Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

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O'Brien, J. M., Beal, M. A., Gingerich, J. D., Soper, L., Douglas, G. R., Yauk, C. L., Marchetti, F. Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency. J. Vis. Exp. (90), e51576, doi:10.3791/51576 (2014).

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Abstract

Introduction

Mutations de l'ADN sporadiques dans la lignée germinale peuvent conduire à la réussite de la reproduction réduite et, si hérité, peuvent provoquer une maladie génétique ou une prédisposition accrue au cancer chez les enfants 1-3. Preuve substantielle démontre qu'une grande proportion de mutations de novo sont héritées de la lignée germinale paternelle 4, et que le nombre de mutations dans la descendance est positivement corrélée avec l'âge du père au moment de la conception 5. La proportion plus élevée de mutations de sexe masculin est considéré comme un résultat de la différence d'âge au cours de la gamétogenèse entre les sexes, le plus grand nombre de divisions cellulaires de la spermatogenèse par rapport au nombre de divisions cellulaires oogenic dans la lignée germinale femelle 2, et une diminution progressive de l'ADN réparer l'efficacité avec l'âge chez les hommes. Tous ces facteurs contribuent à une probabilité accrue d'erreurs de réplication dans la lignée germinale mâle 6. Cependant, l'impact de l'exposition paternelle à Envirofacteurs nnement sur ​​la fréquence des mutations de novo reste incertaine. Néanmoins, un grand nombre d'agents d'environnement sont connues pour induire des mutations germinales chez les rongeurs 7, et il existe des preuves croissantes que certains de ces agents peut aussi affecter la lignée germinale humaine 8. Malgré ces préoccupations, les produits chimiques sont régulièrement testés pour leur capacité à induire des mutations dans les cellules somatiques à des fins réglementaires et il est généralement admis que les tests somatiques sont suffisantes pour protéger la lignée germinale. Par conséquent, les produits chimiques ne sont que rarement évalués pour leur capacité à induire des mutations germinales.

Tests de mutagénicité des cellules germinales Une raison a été largement omis de la réglementation processus de prise de décision est un manque de méthodes pratiques. Méthodes basées sur des rongeurs traditionnels, tels que les mortels 9 et 10 tests spécifiques locus dominantes, estiment les taux de mutation des cellules germinales en marquant phénotypes mutants dans des embryons ou des descendants deparents exposés. Ces tests nécessitent l'utilisation d'un très grand nombre d'animaux, de temps et de ressources pour acquérir des résultats statistiquement significatifs.

Bien que plusieurs méthodes modernes de quantification de mutation des cellules germinales ont récemment vu le jour, beaucoup souffrent de lacunes en termes de praticité, l'efficacité et la pertinence biologique. Par exemple, répéter mutations de longueur à répétition en tandem simples (RETE) loci élargi peut être quantifiée dans les cellules germinales mâles utilisant une approche PCR de molécule unique 15. Toutefois, l'exécution de cette méthode peut être techniquement difficile et laborieux, et contrairement à des mutations ponctuelles, la signification biologique et la santé des changements dans la longueur de répétition du RETE loci très instable restent peu claires 16. Technologies de séquençage du génome entier modernes peuvent fournir une foule de données biologiquement significative lorsqu'elle est appliquée au problème de mutations héréditaires 4,17, mais le coût élevé, les taux d'erreur élevés, validation associé requispour confirmer les mutations, et bioinformatiques défis limiter encore l'application systématique de cette option à titre d'essai réglementaire 18.

Ici, nous décrivons une méthode pratique pour quantifier directement les mutations induites dans les cellules germinales de souris mâles transgéniques. Ce protocole est décrit par le modèle de MutaMouse transgénique, qui a de multiples copies d'un vecteur concaténés λgt10 de phage recombinant contenant un gène rapporteur lacZ intégré Escherichia coli dans les deux copies du chromosome 3 19 (figure 1).

Ce protocole est également s'appliquer à d'autres rongeurs transgéniques (TGR) modèles basés sur les mêmes principes (BigBlue souris et le rat, ou lacZ plasmide souris, etc.) Ou légèrement différents gènes rapporteurs (de la souris delta gpt et le rat, modèles TGR examinés en Lambert et . al 20). Cette méthode est basée sur l'essai de mutation décrit dans l'une TGR récemment publiéet révisée de l'OCDE directrice pour l'essai 21 et nous élaborons sur les considérations spéciales nécessaires pour accueillir évaluation des mutations dans la lignée germinale mâle en raison des caractéristiques uniques de la spermatogenèse. En bref, l'essai consiste à exposer des souris mâles transgéniques à une substance mutagène, suivie par un temps d'échantillonnage lorsque les lésions pré-mutation sont fixés à des mutations stables. A l'instant d'échantillonnage choisi, les souris sont euthanasiées et les cellules germinales sont recueillies à partir de l'une ou l'autre de la queue de l'épididyme ou les tubes séminifères. Comme nous le verrons, des effets mutagènes à différents stades de la spermatogenèse peut être déterminé en sélectionnant le délai entre l'exposition et la collecte de l'échantillon. Inserts transgéniques, comprenant des copies multiples du génome du phage λ par cellule, sont isolés de l'ADN génomique des cellules germinales et emballés dans des capsides vides de phage λ créant des particules de phage infectieux de λ qui sont ensuite utilisés pour infecter un E. hôte coli. Les bactéries infectées sont cultivées sur sélecmédias tives qui peuvent distinguer les cellules contenant un vecteur d'une copie mutée de lacZ de cellules hébergeant de type sauvage lacZ. L'effet mutagène de l'exposition sur la lignée germinale mâle est déterminée en comparant la fréquence des transgènes mutantes entre le contrôle et les souris traitées (Figure 2, examinées dans Lambert et al. 20). Un grand nombre de cellules germinales peut être analysée à partir d'une seule souris, ce qui donne une sensibilité supérieure ce dosage par rapport aux procédés traditionnels, tout en réduisant le nombre d'animaux requis. Et parce que aucun équipement ou de formation spécialisée est nécessaire, ce test fournit une option pratique et efficace pour les tests de mutation des cellules germinales dans la plupart des laboratoires moléculaires modernes de la biologie de toxicologie /.

Une condition essentielle pour l'application effective de l'essai de mutation des cellules germinales TGR est une compréhension du cycle de la spermatogenèse (Figure 3). Le temps pour les cellules germinales de souris au progrès de stcellules em dans les tubules séminifères à spermatogonies, spermatocytes, spermatides, et enfin à la maturité des spermatozoïdes dans l'épididyme (c.-à-la spermatogenèse.) est d'environ 49 jours. Mutation peut se produire à diverses étapes de ce cycle et est souvent spécifique composé. Deux caractéristiques clés qui revêtent un intérêt particulier à la mutagenèse dans les cellules germinales mâles sont l'arrêt de la synthèse de l'ADN lors de la méiose tôt, et la perte progressive de la capacité de réparation d'ADN 6 à la fin de l'après-méiose, deux processus qui sont nécessaires pour l'induction et la fixation de la plupart des mutations.

En raison de ces caractéristiques uniques de la spermatogenèse, il ya trois variables expérimentales critiques pour la conduite de la TGR mutation des cellules germinales essai: (1) le temps de l'administration du composé d'essai; (2) le temps d'échantillonnage; et (3) la sélection de la population de cellules germinales de recueillir pour analyse (figure 3 et tableau 1). Le temps d'administration est le experimeNTAL variables qui détermine la façon dont les cellules cibles longues sont exposées aux composés d'essai. La longueur de la durée d'administration peut également être utilisé pour cibler l'exposition à des types cellulaires spécifiques ou des phases de la spermatogenèse. Par exemple, une administration quotidienne unique pourrait être utilisée pour déterminer les effets d'une exposition de courte durée sur un type cellulaire particulier. De même, l'exposition peut être porté à toute une phase de la spermatogenèse, par exemple en ciblant les spermatocytes seule division méiose, ou division mitotique des spermatogonies en utilisant un temps d'administration de 2 semaine et un temps d'échantillonnage approprié. Temps de l'administration chronique et subchronique sont utilisées pour évaluer les effets de l'exposition à long terme, pour assurer la distribution de pharmacocinétique du composé suffisante de test, ou de permettre une accumulation suffisante de mutations de mutagènes faibles (par exemple le temps d'administration de 28 jours recommandé dans le test de l'OCDE directive).

Temps d'échantillonnage est la variable critique pour déterminer à quila phase de la spermatogenèse les cellules cibles étaient dans au moment de l'exposition. La période d'échantillonnage dicte combien de temps, et donc combien plus loin le long du cycle de la spermatogenèse, les cellules passer après l'exposition. Par exemple, pour étudier les effets dans les spermatogonies de cellules souches, un temps d'échantillonnage> 49 jours est nécessaire si la collecte de sperme en pleine maturité, ou> 42 jours si la collecte de cellules germinales immatures à partir des tubules séminifères, afin de s'assurer que toutes les cellules recueillies ont eu suffisamment de temps pour développer à partir de cellules exposées tiges. Il est important de noter que le temps d'échantillonnage d'au moins 70 jours serait préférable de démontrer un véritable effet sur les cellules souches à prévoir suffisamment de temps pour la distribution de pharmacocinétique de la substance toxique, pour l'élimination des cellules exposées à des phases ultérieures de la spermatogenèse, et pour tenir compte de une période de stérilité temporaire qui peut se produire ~ 6 semaines après l'exposition à des composés hautement mutagènes 22. De même, un temps d'échantillonnage de 21 jours permettrait de garantir que les spermatozoïdes colleDirection exécutive de l'épididyme de la queue de l'auraient tout juste de terminer la méiose, le dernier jour de l'exposition.

Les cellules germinales peuvent être collectées comme spermatozoïdes matures de la queue de l'épididyme, ou un mélange de différents types de tubes séminifères des cellules de la spermatogenèse. Sperme mûr dans le reste de la queue de ~ 3 jours, ce qui permet de déterminer avec précision par rapport au type de cellule ou de la phase de la spermatogenèse à partir de laquelle le sperme est issue de tout protocole expérimental donné. Ainsi, l'analyse de la queue de sperme permis hautement recherches sur les effets de mutations spécifiques au stade ciblé. D'autre part, les suspensions de cellules recueillies à partir des tubules séminifères contiennent un mélange de différents types de cellules germinales dans les différentes phases du développement, et offrent donc une moins bonne résolution de la phase de la spermatogenèse, dans lequel les mutations sont originaires. En outre, les suspensions de cellules récupérées à partir des tubules séminifères ont tendance à contenir une représentation des spermatides-dessus, suivie par les spermatocytes, et very peu spermatogonies et les cellules souches (ces proportions sont représentés par des barres blanches gradués sur la figure 3). En outre, les suspensions préparées à partir des tubules séminifères peuvent également contenir diverses cellules somatiques. Ainsi, en raison tant de types de cellules sont présentes, les effets de mutations peuvent être influencées par une variété de cellules non cibles. Toutefois, la collecte des échantillons de tubes séminifères offre une option économique pour le dépistage simultané de plusieurs types de cellules germinales, et une intégration facile de l'analyse des cellules germinales dans le protocole d'essai standard de l'OCDE pour une mutation somatique.

Pour réitérer, selon les besoins du chercheur, le temps d'administration, la durée de l'échantillonnage et de la population de cellules recueillies peuvent être ajustés pour interroger les effets de l'exposition à divers types de cellules et à des phases différentes de la spermatogenèse. En choisissant soigneusement ces variables, les expériences peuvent être conçus pour des études mécanistiques ciblées, ou pour le test réglementaire plus généraliséefins ing.

Pour atteindre la maîtrise de l'analyse, nous recommandons l'utilisation d'une administration orale aiguë de 100 mg / kg de N-éthyl-N-nitrosourée (FRA), suivie par une période d'échantillonnage de 70 jours de contrôle positif. Analyse de la queue des spermatozoïdes vise ainsi les cellules souches des spermatogonies (figure 3), qui présentent généralement une multiplication par 4-5 dans la fréquence des mutants (MF) par rapport aux témoins suite à cette dose très mutagène de FRA. Il est à noter que cette dose est connue pour induire la stérilité six semaines après l'exposition, ainsi il peut ne pas être une dose de commande approprié pour la réduction des temps d'échantillonnage. Cette dose sera également produire une augmentation détectable dans la plupart des tissus MF 20 somatiques. Les résultats représentatifs présentés ci-dessous ont été recueillies à la suite d'un régime d'exposition aiguë +70 utilisant trois doses de FRA jusqu'à et y compris 100 mg / kg.

Protocol

Tous les protocoles impliquant l'élevage, l'entretien et la manipulation ont été approuvés par le comité de protection des animaux de Santé Canada.

1. expositions animaux

  1. Hasard distribuer les souris mâles transgéniques (8-12 semaines) pour contrôler les groupes et les groupes de traitement (min = 5 par groupe) Traiter à souris avec le composé de test et de contrôle pertinent par une voie d'exposition appropriée pour le temps d'administration sélectionné. Choisissez le temps d'échantillonnage approprié selon le type de cellules de la spermatogenèse d'intérêt (figure 3).
  2. Après la période d'échantillonnage, euthanasier les souris par dislocation cervicale sous anesthésie isoflurane (ou autre méthode appropriée). Tirer délicatement les testicules d'un incision dans l'abdomen ou le scrotum et l'excision de l'épididyme de la queue de l'. (Figure 4, pour voir une vidéo détaillée de la collecte de l'épididyme voir Duselis et al 24.). Sinon, recueillir les testicules si l'analyse tube séminifèrecellules s. Congeler dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

2. isolement et la digestion de la queue de sperme

  1. Décongelez queue de l'épididyme sur la glace. Transfert queue décongelé à une boîte de Pétri et émincer soigneusement avec un scalpel ou une lame de rasoir.
  2. Ajouter 700 ul de la température ambiante D-PBS à la boîte de Pétri. L'utilisation d'un 1000 pi pointe de la pipette large de l'alésage, la libération des spermatozoïdes de la queue en tirant et en relâchant la suspension jusqu'à ce que le D-PBS devient trouble avec le sperme (environ 10 fois). REMARQUE: Pour préparer de gros calibre pointe de la pipette coupé 2-3 mm de l'extrémité d'une pointe de pipette en plastique.
  3. Filtrer la suspension à travers un filtre à mailles en acier inoxydable dans un nouveau tube de 1,5 ml. Laver la boîte de Pétri avec un 700 ul supplémentaires de D-PBS et transférer dans un même tube de 1,5 ml à travers le filtre à tamis. Retirer mailles, placer le tube sur la glace.
  4. Répéter les étapes 2.1 à 2.3 pour les échantillons restants.
  5. Spin samplesat 11 000 g pendant 3 min. Décanter le surnageant avec précaution. Pas perturber le culot.
  6. Ajouter 1,0 ml de citrate froid 1x saline de sodium (SSC). Vortex jusqu'à culot est complètement remis en suspension. Ce sera parfois prendre plusieurs séries de vortex.
  7. Ajouter 15 ul de SDS à 10%. Inverser / agiter vigoureusement pendant 30 secondes pour rompre les cellules non-spermatozoïdes. Secouer doucement aussi se traduire par une perturbation insuffisante et la pastille ne formera pas correctement dans l'étape suivante.
  8. Tourner à 11 000 g pendant 2 min. A, granulés en vrac "moelleux" est révélateur de perturbation incomplète des cellules somatiques en raison de l'insuffisance des secousses à l'étape 2.7. Si cela se produit, le secouer à nouveau l'échantillon, et respin jusqu'à ce qu'un culot serré est formé. Séparer avec précaution le surnageant. Pas perturber le culot. Brièvement tourner à nouveau et retirez surnageant restant avec 200 pipette ul.
  9. Ajouter 940 ul 0.2x SSC froid et vortex jusqu'à ce culot est remis en suspension. Ce culot peut être très difficile de remettre en suspension et peut prendre plusieurs cycles de vortex. Parfois, des touffes de sperm sont inévitables.
  10. Ajouter 120 ul β-mercaptoéthanol, 100 pi de SDS à 10%, 20 ul de EDTA 0,5 M, pH 8, et 20 pi de proteinase K (60 mg / ml, fraîchement préparée). Mélangez bien et digérer toute la nuit avec une rotation à 37 ° C. Procédez à l'extraction phénol / chloroforme.

Extraction / chloroforme 3 de phénol de l'ADN de sperme de la queue

Remarque: En raison de l'ADN nucléaire dans les spermatides en phase tardive et du sperme mûr est complexé avec des protamines, et est très condensée par rapport à l'ADN de cellules somatiques, les méthodes d'isolement d'acides nucléiques classiques ne génère pas l'ADN de rendement et une pureté suffisante pour l'essai de mutation à travailler efficace. Plusieurs extractions au phénol-chloroforme après une digestion agressif sont tenus de libérer et purifier l'ADN de sperme (basée sur des méthodes de 15).

  1. spermatozoïde de transfert de digestion dans un tube de polypropylene de 15 ml.
  2. Ajouter 2 ml de phénol: mélange de chloroforme (1: 1). Tourner le tube à 22 tours par minuteà 3 min.
  3. Centrifuger à 1600 g pendant 10 min et transférer la couche aqueuse supérieure avec la couche d'interface floue dans un nouveau tube de 15 ml.
  4. Répétez les étapes 3.1.2 et 3.1.3 3x, mais en changeant les temps de rotation à 3 min, 4 min, et 6 min, respectivement. Sur la répétition finale, d'éviter le transfert de toute la couche d'interface "floue".
  5. Après extraction de la 4 ème, ajouter 70 ul de NaAc 3 M, pH 5,2 par 1 ml d'extrait aqueux et de 2 ml de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1). Tourner le tube à 22 tours par minute pendant 12 min.
  6. Centrifuger à 1600 g pendant 10 min et transférer la couche supérieure aqueuse dans un nouveau tube de 15 ml.
  7. Précipiter l'ADN par addition de 2 volumes d'éthanol absolu et une légère rotation du tube sur le côté, doux balancement.
  8. Collecter de l'ADN par bobinage sur la pointe d'un pâturage pipette scellée à chaud. Rincer ADN en agitant la pointe de la pipette dans 70% d'éthanol et de l'air sec pendant 5 min.
  9. Après extraction, l'ADN précipité dissoudre dans 40 à 100 pi Tritampon s-EDTA, pH 8 Conserver à 4 ° C. Laisser dissoudre l'ADN à 4 ° C pendant au moins deux jours avant de procéder à l'essai de mutation lacZ. Si les problèmes de solubilité sont rencontrés, l'ADN peut encore être dissous à 65 ° C pendant 15 minutes avant utilisation. Déterminer la concentration de l'ADN avec un Spectrophotomètre à 260 A et de veiller à ce que la concentration de l'ADN en solution est comprise entre 200-2000 ng / ul.

4. isolement et la digestion des cellules germinales de séminifères tubules

  1. En cas de gel, décongeler testicule sur glace (environ 1 heure). Transfert testicule à une plaque de verre dépoli.
  2. Maintenir une extrémité du testicule avec une paire de forceps. A l'autre extrémité du testicule, de percer un trou dans la capsule épithéliale utilisant une autre paire de pinces ou une paire de ciseaux de dissection (figure 5A). Pincez les tubes séminifères travers la perforation et jetez la capsule épithéliale (figure 5B).
  3. Ajj 500 pi de la température ambiante D-PBS aux tubules séminifères décapsulés.
  4. Angle d'un rouleau de tissu (de caoutchouc de silicone solidement monté sur un tube à rotation libre de 5 mm de diamètre en acier inoxydable, ou un appareil similaire), de sorte qu'une extrémité est en contact avec la plaque à un angle d'environ 5 à 10 ° (figure 5C). Sans appliquer de pression, déplacez doucement le rouleau avant et en arrière à travers les tubes jusqu'à ce qu'ils soient aplatis et le D-PBS devient nuageux avec cellules libérées (environ 5-10x).
  5. Ajouter un autre 500 pi de D-PBS sur les tubules et rouler doucement sur les tubules quelques fois supplémentaires.
  6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml, tout en minimisant la quantité de tubes individuelles en cours de transfert (figure 5D).
  7. Répétez les étapes 4.5-4.6 pour collecter plus de cellules si nécessaire.
  8. Laisser 1 - 2 min pour toutes les tubules accidentellement recueillies à se déposent au fond du tube. Transférer le D-PBS pour un fresh 1,5 ml Tube laissant derrière les tubes installés (environ 100 de pi de D-PBS). Une petite aliquote de cette suspension peut être vérifiée au microscope (contraste de phase) pour évaluer la composition de la population de cellules.
  9. Isoler les cellules à 11 000 g pendant 30 sec. Séparer avec précaution le surnageant sans déranger le culot. Le culot de cellules peut être congelé à -80 ° C, à ce stade, si nécessaire.
  10. Décongeler les cellules si nécessaire. Le transfert dans un 15 ml à tubes en polypropylène et remettre en suspension dans 5 ml de tampon de lyse (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM d'EDTA, 100 mM de NaCl, 1 mg / ml de protéinase K, 1% SDS). Digest nuit dans un incubateur avec une rotation à 37 ° C.
  11. Procédez à l'extraction phénol / chloroforme.

5 phénol / chloroforme Extraction d'ADN à partir de cellules germinales Tube séminifère

Remarque: Une extraction moins agressif est utilisé pour isoler l'ADN des cellules des tubules séminifères germinale, étant donné que ces types de cellules ne sont pas encore progressé à ncondensation NUCLEAIRE.

  1. Ajouter 5 ml de phénol: mélange de chloroforme (1: 1) pendant une nuit à séminifère digestion de cellules de tubules. Tourner le tube à 22 tours par minute pendant 20 min.
  2. Centrifuger à 1600 g pendant 10 min et transférer la couche supérieure aqueuse, tout en évitant la couche d'interface «floue», dans un nouveau tube de 15 ml.
  3. Ajouter 100 ul de 5 M de NaCl par 5 ml d'extrait aqueux (habituellement de 5 ml est récupéré)
  4. Ajouter 5 ml de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1). Tourner le tube à 22 tours par minute pendant 12 min.
  5. Centrifuger à 1600 g pendant 10 min et transférer la couche supérieure aqueuse dans un nouveau tube de 15 ml.
  6. Précipiter l'ADN par addition de 2 volumes d'éthanol absolu et faire tourner doucement et en inversant les tubes.
  7. Collecter de l'ADN par bobinage sur la pointe d'une pipette de pâturage bouclé. Rincer ADN en agitant la pointe de la pipette dans 70% d'éthanol et de l'air sec pendant 5 min.
  8. Dissoudre dans l'ADN 40-100 ul de tampon Tris-EDTA, pH 8 Conserver à 4 ° C. Laisser dissoudre l'ADN à 4 ° C pendant un minimum de deuxjours avant de procéder à lacZ test de mutation (voir l'étape 3.9). Si les problèmes de solubilité sont rencontrés, l'ADN peut encore être dissous à 65 ° C pendant 15 minutes avant utilisation. Déterminer la concentration de l'ADN avec un Spectrophotomètre à 260 A et de s'assurer que la concentration est comprise entre 200 et 2000 ng / pl.

6. LacZ mutation Assay

La contamination bactérienne ou fongique peut interférer avec l'efficacité de l'emballage, ainsi que la croissance de la plaque dentaire et le ballon. Il est donc essentiel d'effectuer les essais de lacZ en utilisant les mesures d'asepsie appropriées pour empêcher la contamination de la réaction de l'emballage, de la culture et de la croissance hôte médias.

  1. Jour avant le test: Préparer bas Agar et de la Culture de nuit
    1. Huit plaques (4 plaques de marquer mutants, 4 plaques à compter titre) contenant 8 ml de fond de gélose chaque échantillon sont tenus par (c.-à-., 64 ml par échantillon). La gélose de fond est identique pour les deuxles plaques de titrage et de comptage mutantes. Préparer la gélose au fond suffisante pour que le nombre d'échantillons en cours de traitement. Verser aseptiquement dans des boîtes de Pétri de 90 mm (8 ml par boîte) et laisser la gélose se solidifier. REMARQUE: des plaques d'agar fond peuvent être préparés jusqu'à 1 semaine à l'avance.
    2. Dans un tube de 50 ml, ajouter 10 ml de bouillon LB, 100 ul d'une solution de maltose à 20%, 25 ul d'ampicilline (20 mg / ml) et 20 pi de kanamycine (5 mg / ml). Inoculer E. coli (lacZ - / Gale -) et 25 croître pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à 240 tours par minute.
  2. Jour 1: Les cellules sous-culture
    1. Sous-culture de cellules de la préparation d'une dilution 1: 100 de la culture pendant une nuit dans LB frais (sans antibiotiques). Un volume de 8 ml de la sous-culture est nécessaire pour l'échantillon. Incuber à 37 ° C sous agitation à 240 tours par minute pendant environ 3,5 heures jusqu'à ce que la DO 600 = 1.
    2. Lorsque DO 600 = 1, division cellulaire suspension uniformément dans tubes de 50 ml et centrifuger à 1300 g à 15 ° C pendant 10min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans la moitié du volume d'origine (c'est à dire., 4 ml par échantillon) de LB contenant mM MgSO 4 10. Mettez de côté jusqu'à ce que les cellules nécessaires [étape 6.2.4.3].
  3. Jour 1: Emballage ADN phage lambda particules
    1. Réchauffez-vous un bain d'eau à 30 ° C.
    2. L'utilisation d'un 10 embout de pipette ul large de l'alésage, 4 pl d'ADN de transfert à un tube de 1,5 ml. NOTE: Cette étape peut être réalisée un jour ou plus à l'avance pour réduire le temps de préparation.
    3. Faire chauffer le premier tube (rouge) à partir d'un kit d'extraction d'emballage de phage (1 tube pour toutes les 2 échantillons). Centrifuger brièvement pour recueillir extrait au fond du tube.
    4. Transférer 4,8 ul de l'extrait de l'emballage à partir du premier tube de l'échantillon d'ADN et mélanger par agitation douce à la pointe de la pipette. En bref centrifuger les échantillons dans des tubes. Incuber pendant 1,5 h à 30 ° C bain d'eau.
    5. Faire chauffer le second tube (bleu) de l'extrait de l'emballage (1 tube pour ~ 15 échantillons). Centrifuger brièvement pour recueillir extrait en basdu tube.
    6. Transférer 4,8 ul de l'extrait de l'emballage à partir du second tube à l'échantillon d'ADN et mélanger par agitation douce. En bref centrifuger les échantillons dans des tubes. Incuber pendant une heure supplémentaire à 1,5 à 30 ° C bain d'eau.
    7. Re-suspendre les particules de phage emballés dans 500 ul de tampon SM et mélanger en faisant tourner pendant 30 minutes à 20 tours par minute.
    8. Après avoir fait tourner, des échantillons de vortex brièvement et centrifuger à 11 000 g pendant 30 secondes pour prélever des échantillons au fond des tubes. Les particules de phage sont prêts à l'infection [étape 6.2.4].
  4. Jour 1: Préparer Top Agar
    1. Préparer supérieur gélose séparé pour les plaques de titrage et les plaques de sélection de mutants. Chaque échantillon a besoin de 4 plaques de titrage, et 4 plaques mutantes. Chaque plaque nécessite 8 ml top agar. Ajouter l'agent sélectif phényl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) à la partie supérieure de la sélection de mutants agar seulement. Préparer deux premiers géloses à l'avance (jour de test) et de maintenir à 50 ° C avant d'ajouter MgSO4 à deux géloses haut, et PGal mutant de gélose de sélection.
  5. Jour 1: l'infection des cellules par le phage emballés et placage
    1. Étiqueter deux tubes de 50 ml par échantillon: 1 "mutant" tube par échantillon et 1 "titre" tube par échantillon
    2. Label 8 plaques de gélose par exemple: 4 "mutants" plaques par échantillon et 4 "Titre" plaques par échantillon
    3. Aliquote de 2 ml de cellules remises en suspension provenant de l'étape [6.2.1.2] à chaque tube.
    4. Ajouter 500 ul de particules de phages emballés [6.2.2.8] de l'étape à (contenant des cellules) "mutant" tube de 50 ml. Mélanger doucement et permettent des particules de phage pour infecter les cellules pendant 30 min à température ambiante.
    5. Après 30 min, de vortex brièvement les cellules infectées et transférer 15 pl de cellules infectées à la appropriés 50 ml "titre" tube (contenant des cellules).
    6. Pour plaque échantillon de titre, ajouter 30 ml de chaud (50 ° C) top agar "du titre" (ne contenant pas de P-Gal) à tube de 50 ml "du titre". Immédiatement distribmélange agar / cellulaire ute entre les plaques 4 "de titre" (~ 8 ml par plaque). Travaillez rapidement afin que l'agar-agar en haut ne refroidit pas dans les pipettes, et essayez de ne pas introduire de bulles d'air.
    7. Plate échantillons "mutants" prochaine. Assurez-P-Gal est ajouté à la "sélection de mutants" top agar. Ajouter 30 ml de gélose chaud "de sélection de mutants" (contenant de la P-Gal) à tube de 50 ml de "mutant". Distribuer immédiatement mélange agar / cellulaire entre les plaques 4 "mutantes" (~ 8 ml par plaque).
    8. Autoriser les plaques se solidifier (~ 15 min), puis inversent et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
  6. Jour 2: Plaques de comptage
    1. Après une nuit d'incubation, compter le nombre de plaques sur les plaques de mutants et le titre. Pour un grand nombre de plaques, compter seulement une partie de la plaque à estimer le nombre total (par ex. Souvent ¼ de la plaque de titrage aura entre les plaques 100 à 200). Un minimum de 100 plaques doit être compté par plaque quand counting une partie de la plaque.
    2. Calculer le nombre de unités formatrices de plages (UFP) par ml de cellules. Cela se fait en divisant le nombre de plaques sur des plaques de titrage "" par le volume des cellules plaqué (15 pi).
    3. Utiliser le nombre de PFU / ul à estimer le nombre total de PFU dans le volume total de cellules infectées plaquées sur des plaques «mutant» (/ ul * UFP [2 ml de cellules + 0,5 ml de particules de phage emballés - 15 ul de plaques de titrage] ).
    4. Estimer la MF en divisant le nombre total de plaques mutants comptés sur les plaques 4 "mutantes" par le nombre total estimé de PFU dans le volume total de cellules infectées déterminées à partir des plaques "de titre".
  7. Lorsque le spontané lacZ MF est de l'ordre de 3 x 10 -5 dans le groupe témoin, comme pour les cellules germinales MutaMouse, la ligne directrice de l'OCDE recommande un minimum de 125 000 à 300 000 PFU non mutantes par animal être écraned de mutation afin d'obtenir un signal de référence fiable. D'autres modèles transgéniques peuvent avoir MF inférieur spontané, dans ce cas, un plus grand nombre de PFU serait nécessaire. Un test de puissance statistique peut être effectuée afin de déterminer le nombre minimal de PFU et animaux nécessaire pour obtenir la résolution souhaitée. Les données provenant de multiples répétitions peuvent être mises en commun pour satisfaire à cette exigence minimale de PFU, à condition qu'ils ne produisent pas de manière significative des fréquences différentes mutantes.

7. Statistiques

L'appareil d'essai pour l'analyse est la souris. Les données produites par ce test ne sont généralement pas distribuées normalement. En tant que tel, sélectionner la méthode statistique d'analyse sur la base de la caractéristique de distribution de données.

REMARQUE: Standard analyses paramétriques (. Exemple, analyse de la variance) peut être utilisé si la transformation de données appropriée est appliquée à égaliser la variance de la réponse dans l'ensemble des observation. Poisson ou analyses de régression binomiale sont souvent plus approprié. Analyse non paramétrique peut également être utilisé. Nous employons habituellement la régression de Poisson en utilisant la procédure du modèle linéaire généralisé (c'est à dire., Proc GENMOD) en SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC) telle que décrite par Lemieux et al 26.

Representative Results

Avec un nombre de plages moyenne de 200 000 plaques par animal, on observe généralement un fond moyenne MF d'environ 2,8 x 10 -5 dans les cellules germinales mâles avec une déviation standard de 1,7 x 10 -5 dans nos groupes de contrôle (basé sur les données de huit indépendant expériences). Avec ce nombre de plaque, le niveau de fond et de la variance, les groupes de dose avec n = 5 animaux chacun sont suffisants pour détecter une augmentation de 2 fois dans MF avec une puissance> 0,8.

Les résultats sont généralement signalées dans les tableaux ou graphiques formats. Tableau 2 et figure 6 montrent des résultats représentatifs de la queue des spermatozoïdes des hommes MutaMouse (n = 5 par groupe) exposés à une dose unique orale aiguë de 0, 25, 50 et 100 mg / kg N-éthyl-N-nitrosourée (ENU), suivie par un temps d'échantillonnage de 70 jours. Cette période de 70 jours permet de mesurer des événements mutationnels qui ont eu lieu dans les spermatozoïdes qui sont des cellules souches des spermatogonies au moment de l'exposition (Figure 3). La densité de la plaque sur des plaques typiques mutantes et titrage sont présentés sur la figure 7. Comme représenté dans le tableau 2 et figure 6, une exposition de courte durée ENU induit une augmentation dose-dépendante significative de la MF de cellules souches des spermatogonies. La faible dose a induit une augmentation significative de 2,6 fois par rapport aux témoins, ce qui a une ligne de base MF de 2,6 x 10 -5. Induction maximale a eu lieu dans la dose élevée, ce qui a provoqué une augmentation d'un facteur 4,4 par rapport aux témoins.

Un exemple de cette analyse effectuée sur les cellules des tubules germinales séminifères se trouve à Douglas et al. 27, où MF a été déterminée dans des cellules de tubule germinales à différents intervalles de temps après une répétition de l'injection intra-péritonéale de 5 jours de 50 mg / kg ENU. Dans cette étude, la proportion de mutants dans les cellules séminifères ont augmenté jusqu'à 15 jours après le traitement et sont restées constantes par la suite.

Expoque le régime Des tissus prélevés Type de cellules recueillies (cellule cible) Phase de cellule cible au début de l'exposition Phases passés lors de l'exposition
Aiguë + 70 Cauda Spermatozoïdes matures les cellules souches les cellules souches
14 + 21 Cauda Spermatozoïdes matures Spermatogonies Spermatide
14 + 35 Cauda Spermatozoïdes matures les cellules souches Spermatocyte
+ 28 3 Cauda Spermatozoïdes matures Spermatocyte Spermatocyte
Spermatide
Spermatozoïdes matures
Tubules les cellules souches les cellules souches les cellules souches
Spermatogonies Spermatogonia Spermatogonies
Spermatocyte Spermatocyte
Spermatide Spermatide
28 + 49 Cauda Spermatozoïdes matures cel souches les cellules souches
Tubules les cellules souches
Spermatogonies
Spermatocyte
Spermatide
les cellules souches les cellules souches

Tableau 1 Les types de cellules et les phases de la spermatogenèse qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par divers modèles expérimentaux.

Groupe dose Animaux # Mutant PFU Total des PFU MF (x10 -5) Moyenne MF (x 10 -5) Facteur de changement p-valeur
Contrôle 1 5 180245 2.8 2.6 1.0 -
2 4 137835 2.9
3 11 385672 2.9
4 2 431396 0,5
5 6 152413 3.9
25 mg / kg 6 17 162353 10.5 6.9 2.6 0,0002
7 14 150094 9.3
8 4 154401 2.6
9 9 154401 5.8
10 12 196978 6.1
50 mg / kg 11 17 155727 10,9 9.3 3.6 <0,0001
12 11 135847 8.1
13 25 193499 12,9
14 12 133859 </ Td> 9.0
15 14 252807 5.5
100 mg / kg 16 26 170968 15.2 11,5 4.4 <0,0001
17 28 234584 11,9
18 10 145289 6.9
19 35 292236 12,0
20 22 190848 11,5

Le tableau 2 de la fréquence de mutants de la queue du sperme dans lacZ mâle transgénique de mglace exposée aiguë à FRA quand ils étaient les spermatogonies souches (de temps d'administration = 1 journée, le temps d'échantillonnage = 70 jours). PFU = plaque forming unit, MF = fréquence des mutants.

Figure 1
Figure 1: Une représentation schématique de la construction du phage λgt10.

Figure 2
Figure 2: Un aperçu du rongeur germe test de mutation des cellules transgéniques.

Figure 3
Figure 3 Une vue schématique de la spermatogenèse chez la souris et les types de cellules et de phases qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par différents modèles expérimentaux. Remarque: Les barres blanches diplômés représentent la proportion relative des types de cellules présentes dans les suspensions cellulaires préparées à partir des tubules séminifères (c. spermatides> Spermatocytes> spermatogonies> cellules souches). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Collection de la queue de l'épididyme de souris. A) Faire une incision dans l'abdomen vers le scrotum. B) Identifier le coussinet adipeux de l'épididyme. C) Tirez doucement sur ​​le coussinet adipeux de faire ressortir les testicules et de l'épididyme. D) Recherchez et exciser la queue de l'épididyme.


Figure 5 Préparation de la suspension de cellules germinales à partir des tubules séminifères. A) Une incision est faite dans la capsule épithéliale du testicule, de l'exposition des tubes séminifères. B) Les tubes séminifères sont pressés hors de la capsule. C) un rouleau de tissu est délicatement passé sur les tubes à un angle de 5-10 ° par rapport à libérer les cellules germinales contiennent. D) La suspension de cellules germinales sont collectées pour un autre traitement.

Figure 6
Figure 6 Représentation graphique de la fréquence des mutations de lacZ dans MutaMouse sperme exposé aiguë que les cellules souches de FRA (n = 5). Chaquetriangle représente la MF d'un animal. * p <0,05 comme déterminé par régression de Poisson.

Figure 7
Figure 7 plaques d'agar représentatifs de l'essai de mutation de rongeurs transgéniques avec des plaques formées sur une pelouse de E. coli bactéries hôtes. A) Les plaques "mutants" auront très peu de plaques (marqués par des flèches), en particulier dans les groupes de dose de contrôle, qui de temps en temps avoir zéro plaques sur des plaques. B) Les plaques "de titre" peuvent avoir des centaines de plaques.

Discussion

Par rapport aux méthodes traditionnelles, le test de mutation des cellules germinales TGR fournit un moyen plus rapide, plus économique et plus sensibles de quantifier induit des mutations des cellules germinales in vivo. En évaluant transgène MF directement dans le sperme, par opposition à la descendance, le nombre d'animaux, le temps et les ressources nécessaires pour évaluer le pouvoir mutagène de la lignée germinale d'un seul composé est considérablement réduite. En termes de sensibilité, nous avons pu détecter une augmentation de 2,6 fois importante dans les cellules souches des spermatogonies MF après une exposition à 25 mg / kg FRA utilisant seulement 5 animaux par groupe de dose. En revanche, le test du locus spécifique a été incapable de détecter toute modification significative de MF à cette même dose en utilisant> 3.000 souris dans le groupe exposé et> 500 000 souris témoins 28.

En plus de sa pertinence pour les deux enquêtes mécanistes et réglementaires, cette méthode donne l'occasion à des études comparatives entre somatique et germinale ligne Mutatisur les taux. Des données récentes suggèrent que, pour certains agents mutations de cellules germinales peuvent être induites à une concentration inférieure à celle requise pour une mutation somatique. Par exemple, une exposition prolongée à la N-hydroxyméthylacrylamide, un métabolite de la acrylamide cancérigène alimentaire 12, augmente la fréquence des mutations des cellules germinales létales dominantes chez la souris sans affecter la fréquence de micronoyaux dans les cellules rouges du sang, une mesure traditionnelle de la cellule somatique dommages cytogénétiques 13. En outre, l'exposition de souris à deux fréquences de mutation principale et secondaire du tabac la fumée de tabac élevés à répétition en tandem loci d'ADN dans le sperme à des doses qui n'augmentent pas la fréquence des micronoyaux dans le sang 14. Ces résultats remettent en question l'hypothèse selon laquelle les tests de génotoxicité somatique est toujours protecteur de la lignée germinale, et renforcent la demande pour un moyen plus efficace et rentable pour quantifier germe fréquence de mutation cellulaire. Toutefois, la preuve pour préférentiels mutagènes des cellules germinales est encore faible, En grande partie en raison du manque de données disponibles pour comparer les taux de mutation dans les tissus des cellules somatiques et germinales. Le test de mutation TGR permet de tester en parallèle et la comparaison des taux de mutation induite dans plusieurs tissus utilisant le même transgène. Ainsi, le test de mutation comparative en utilisant le test TGR aiderait à combler les lacunes de données autour de la possibilité d'effets sur les cellules germinales préférentiels.

Évaluation simultanée de la mutation de cellules somatiques et germinales à des fins réglementaires permettrait également d'