er i stand til at blokere lys. Forberede forsigtigt to identiske optiske vinduer på modstående sider af kuvetten.
  3. Placer de tidligere fyldte kuvetter direkte på hver side af lyskilden kuvette. Tilføj en 1 ml portion af V. fischeri eller anden kultur (dvs. luminescerende E. coli eller Photobacterium sp) fra en frisk subkultur i lyskilden kuvetten og dække det med et uigennemsigtigt materiale, såsom sort papir for at reducere nogen lys forurening.
  4. Visualiser de tre kuvetter under de relevante emissionsfiltre såsom alt Lys og 710-730 nm emission filtre, med eksponeringstider på 10, 30 og 30 sek, hhv.
  5. Flyt både eksterne kuvetter ved ækvivalente yderligere afstande fra den centrale cuvette, og derefter visualisere igen. Gentag, indtil en endelig ansigt-til-ansigt (central reduceret volumen kuvette) afstand 3cm er opnået. På hvert trin, erhverve en fluorescens billede (450-480 nm excitation, 710-730 nm emission) at validere QD705 placering.

4.. Undersøgelse potentielt brændstof Pairs

  1. Fyld to reducerede volumen kuvetter med 1 ml opløsninger indeholdende enten en fluorofor eller et fluorescerende nanopartikel af interesse i en, og PS eller PS med ikke-fluorescerende nanopartikler som den negative kontrol i den anden. I the arbejde påvises her, en række potentielle kommercielt tilgængelige FUEL fluoroforer og fluorescerende nanopartikler blev undersøgt som vist i tabel 1..
  2. Tilføj en 1 ml prøve af frisk V. fischeri eller andre selvlysende bakterier til en mørkelægges tredje kuvette indeholdende to fysisk lige optiske vinduer placeret på hver sin side. Dæk kuvetten med en uigennemsigtig substans, såsom et stykke sort papir.
  3. På et kort, men lige stor afstand sted de to reducerede volumen kuvetter på begge sider af den mørkelægges kuvette og visualisere under de passende filtre. Her blev en afstand på 0,7 cm anvendes. Gentag med de andre fluoroforer.

5.. Målrettet BRÆNDSTOF

  1. Forbered biotinylerede antistoffer specifikke for de luminescerende bakterier. For eksempel er her primære antistoffer specifikke for K. pneumoniae (α-Kp) blev biotinyleret ved anvendelse af en opløsning indeholdende EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin. Fjern overskydende reagens fra antistofferne ved hjælp afsaltningen afdrypper kolonner under centrifugering (1.500 xg) i 2 min.
  2. Brug et standard Bradford assay for at bestemme proteinkoncentrationen og bestemme graden af ​​antistof biotinylering af HABA-assay.
  3. Finde α-Kp-biot biotinyleret antistof (Ab) partier ved at blande 100 pi (10 mM, opløst i 1 x PBS) med 40 pi α-Kp-antistof, hvilket resulterer i en endelig substitutionsgrad på 16 biotin rester pr Ab og en afsluttende proteinkoncentration på 10 mg ml-1.
  4. Brug af flere overnight replikere kulturer, målrette de vaskede bakterier med de førnævnte antistoffer efter den relevante protokol.
    1. Konkret vaske K. pneumoniae i 1x PBS og resuspender i 1x PBS til en OD på 4 (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1).
    2. For hver kopiere, inkuberes 100 ul PBS, α -Kp antistoffer (10 pi α-Kp-biotB eller 10 pi PBS for kontrol) og 100 celler ul i 90 minutter ved 30 ° C. Vask cellerne tre gange i 1x PBS og resuspender i 196 pi PBS.
  5. Mærk cellerne med QD705 streptavidinkonjugat og opdele dem i to ækvivalente rumfang.
  6. Vask én løsning tre gange og derefter resuspenderes det i passende mængde.
  7. Fordel 100 ul af det vaskede og uvaskede løsninger til individuelle brønde i en sort 96-brønds plade. Mål den resulterende luminescens under alt lys, 490-510 nm og 710-730 nm filtre. Fluorophor koncentration kan bestemmes ved hjælp af 450-480 nm excitation og 710-730 nm emission.

Representative Results

Resonance Energy Transfer (RET) er en ikke-radiative interaktion mellem en luminescerende donor og en fluorescerende acceptor, hvorved energien fra forladt donoren er stand til at inducere fluorescens svar fra acceptoren gennem en stærk dipol-dipol vekselvirkning 13. RET, som er blevet beskrevet ved hjælp af fluorescerende 23 kemiluminescerende 24, og bioluminescerende 13 donorer, hovedsageligt kræver: 1. Kraftig spektral overlapning mellem donor-emissionen og ACCEPTER excitationsspektre. 2. Passende drejeopretning mellem de to enheder.; og 3.. en arbejdsgruppe afstand ikke større end 0,5 til 2 gange den Förster radius, R 0, mellem donor og acceptor 17. Kontrast til RET, opstår FUEL når et luminescerende kilde, såsom en bioluminescerende bakterier udsender en foton, der er absorberet og re-emitteres af en anden enhed, såsom en fluorofor eller et fluorescerende nanopartikel, rød-skiftende emission SPECTrom af den oprindelige luminescerende kilde. Således FUEL følger en standard excitation-emission afart standard epifluorescerende betingelser, men uden brug af en fokuseret excitation. Dokumentation for dette kan let observeres ved simpel blanding af luminescerende bakterier og stærkt fluorescerende quantum dots. I nærværelse af Vibrio sp, er en betydelig stigning i rødt signal observeret, når QD705 var også i opløsning i forhold til en ikke-fluorescerende polystyren microsphere kontrol (figur 1A). De nødvendige komponenter til at skabe bioluminescens væsentlige aldehydet substrat, luciferase, og ATP er alle fremstillet og indeholdt inden i cytoplasmaet. Endvidere forekommer den enzymatiske luminoforen produktionen i bakterielle cytoplasma (figur 1B). Som det er blevet rapporteret andetsteds, at afstanden mellem den indre og ydre membran af bakterier er typisk større end 30 nm, 25-27, en afstand, der ikke giver mulighed for betydelig RETat forekomme. Samt har de fluorescerende nanopartikler ikke krydse ind i den bakterielle cytoplasma da der ikke er endocytose eller andre former for optagelse. Sammen disse begrænsninger indikerer, at brændstof er den dominerende excitation-emission fænomen, der opstår, når selvlysende bakterier blandes med fluorescerende nanopartikler.

Som tidligere vist, eksisterer FUEL ud over området for RET. At undersøge FUEL afhængighed af afstand, kan standard reduceret volumen spektrofotometriske kuvetter anvendes med det ene indeholder en fluorofor løsning, en anden, der indeholder en passende kontrol, der kan styre for scatter, og den tredje indeholder en portion af frisk selvlysende løsning. Det er afgørende, at den centrale kuvette være indhyllet med sort tape eller andet uigennemsigtigt materiale, bortset fra mindst to identiske optiske vinduer placeret på modsatte flader, for at reducere enhver potentiel lys forurening fra luminescerende kilde. Yderligere, de resterende to kuvetter nødt til atplaceres ækvidistant på hver side af den centrale kuvette. Endelig en frisk luminescerende løsning ved hjælp af bakterier eller kemiluminescens, bør anvendes med hvert eksperiment for at sikre maksimal lysproduktion. Ved passende placering, erhverve luminescenssignal under de ønskede filtre. Den samlede Lys og 710-730 nm filtre blev anvendt i denne sag, men kun data fra den sidstnævnte vises. Efter hvert køb, øge trinvist ansigt-til-ansigt afstand fra 1,0 cm til 3 cm (Figur 2). Endelig normalisere alle data til det lyseste punkt. I de her anvendte eksempler skete dette i den korteste afstand (D = 1 cm) mellem selvlysende kilden og kuvetten, der indeholder QD705. Med denne fremgangsmåde kan levedygtig FUEL signal observeret op til den endelige overtagelse tyder på, at i mangel af en optisk absorber kan BRÆNDSTOF forekomme ved afstande ud over enhver mulig overførsel resonans energi og kan kun forklares som et rent strålingsmådevirkning. Montering af data afslører et fald i signalet som en funktion af afstanden D efter en D -1 til D -2 afhængighed. Afhængig af den geometriske konfiguration, de tidligere svarer til kondensator afstand afhængighed og sidstnævnte til den omvendte kvadrat lov for punktkilder. Dette resultat er derfor i overensstemmelse med vores samlede setup erhvervelse, givet størrelsen af ​​kuvetten åbningen og afstanden mellem det luminescerende kilden og fluorophoren.

BRÆNDSTOF gælder ikke kun quantum dots, men også kan observeres ved hjælp af en bred vifte af fluoroforer spænder fra Alexa række fluorescerende mikrosfærer (tabel 2). For at være sammenlignelige med kontrollen, bør anvendes lige koncentrationerne af de forskellige fluoroforer og det samlede overfladeareal af nanopartikler holdt konstant (tabel 1). Ved at sammenligne fluoroforerne og nanopartikler til deres passende kontroller (PS eller PS med ikke-fluorescerendepolystyrenmikrosfærer), er en betydelig stigning i signal observeret ved maksimalt hver fluorescerende enhed emission. Den største relative stigning i signal blev fundet at forekomme, hvor den fluorescerende maksimal emission var længst væk fra maksimum selvlysende emission. Dette er mest sandsynligt på grund af den øgede specificitet af det fluorescerende signal i forhold til det brede emissionsspektret af luminescerende kilde. Tværtimod blev den mindst pålidelige FUEL signal findes, når to emissionsmaksima var ikke godt adskilt. Interessant nok blev en mærkbar FUEL signal fundet med de gule mikrokugler selvom den spektrale forskel er minimal, skyldes mest sandsynligt, at den betydelige mængde af fluorofor til stede pr perle (350 fluorescein-ækvivalenter). De viste resultater indikerer, at under passende betingelser FUEL kan opnås med en række fluoroforer, som gør det muligt at skræddersy prober valgt til flere relevante ansøgninger under både jegn vitro og in vivo. Betydningen af ​​den observerede FUEL signalet blev bestemt under anvendelse af en standard to-halet Students t-test. Som sådan var det kun Alexa555 fundet at være uforenelig med selvlysende kilde anvendes.

For at undersøge effekten af ​​målretning på FUEL blev biotinylerede antistoffer bruges til at målrette selvlysende bakterier og streptavidin-linked QDs. Det er vigtigt, at de bakterier eller luminescens kilde tilvejebringe et lag tyk nok til at minimere muligheden for RET mellem luminoforen og tilsvarende fluorofor. Efter inkubation og vask for at fjerne ubundne antistoffer, er biotin-mærkede bakterier udsættes derefter for enten streptavidin-konjugeret QD705 eller ikke-funktionaliseret QD705 som kontrol de løsninger, opdelt og et sæt udsat for yderligere vask for at fjerne ethvert ikke-klæbet QD705. Her er for alle fire betingelser, blev den resulterende luminescens observeret under alt lys, 490-510 nm, end 710-730 nm filtre, selvom kun de to sidstnævnte filtre er anvendt til analysen af ​​data. Tilstedeværelsen af ​​QD705 blev sammenlignet under anvendelse af 450-480 nm excitation og 710 til 730 nm emission filter. Ved undersøgelse har vi fundet lidt eller ingen forskel i rødforskudt signal, når opløsningerne blev efterladt i en uvasket tilstand (figur 3). Den resulterende fluorescens signal under denne betingelse fundet at være ret ens, hvilket antyder, at et tilsvarende antal QD705 var til stede under både målrettet og ikke-målrettet tilstand. Men vask af prøverne for at fjerne enhver ubundet QD705 giver en næsten fordobling i relativ rødt signal til de målrettede bakterier i forhold til deres ikke-målrettet kontrol. Undersøgelse af fluorescens kan bruges til at kontrollere tilstedeværelsen eller fraværet af QD705. Forholdsvis, målrettet vasket tilstand resulterede i en fluorescensintensitet, der var næsten tre gange mindre end den uvaskede tilstand, men den resulterende rød-skift kun faldet med30%, hvilket tyder på, at under rent bundet betingelser målretning af bakterierne vil resultere i en stigning i rødforskudt emission. Dette implicerer kraftigt nytten af ​​målrettet FUEL for fremtidige ansøgninger.

Figur 1
Fig. 1. En BRÆNDSTOF samspil mellem luminescerende bakterier og kommercielt tilgængelige kvantepunkter fører til en stigning i rød foton produktion. To spektrofotometriske kuvetter blev fyldt med opløsninger indeholdende 100 ul portioner af frisk V. fischeri kultur med en OD600 på 1-1,5, 895 pi PS, og enten 5 pi QD705 eller fysiologisk saltvand (PS), inden den bringes ind i en IVIS Spectrum og emission spektrum erhverves. En betydelig stigning i rødt signal opnås på grund af tilstedeværelsen afDen QD705, som kan konstateres ved en stigning i påviste fotoner • sek -1 • cm -2 (p • sek -1 • cm -2) i sammenligning med kontrolgruppen under emissionen filteret 710-730 nm (A). Her dobbelt membran af bakterierne udelukker interaktionen af ​​luminescerende dele (blå cirkler) og QD705 (sorte cirkler). Førstnævnte findes kun i det bakterielle cytoplasma mens sidstnævnte frit fordeles i bulk-opløsning (B). N = 3 for hver bakteriel løsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2.. Bevis for FUEL opstået over afstande kompletely eksklusive resonansenergioverførsel. Spektrofotometriske kuvetter blev fyldt med opløsninger indeholdende enten 50 ul QD705 og 950 ul fysiologisk saltvand (PS) eller 97,2 pi ikke-fluorescerende 48 nm polystyrenmikrosfærer og 902,8 pi PS, og placeret lige stor afstand på hver sin side af en central sort kuvette indeholdende 1 ml frisk luminescerende Photobacterium sp ved en OD600 på 1-1,5. Den centrale kuvette havde to identiske optiske vinduer giver de udsendte fotoner til frit at dispergere. Erhvervelse billeder på afstande (D) fra 1,0 cm til 3 cm, faldt den observerede produktion af rødt lys som en funktion af afstanden vise dokumentation for, at brændstof kan forekomme ved afstande ikke opnås ved resonans energi overførsel. Intensiteten syntes at have D -2 afhængighed, svarende til den reciprokke kvadrat (til venstre). Den samme protokol blev fulgt for E. coli (højre). De resulterende tendens linjer holde formular til begrebet THAt bakterierne fungerer som punktkilder af lys. I alt tre uafhængige afstandsmålinger blev erhvervet med hver hjælp af en unik subkultur. Fejlsøjler er til stede ved hvert punkt. I nogle tilfælde var fejllinjerne mindre end de anvendte symboler, der angiver den normaliserede intensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3.. En sammenligning mellem målrettet (specifik) og ikke-målrettede (bulk opløsning) BRÆNDSTOF. K. pneumoniae blev funktionaliserede med biotinylerede antistoffer og derefter udsat for enten streptavidin-mærkede (Målrettet) eller ikke-mærket (ikke-målrettet) QD705. De resulterende opløsninger var lige udbytteded og et sæt vasket tre gange med PBS før de resuspenderedes i dens oprindelige volumen i PBS. Opløsningerne blev derefter dispenseret i individuelle brønde i en sort 96-brønds plade og bioluminescens observeret under 490-510 nm (500 nm), og 710 til 730 nm (720 nm) emissionsfiltre (angivet som blå søjler). P • sek -1 • cm -2 fundet fra 720 nm filter for hver brønd blev normaliseret ved de respektive p • sek -1 • cm -2 bioluminescens intensitet fra 500 nm af samme godt. Den relative fluorescens intensitet som følge af en epifluorescerende excitation blev bestemt ved anvendelse af 450-480 nm excitation og 710-730 nm emission filtre (indikeret som røde søjler). Lidt til ingen forskel i selvlysende eller fluorescerende signal blev observeret under de uvaskede betingelser (ikke-målrettet Unwashed og målrettede Unwashed). Dette tyder på, at den bundne og frit svævende QD705 var lige begejstrede for de selvlysende fotoner. Efter vask, ntidligt en to-fold forskel i relativ rødt signal blev observeret for de QD705-mærkede bakterier (Målrettede Vasket) sammenlignet med kontrolgruppen (ikke-målrettet Vasket). Fraværet af QD705 i ikke-målrettet Vasket blev bekræftet af manglen på fluorescerende signal og verificeret QD705 mærkning i Målrettet Vasket tilstand. Dataene er fra fire uafhængige kulturer af K. pneumoniae. For klarhedens skyld legenden angiver kilden til QD705 excitation. Klik her for at se en større version af dette tal.

bredde: 108px; "> Alexa 700 højde: 22px; bredde: 108px; "> QD800
Fluorophor Koncentration pi PS (ul) λ max ex / em (nm) Emission Filter (n m)
Alexa 555 37.2 uM 4.77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37.2 uM 4.77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37.2 uM 4.77 995,23 632/637 650-670
37.2 uM 4.77 995,23 702/723 710-730
Fluorescerende 2,62% tørstof 9.72 990,28
μSph Pink 5% tørstof 4.77 995,23 580/605 610-630
μSph Gul 5% tørstof 4.77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 uM 5. 995 465/705 710-730
2 uM 5. 995 465/705 790-810

Tabel 1.. Egenskaber af fluoroforer anvendt i hele brændstof demonstrationer.

<td> 6,05 x 10 4
Kontrol filter fluorophor Kontrol p-værdi
p · sek-1 · cm-2 SD p · sek-1 · cm-2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0,233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4,49 x 10 6 9,71 x 10 5 0.094
A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0.046
A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 0.026
MSPH Gul ikke-fluorescerende μspheres 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0.057
MSPH Pink ikke-fluorescerende μspheres 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8.00 x 10 5 0.026
QD705 ikke-fluorescerende μspheres 720 1,76 x 10 7 7,33 x 10 6 2,08 x 10 5 7,16 x 10 4 0.007
QD800 ikke-fluorescerende μspheres 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1,52 x 10 4 0.023

Tabel 2.. Identifikation af fluorophores og fluorescerende nanopartikler kompatible med brændstof.

Discussion

Den grundlæggende demonstration af brændstof kan opnås blot ved at blande selvlysende bakterier med fluorescerende nanopartikler eller QDs. De to enheder skal være fysisk adskilt og forbliver over enhver effektiv RET afstand. Mere vanskeligt er FUEL signal optimering både in vitro og in vivo. Under in vitro-betingelser, både med og uden optisk absorber til stede, sædvanligvis tilsætning af overskydende fluorofor vil være tilstrækkelig til at maksimere FUEL respons. Men ved høje koncentrationer fænomener såsom statisk eller collisional quenching kan føre til et tab af fluorescerende signal. Udførelse af en fortyndingsrække ved uafhængigt at variere koncentrationen af ​​det luminescerende kilden og fluorophoren vil bidrage til at optimere de ønskede koncentrationer. Etablering og optimering af brændstof under in vivo koncentrationer er langt vanskeligere og skal behandles på et sag til sag-basis. Det kan være vanskeligt at skabe en condition hvor fluorescerende enhed kan tilgås optisk af selvlysende kilden. Som sådan kan der begynder med direkte co-injektioner af de to grupper tilvejebringe oplysninger om succes FUEL under optimale betingelser.

Standardprotokoller findes for mærkning af bakterier og eukaryote celler med fluorescerende enheder såsom Alexa serien og QDs. Dette kræver ofte overflade funktionalisering eller aktivering med antistoffer, som kan føre til uønskede virkninger som reduceret cellelevedygtighed eller ændret metabolisk aktivitet. For at overvinde dette, er det vigtigt at bestemme den optimale mængde af antistof eller aktivering agent behov der minimerer cellulære perturbationer samtidig maksimere den fluorescerende mærkning. Anvendelsen af ​​QDs er fordelagtig på grund af deres karakteristiske bred excitationsspektre, smalle og afstemmelige emissionsspektre, og muligheden for et stort Stokes skift. Dog kan QDs være cytotoksiske og kan ikke være ønskelig i nogle tilfælde.

13 og gælder for en bred vifte af selvlysende og fluorescerende kilder. Indtil nu var fotonerne følger FUEL betragtes produktet af ikke-specifikke interaktioner eller en uheldig baggrund signal som følge af dårligt designet Bret eksperimenter. Det er kun med den type af eksperimenter viste her, at vi var i stand til at identificere nytten af ​​denne uønskede signal. I de viste eksempler, luminescerende bakterier fungere som en diffus excitationskilde stand til at fremkalde en standard fluorescerende respons fra en bred vifte af fluorescerende enheder. På grund af den væsentlig bearbejdning afstand, er det sikkert at konkludere, at mens FUEL kan konstrueres uden forekomsten af ​​BRET generelt BRET ikke kan observeres uden et bidrag fra FUEL. Vigtigere er det, på grund af manglen på en målrettet krav, kan anvendes FUEL at dække den rumlige kløften mellem BRET og conventional hele dyr imaging teknikker.

Disclosures

Forfatterne erklærer konkurrerende finansielle interesser. JD, SB, KLR og SLS har bidraget til europæisk patent EP10290158.4 og World Intellectual Property Organization patentansøgning WO/2011/117847.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne udvide deres taknemmelighed for økonomisk støtte fra Pasteur Foundation of New York (JD, CS, CS), EU-FP7 Program "Automation" (SLS), Institut Carnot-programmet 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) og Project IMNOS (til RT, SLS), Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), European Masters in Molecular Imaging (til det), Region Ile de France-programmer MODEXA (SLS), sesam (SLS) og DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Investissement de l'Avenir infrastruktur Nationales en Biologie-Santé: Frankrig LifebioImaging (FLI) Frankrig Life Imaging (RT, SLS), Frankrig Bioimaging (JD, SLS) og Institut Pasteur, Paris. Desuden vil forfatterne gerne takke José Bengoechea og Herbert Schweizer reagenser. Desuden vil Forfatterne vil gerne takke Cindy Fevre, der genererede antistofferne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats