En Step Beyond BRET: Fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL)

1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur
Published 5/23/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Utöka grunden och tillämpligheten av fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL) genom att kartlägga de relevanta principer och demonstrera dess kompatibilitet med en mängd fluoroforer och antikroppsinriktade villkor.

Cite this Article

Copy Citation

Dragavon, J., Sinow, C., Holland, A. D., Rekiki, A., Theodorou, I., Samson, C., et al. A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL). J. Vis. Exp. (87), e51549, doi:10.3791/51549 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens av Unbound Excitation från Luminescence (FUEL) är ett strålnings excitation-emission process som producerar ökad signal och kontrastförbättring in vitro och in vivo. BRÄNSLE delar många av de samma grundprinciper som mareld Resonance Energy Transfer (BRET), men skiljer sig mycket i de acceptabla arbetsavstånd mellan självlysande källan och den fluorescerande enhet. Medan BRET i praktiken begränsas till maximalt 2 gånger Förster radie, vanligen mindre än 14 nm, kan FUEL uppträda på avstånd upp till pm eller ens cm i avsaknad av en optisk absorbator. Här expanderar vi på den grund och tillämpning av BRÄNSLE genom att se över de aktuella principerna bakom fenomenet och visa sin kompatibilitet med ett brett utbud av fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar. Vidare är användbarheten av antikropp-riktad BRÄNSLE utforskas. Exemplen som visas här ger bevis för att FUEL kan utnyttjas för applications där BRET inte är möjligt, fyller den rumsliga tomrum som finns mellan BRET och traditionell hela djuret avbildning.

Introduction

Den genetisk modifiering av organismer, såsom virus 1, 2, bakterier 3, eller små däggdjur 4 till antingen inducera eller konstitutivt uttryck mareld, har varit mycket framgångsrik och allmänt visade 5-7. Bioluminescence, en in vivo kemiluminiscerande reaktion innefattande naturligt förekommande reagens, har fördelen av att producera ljus utan behov av en extern ljuskälla. Som sådan, inte självlysande avbildning inte lider av de vanliga nackdelarna med auto-och icke-specifik signal finns från fluorescens avbildning 8. Följaktligen har mareld en signifikant signal-till-brus-förhållande eftersom alla detekterade signalen härstammar uteslutande från den avsedda källan. Även om många modeller har utnyttjat lux operonet från Photorhabdus luminescens (emissionsmaximum centrerad mellan 480 och 490 nm) för in vitro-och in vivo-applikationer 9, dess användning i små mammals har varit problematisk på grund av själva karaktären av bildförhållanden; den genomträngande förekomsten av optiska absorptionsmedel, såsom hemoglobin, och spridningsmedel, såsom vävnad och ben, hög grad påverkar blått till gult våglängder 3. Uttrycket av en konstruerad eldfluga luciferas (emissionsmaximum vid 617nm) har nyligen utvecklats och införlivats, ger ett verktyg som kraftigt övervinner optisk absorption 10, men är fortfarande föremål för spridning effekter.

Som svar har det förekommit flera försök till röd-skift den utsända signalen till önskad optiska fönstret på 650-900 nm, en region med minimerad absorption och spridning, med hjälp av bioluminiscens resonansenergiöverföring (BRET) 11-13. Som ett verktyg för att förbättra signaldetektering, BRET, som använder en självlysande källa som givaren och en extra fluorofor som acceptor, har funnit begränsad framgång. Som ett nyskapande exempel på detta fenomen, "självlysande kvantprickar4; (SIQDs) 14 består av modifierad Renilla reniformis luciferaser bundna till externa polymer-lysin lager av kommersiellt tillgänglig kvantprickar (QDs). Vid substrat Dessutom inducerar den resulterande självlysande reaktions fluorescens utsläpp från QDs, genererar en betydande produktion av röda fotoner. Emellertid har dessa SIQDs begränsad tillämpbarhet på in vivo visualisering av fysiologiskt relevanta händelser. Denna begränsade användbarhet beror sannolikt på att det är svårt att koppla den dubbla sond till organ, cell eller genen av intresse, eftersom de SIQDs inte kan genetiskt kodad och därför skulle kräva en sekundär modifiering av polymerskal. För att förbättra deras användbarhet, alternativa SIQDs, där luciferasema är bundna direkt till den självlysande kärnan, har nyligen varit anställd 15. Bygga bort av SIQD konceptet, var en mer tillämplig BRET systemet uppnås genom att fästa Cypridina luciferas till en idocyanine färgämne 16, som var i stånd att specifikt rikta tumörer i möss samtidigt som de producerar en betydande rött skifte från 460 nm till 675 nm. Att genomgå icke-strålande energiöverföring, BRET följer samma primära begränsningar som dess fluorescerande motsvarighet: det måste finnas en stark spektral överlappning mellan utsläpp givaren och acceptor excitationsspektra och arbetsavståndet mellan de två delarna måste vara i storleksordningen av Förster radie (5-14 nm, beroende på givarens-acceptorparet, med en effektiv maximalt avstånd på två gånger Förster radie 17). Detta avstånd beroende begränsar kraftigt de typer av händelser som kan observeras med hjälp av BRET som ett sätt att förbättra upptäckt.

Nyligen kom en ny metod identifierades och visade i både in vitro och in vivo-förhållanden. Att bygga upp grunden för BRET, Fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL) 18, 19 Escherichia coli som uttrycker lux-operon och QDs 18, 19. Medan experimentellt liknar de SIQDs föreligger en väsentlig skillnad: i bränslen, är det inte nödvändigt för det luminiscerande källan att vara fysiskt bunden till fluoroforen, vilket gör att for genetisk kodning av självlysande sonden. På grund av den framgångsrika detektionen av bränsle mellan luminescerande bakterier och QDs, är det möjligt att denna teknik skulle kunna tillämpas på både ytlig (hud) och djup vävnad (lungor, lever) infektioner, såsom Staphylococcus aureus och Klebsiellia pneumoniae.

Sedan rapporten av dess experimentella betydelse har FUEL utvecklats till att omfatta en robust matematisk modell 20 som kan användas för att förutsäga acceptabel självlysande och fluorescerande par, och dess tillämpningar har utökats till att omfatta användning i identifiering av fotofysikaliska egenskaper såsom kvantutbyte. Vi beskriver nedan några av de grundläggande teknikerna för BRÄNSLE. Först visar vi belägg för detta fenomen över både korta (um) och lång (cm) arbetsavstånd, som i grunden skiljer BRÄNSLE från BRET. För det andra, vi utöka de möjliga BRÄNSLE paren genom att undersöka en mängd olika fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar. Third, är BRÄNSLE applikationer undersöks genom att jämföra målinriktade och icke-målinriktade BRÄNSLE par.

Protocol

1. Reagens

  1. Köp eller utveckla självlysande bakterier och lämpliga odlingsmedia såsom modifierad Escherichia coli som uttrycker lux ABCDE 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.
  2. Förbered fysiologisk saltlösning (0,9% NaCl) och kulturmedialösningar enligt standardrecept. E. coli och K. pneumoniae odlades i Luria-Bertani (LB) vid 37 ° C, och V. fischeri och Photobacterium sp i LB kompletterat med 0,5 M NaCl vid 22 ° C.
  3. Inköp eller förvärva fluorescerande prober, såsom Q-tracker 705 (40 nm i diameter, som kallas QD705), Q-tracker 800 (40 nm i diameter, som kallas QD800), fluorescerande (40 nm diameter) och icke-fluorescerande polystyren mikrosfärer ( 48 nm i diameter), och konventionella fluorescerande färger.
  4. Förbered nödvändiga reagenser för bakteriell märkning.
  5. Säkerställa tillgång tillett helt djur bioluminescens avbildare, såsom en IVIS Spectrum, som är i stånd att detektera signalen under ett brett spektrum av emissionsvåglängder och exponeringstider. En plattläsare kan mareld mätningar räcker för de flesta av de experiment som beskrivs här.

2. Grundläggande Sammanfattning av BRÄNSLE

  1. Med utgångspunkt från individuella kolonier på vanliga odlingsplattor, starta natten kulturer av självlysande bakterier. Här, V. fischeri användes.
  2. Dagen för experiment, inleda nya subkulturer och låta dem utvecklas till en OD 600 av 1-1,5 uppnås. För att producera jämförbara resultat är det bäst att använda bakterier i samma tillväxtländer där de producerar intensiva signaler. Detta kan säkerställas genom att hålla OD 600 konstant.
  3. Kombinera portioner av 100 l från vardera med antingen 5 pl av QD705 eller fysiologisk saltlösning (PS), och lägg sedan till 895 l av PS i standard spektroskopiska kyvetter. Placera de fyllda kyvetter i IVIS Spectrum och göra de mätningar under lämpliga filtersatser. Här var 710-730 nm emissionsfilter används.

3. Bränsle över olika avstånd

  1. Fyll två reducerad volym (1 ml) plast fotometriska kyvetter med antingen 50 | il QD705 eller 97,2 | il av icke-fluorescerande 48 nm polystyren-mikrosfärer i en total volym av 1 ml PS. Detta säkerställer liknande fast yta per totala volymen mellan de två enheterna.
  2. Bered en ljuskälla kyvett genom att innesluta en tredje kyvett med standard svart tejp eller annat ogenomskinligt material i stånd att blockera ljus. Försiktigt förbereda två identiska optiska fönster på motsatta sidor av kyvetten.
  3. Placera de tidigare fyllda kyvetter direkt på vardera sidan om ljuskällan kyvetten. Lägg en 1 ml alikvot av V. fischeri eller annan kultur (dvs. självlysande E. coli eller Photobacterium sp) från en ny subkultur i ljuskällan kyvetten och täck den med ett ogenomskinligt material, såsom svart papper för att minska eventuella ljusförorening.
  4. Visualisera de tre kyvetter under lämpliga emissionsfilter såsom Total Ljus och 710-730 nm emissionsfilter, med exponeringstider på 10, 30 och 30 sekunder, respektive.
  5. Flytta både externa kyvetter vid motsvarande extra avstånd från den centrala kyvetten, och sedan visualisera igen. Upprepa tills ett slutligt ansikte mot ansikte (central till minskad volym kyvett) avstånd på 3 cm uppnås. Vid varje steg, skaffa en fluorescens bild (450-480 nm excitation, 710-730 nm emission) för att validera QD705 platsen.

4. Undersöka Potentiella BRÄNSLE Pairs

  1. Fyll två reducerade volym kyvetter med 1 ml lösningar som innehåller antingen en fluorofor eller en fluorescerande nanopartikel av intresse för en, och PS eller PS med icke-fluorescerande nanopartiklar som den negativa kontrollen i den andra. I the arbete visade här, en mängd olika potentiella kommersiellt tillgängligt bränsle fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar undersöktes som beskrivs i tabell 1.
  2. Lägg en 1 ml alikvot av färsk V. fischeri eller andra självlysande bakterier till en mörk ut tredje kyvett innehållande två fysiskt lika optiska fönster ligger på varsin sida. Täck kyvetten med en ogenomskinlig substans såsom en bit svart papper.
  3. Vid en kort men lika avstånd plats de två reducerade volym kyvetter på vardera sidan av den mörklagda kyvett och visualisera under lämpliga filter. Här, var ett avstånd av 0,7 cm användes. Upprepa med andra fluoroforer.

5. Riktad FUEL

  1. Förbered biotinylerade antikroppar som är specifika för de självlysande bakterierna. Till exempel, här primära antikroppar specifika för K. pneumoniae (α-Kp) biotinylerades med användning av en lösning innehållande EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin. Avlägsna överskottet av reagens från antikroppar med användning av avsaltningskolonner enligt centrifugering (1500 x g) under 2 min.
  2. Använd en vanlig Bradford-analys för att bestämma proteinkoncentrationen och bestämma graden av antikropps biotinyleringen av HABA-analys.
  3. Skaffa α-Kp-biot biotinylerad antikropp (Ab) partier genom att blanda 100 l (10 mM, upplöst i 1x PBS) med 40 l α-Kp antikropp, vilket resulterar i en slutlig substitutionsgrad av 16 biotinrester per Ab och en slutlig proteinkoncentration av 10 mg ml -1.
  4. Med hjälp av flera natten replikera kulturer, rikta de tvättade bakterier med de tidigare nämnda antikropparna efter lämpligt protokoll.
    1. Specifikt tvätta K. pneumoniae i 1 x PBS och återsuspendera i 1 x PBS till en OD av 4 (ca 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1).
    2. För varje replikera, inkubera 100 l PBS, α -Kp-antikroppar (10 | il α-Kp-biotB eller 10 | il PBS under kontrollen) och 100 | il celler under 90 min vid 30 ° C. Tvätta cellerna tre gånger i 1 x PBS och återsuspendera i 196 | il PBS.
  5. Märk cellerna med QD705 streptavidinkonjugat och dela upp dem i två ekvivalenta volymer.
  6. Tvätta en lösning tre gånger, och sedan suspendera den i lämplig storlek.
  7. Fördela 100 ^ il av de tvättade och otvättade lösningar i individuella brunnar i en svart 96-brunnars platta. Mät resulte luminiscens under Total Light, 490-510 nm och 710-730 nm filter. Fluoroforen koncentrationen kan bestämmas med hjälp av 450-480 nm excitation och 710-730 nm emission.

Representative Results

Resonansenergiöverföring (RET) är en icke-radiativa växelverkan mellan en luminiscerande donator och en fluorescerande acceptor, varigenom energi från lämnat donator är i stånd att inducera en fluorescens Svar från acceptorn genom en stark dipol-dipol-interaktion 13. RET, som har beskrivits med användning av fluorescerande 23, kemiluminescerande 24 och bioluminiscerande 13 givare kräver huvudsakligen: 1 Stark spektral överlappning mellan emissions donatorn och accepter excitationsspektra,. 2 Lämplig rotationsinriktning mellan de två enheterna.; och 3. En arbetsavståndet inte är större än 0,5-till 2-gånger den Förster radie, R 0, mellan givaren och acceptorn 17. Kontrasterande med RET inträffar BRÄNSLE när ett luminiscent källa, såsom ett självlysande bakterier avger en foton som absorberas och åter utsänds av en andra enhet, såsom en fluorofor eller ett fluorescerande nanoparticle, röd-skiftning av SPECT utsläppsrom av den ursprungliga lysande källan. Sålunda följer BRÄNSLE en standard excitations-emissionsprocessen besläktad med standard epifluorescent kapacitet, utan att användningen av en fokuserad excitation. Tecken på detta kan lätt observeras av enkel blandning av självlysande bakterier och högt fluorescerande kvantprickar. I närvaro av Vibrio sp, är en betydande ökning av röda signalen observerades när QD705 var även i lösning jämfört med en icke-fluorescerande polystyren mikrosfär kontroll (Figur 1A). De komponenter som är nödvändiga för att skapa mareld, huvudsakligen aldehyd substrat, luciferas, och ATP, är alla producerade och som finns i cytoplasman. Dessutom sker den enzymatiska luminofor produktion inom bakteriella cytoplasman (Figur 1B). Som har rapporterats på annat håll, är avståndet mellan den inre och yttre membran av bakterier vanligtvis större än 30 nm 25-27, en sträcka som inte tillåter betydande RETinträffa. Vad bra, gör de fluorescerande nanopartiklar inte passera in i den bakteriella cytoplasman eftersom det inte finns någon endocytos eller annat upptag. Tillsammans utgör dessa begränsningar visar att FUEL är den dominerande excitation-utsläpp fenomen som uppstår när självlysande bakterier blandas med fluorescerande nanopartiklar.

Som tidigare visats, finns BRÄNSLE utöver området för RET. För att undersöka den BRÄNSLE beroendet av avståndet kan standard reducerad volym spektrofotometriska kuvetter användas, med en innehållande en fluorofor lösning, en andra innehållande en lämplig kontroll som kan kontrollera för strö, och den tredje innehållande en alikvot av färskt luminiscerande lösning. Det är viktigt att den centrala kyvett vara omsluten med svart tejp eller annat ogenomskinligt material, med undantag av åtminstone två identiska optiska fönster belägna på motsatta sidor, för att minska varje potentiell kontamination ljuset från det luminiscerande källan. Vidare, de två återstående kyvetter behöverplaceras på lika avstånd på vardera sidan av den centrala kyvetten. Slutligen, en frisk självlysande lösning, med hjälp av bakterier eller kemiluminiscens, bör användas med varje experiment för att säkerställa maximal produktion ljus. Vid lämplig placering, förvärva luminiscens signalen under de önskade filter. Den totala Ljus och 710-730 nm filter användes i detta fall, även om endast data från den senare visas. Efter varje förvärv öka inkrementellt ansiktet mot ansikte avstånd från 1,0 cm till 3 cm (Figur 2). Slutligen normalisera alla data till den ljusaste punkten. I de exempel som används här, inträffade detta vid det kortaste avståndet (D = 1 cm) mellan det luminiscenta källan och kyvetten innehållande QD705. Med hjälp av denna metod, kan observeras livskraftig FUEL signal upp till den slutliga förvärvs tyder på att, i avsaknad av optiska absorbatorn kan FUEL ske på avstånd bortom all eventuell överföring resonans energi och kan bara förklaras som en rent strålningseffekt. Montering av data avslöjar en minskning i signal som en funktion av avståndet D till följd av ett D -1 till D -2 beroende. Beroende på den geometriska konfigurationen, fd motsvarar kondensatorn avstånd beroende och den senare till den omvända kvadratlagen för punktkällor. Detta resultat är alltså i linje med vår övergripande förvärvs setup, med tanke på storleken av kyvetten bländaren och avståndet mellan självlysande källan och fluoroforen.

BRÄNSLE gäller inte bara för kvantprickar, men även kan observeras med användning av ett brett urval av fluoroforer som spänner från det Alexa serie till fluorescerande mikrosfärer (tabell 2). För att vara jämförbar med kontrollen, bör lika stora koncentrationer av de olika fluoroforer användas och den totala ytan av nanopartiklar hålls konstant (tabell 1). Genom att jämföra fluoroforer och nanopartiklar för att deras lämpliga kontroller (PS eller PS med icke-fluorescerandepolystyren mikrosfärer), är en betydande ökning av signal observeras vid maximalt utsläpp av varje fluorescerande enhet. Den största relativa ökningen av signal befanns förekomma när fluorescerande emissionsmaximum var längst bort från maximum av självlysande utsläpp. Detta är troligen på grund av den ökade specificiteten hos fluorescenssignalen jämfört med den breda emissionsspektrum av det luminiscenta källan. Tvärtom var den minst tillförlitliga FUEL signal hittas när de två emissionsmaximum inte var väl åtskilda. Intressant nog var en urskiljbar FUEL signal hittas med de gula mikrosfärer, även om den spektrala skillnaden är minimal, tack mest sannolikt att den betydande mängd fluoroforen närvarande per kula (350 fluorescein motsvarigheter). De resultat som visas här indikerar att under lämpliga betingelser BRÄNSLE kan uppnås med en mängd fluoroforer, som gör det möjligt att skräddarsy sonder utvalda för mer relevanta applikationer enligt både in vitro och in vivo betingelser. Betydelsen av den observerade BRÄNSLE signalen bestämdes med användning av en standard två-tailed Students t-test. Som sådan var bara Alexa555 befunnits vara oförenlig med den självlysande källan används.

För att undersöka effekterna av inriktning på FUEL var biotinylerade antikroppar som används för att rikta självlysande bakterier och streptavidin-kopplade QDs. Det är viktigt att de bakterier eller luminiscens källa tillhandahålla ett skikt tillräckligt tjockt för att minimera möjligheten för RET mellan luminoforen och motsvarande fluorofor. Efter inkubation och tvättning för att avlägsna obundna antikroppar är de biotinmärkta bakterierna exponerades sedan för antingen streptavidin-konjugerad QD705 eller icke-funktionaliserad QD705 som kontroll, lösningarna delas upp och en uppsättning utsättas för ytterligare tvättningar för att avlägsna eventuell icke-vidhäftade QD705. Här, för samtliga fyra villkor, den resulterande luminiscens observeras under Total Light, 490-510 nm, end 710-730 nm filter, men bara de senare två filter används för dataanalysen. Närvaron av QD705 jämfördes med hjälp av 450-480 nm excitation och 710-730 nm emissionsfilter. Vid undersökning har vi funnit liten eller ingen skillnad i röd-skiftade signal när lösningarna var kvar i ett otvättat tillstånd (Figur 3). Den resulterande fluorescenssignal under detta förhållande har också visat sig vara ganska lika, vilket tyder på att lika många QD705 var närvarande under både den riktade och icke öron tillstånd. Emellertid tvättning av prover för att avlägsna eventuell obunden QD705 erbjuder en nästan två-faldig ökning i relativ röd signal för målbakterierna jämfört med deras icke-riktad styrning. Undersökning av fluorescens kan användas för att verifiera närvaron eller frånvaron av den QD705. Jämförelsevis, den riktade tvättades tillstånd resulterade i en fluorescensintensitet som var nästan tre gånger mindre än det otvättade tillstånd, men den resulterande röd-skift minskade med endast30%, vilket tyder på att det under rent bundna villkor inriktningen av bakterierna kommer att resultera i en ökning av röd-skiftade utsläpp. Detta implicerar starkt nyttan av riktade BRÄNSLE för framtida applikationer.

Figur 1
Figur 1. BRÄNSLE interaktion mellan luminescerande bakterier och kommersiellt tillgängliga kvantprickar leder till en ökning i röd fotonproduktion. Två spektrofotometriska kuvetter fylldes med lösningar innehållande 100 | il alikvoter av färskt V. fischeri kultur med en OD 600 av 1-1,5, 895 l av PS, och antingen 5 pl av QD705 eller fysiologisk saltlösning (PS), innan de släpps in i en IVIS Spectrum och emissionsspektrum förvärvats. En betydande ökning av röd signal uppnås på grund av närvaron avden QD705, som kan noteras av ökningen av detekterade fotoner • sek -1 • cm -2 (p • sek -1 • cm -2) jämfört med kontrollen under 710-730 nm emissionsfilter (A). Här, den dubbla membran av bakterierna utesluter interaktion av de luminiscerande enheter (blå cirklar) och QD705 (svarta cirklar). Den förstnämnda finns endast i den bakteriella cytoplasman medan den senare är fritt distribueras i bulklösningen (B). N = 3 för varje bakterielösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Bevis på BRÄNSLE inträffar på sträckor kompletely exklusive resonansenergiöverföring. Spektrofotometriska kuvetterna fylldes med lösningar innehållande antingen 50 | il QD705 och 950 pl av fysiologisk saltlösning (PS) eller 97,2 | il av icke-fluorescerande 48 nm polystyren mikrosfärer och 902,8 pl av PS, och placerade på lika avstånd på motsatta sidor av en central svart kyvett innehållande 1 ml rent självlysande Photobacterium sp vid en OD 600 av 1-1,5. Den centrala kyvett hade två identiska optiska fönster ger de utsända fotonerna att fritt sprida. Hämta bilder på ett avstånd (D) som sträcker sig från 1,0 cm till 3 cm, den observerade bildningen av röda ljus minskat som en funktion av avståndet som visar bevis på att bränsle kan förekomma på ett avstånd som inte kan uppnås genom resonansenergiöverföring. Intensiteten tycktes ha D -2 beroende, liknande den omvända kvadratlagen (vänster). Samma protokoll följdes för E. coli (höger). De resulterande trend linjer håller formen till begreppet that bakterierna fungerar som punktkällor för ljus. Totalt tre oberoende mätningar avståndsförvärvades med var att använda en unik subkultur. Felstaplar är närvarande vid varje punkt. I vissa fall var de felstaplarna mindre än de symboler som anger den normaliserade intensiteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. En jämförelse mellan riktade (specifik) och icke öron (bulk lösning) BRÄNSLE. K. pneumoniae var funktionella biotinylerade antikroppar och sedan utsätts för antingen streptavidin-märkta (Targeted) eller icke-märkta (Non-Targeted) QD705. De resulterande lösningarna var lika divided och en uppsättning tvättades tre gånger med PBS innan de återsuspenderades i sin ursprungliga volym i PBS. Lösningarna fick därefter fördelas i individuella brunnar i en svart 96-brunnars platta och bioluminescens observeras under 490-510 nm (500 nm) och från 710 till 730 nm (720 nm) emissionsfilter (indikerade som blå staplar). Den p • sek -1 • cm -2 hittades från 720 nm filter för varje väl normaliserades av respektive p • sek -1 • cm -2 mareld intensitet från 500 nm av samma väl. Den relativa fluorescensintensiteten till följd av en epifluorescent excitation bestämdes med hjälp av 450-480 nm excitation och 710-730 nm emissionsfilter (visas som röda staplar). Liten eller ingen skillnad i självlysande eller fluorescerande signal observerades under de otvättade förhållanden (icke öron Otvättad och riktade Otvättad). Detta tyder på att den bundna och fritt flytande QD705 var lika upphetsad av de självlysande fotoner. Efter tvättning, ntidigt en tvåfaldig skillnad i relativ röd signal observerades för QD705-märkta bakterier (Riktade Tvättade) jämfört med kontrollen (icke öron Tvättade). Frånvaron av QD705 i icke-Riktade Tvättade bekräftades av bristen på fluorescerande signal och verifierat QD705 märkning i Riktade Tvättade staten. Datan är från fyra oberoende kulturer av K. pneumoniae. För tydlighetens skull, legenden anger källan till QD705 excitation. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

width: 108px; "> Alexa 700 höjd: 22px; width: 108px; "> QD800
Fluorofor Koncentration il PS (pl) λ max ex / em (nm) Emissionsfilter (n m)
Alexa 555 37,2 ^ iM 4,77 995,23 555/565 570-590
Alexa 568 37,2 ^ iM 4,77 995,23 578/603 590-610
Alexa 633 37,2 ^ iM 4,77 995,23 632/637 650-670
37,2 ^ iM 4,77 995,23 702/723 710-730
Icke-fluorescerande 2,62% fasta beståndsdelar 9,72 990,28
μSph Pink 5% fasta ämnen 4,77 995,23 580/605 610-630
μSph Gul 5% fasta ämnen 4,77 995,23 505/515 510-530
QD705 2 uM 5 995 465/705 710-730
2 uM 5 995 465/705 790-810

Tabell 1. Egenskaper hos fluoroforer används i bränslet demonstrationerna.

<td> 6,05 x 10 4
Kontroll filter fluorofor Kontroll p-värde
p-s -1 · cm -2 SD p-s -1 · cm -2 SD
A555 PS 580 1,08 x 10 7 3,31 x 10 6 9,09 x 10 6 1,75 x 10 6 0,233
A568 PS 600 8,47 x 10 6 4,23 x 10 6 4,49 x 10 6 9,71 x 10 5 0,094
A633 PS 660 2,40 x 10 6 1,25 x 10 6 7,85 x 10 5 2,39 x 10 5 0,046
A700 PS 720 5,53 x 10 5 2,46 x 10 5 1,54 x 10 5 0,026
MSPH Gul icke-fluorescerande μspheres 520 1,19 x 10 8 4,85 x 10 7 5,79 x 10 7 1,99 x 10 7 0,057
MSPH Pink icke-fluorescerande μspheres 620 2,37 x 10 7 1,36 x 10 7 2,16 x 10 6 8.00 x 10 5 0,026
QD705 icke-fluorescerande μspheres 720 1,76 x 10 7 7,33 x 10 6 2,08 x 10 5 7,16 x 10 4 0,007
QD800 icke-fluorescerande μspheres 800 7,79 x 10 6 4,72 x 10 6 3,60 x 10 4 1,52 x 10 4 0,023

Tabell 2. Identifiering av fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar som är kompatibla med BRÄNSLE.

Discussion

Den grundläggande demonstration av FUEL kan uppnås genom att helt enkelt blanda självlysande bakterier med fluorescerande nanopartiklar eller kvantprickar. De två enheterna kommer att vara fysiskt separerade och förblir bortom varje effektiv RET avstånd. Svårare är signalen optimering BRÄNSLE både in vitro och in vivo. Under in vitro-förhållanden, både med och utan en optisk absorbator närvarande, vanligtvis tillsats av ett överskott av fluoroforen kommer att vara tillräcklig för att maximera BRÄNSLE svar. Men vid höga koncentrationer företeelser som statisk eller kollisions släckning kan leda till en förlust av fluorescerande signal. Utföra en utspädningsserie genom att oberoende variera koncentrationen av det luminiscenta källan och fluoroforen kommer att hjälpa till att optimera de önskade koncentrationerna. Upprättande och optimering av bränsle under in vivo-koncentrationer är mycket svårare och måste behandlas från fall till fall. Det kan vara svårt att skapa en condition där fluorescerande enhet kan nås optiskt av självlysande källan. Som sådan kan börjar med direkt delprodukter injektioner av de två delarna tillhandahålla information avseende framgången med bränsle under optimala förhållanden.

Standardprotokoll finns för märkning av bakterier och eukaryota celler med fluorescerande enheter såsom serien och QDs Alexa. Ofta innebär ytfunktionalisering eller aktivering med antikroppar, vilket kan leda till oönskade effekter såsom minskad cellviabilitet eller förändrad metabol aktivitet. För att övervinna detta, är det viktigt att bestämma den optimala mängden av antikropp eller aktiveringsmedel behövs som minimerar cellulära störningar samtidigt maximera den fluorescerande märkningen. Användning av kvantprickar är fördelaktigt på grund av deras karakteristiskt bred excitationsspektra, smala och avstämbar emissionsspektra, och möjligheten till ett stort Stokes-skift. Emellertid kan QDs vara cytotoxiskt och får inte vara önskvärt i vissa fall.

13 och kan tillämpas på en mängd olika självlysande och fluorescerande källor. Hittills har de fotoner som framställs BRÄNSLE behandlade produkten av icke-specifika interaktioner eller en olycklig bakgrundssignal som härrör från dåligt utformade BRET experiment. Det är bara med den typ av experiment visat här att vi kunde identifiera nyttan av denna oönskade signalen. I de exempel som visas, de luminiscerande Bakterierna fungerar som en diffus exciteringskälla med förmåga att framkalla en standard fluorescerande svar från ett stort antal olika fluorescerande enheter. På grund av den stora arbetsavstånd, är det säkert att dra slutsatsen att medan FUEL kan byggas utan att det uppstår BRET i allmänhet BRET kan inte observeras utan ett bidrag från BRÄNSLE. Huvudsakligen på grund av avsaknaden av en måls krav, FUEL kan användas för att täcka den rumsliga gap som finns mellan BRET och conventional hel-djur avbildningstekniker.

Disclosures

Författarna förklarar konkurrerande ekonomiska intressen. JD, SB, KLR och SLS bidrog till europeiska patent EP10290158.4 och World Intellectual Property Organization patentansökan WO/2011/117847.

Acknowledgements

Författarna vill rikta sin tacksamhet för ekonomiskt stöd från Pasteur Foundation i New York (till JD, CS, CS), EU-FP7-programmet "Automation" (SLS), Institut Carnot-programmet 11 (till JD, AH , AR, RT, SLS) och projekt IMNOS (till RT, SLS), den Conny-Maeve välgörenhetsstiftelsen (SLS), European Masters i Molecular Imaging (IT), regionen Ile de France program MODEXA (SLS), Sesame (SLS) och DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Investissement de l'avenir infrastrukturer Nation en Biologie-Santé: Frankrike LifebioImaging (FLI) Frankrike Life Imaging (RT, SLS), Frankrike Bioimaging (JD, SLS) och Institut Pasteur, Paris. Vidare vill författarna tacka José Bengoechea och Herbert Schweizer för reagenser. Vidare skulle Författarna tacka Cindy Fevre som genererade antikropparna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon  kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145  52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)  standard growth media
Q-Tracker 705  Life Sciences Q21061MP
Q-Tracker 800 Life Sciences Q21071MP
Alexa 555 Life Sciences S21381
Alexa 568 Life Sciences S11226
Alexa 633 Life Sciences S21375
Alexa 700 Life Sciences S21383
Non-fluorescent microspheres Polysciences, Inc 15913
Pink microspheres Life Sciences F8887 40 nm diameter
Yellow microspheres Life Sciences F8888 40 nm diameter
Ivis Spectrum PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific Pierce 21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Scientific Pierce 21425
HABA assay kit  Thermo Scientific Pierce 28005
Bradford assay Bio-Rad 500-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262 (2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats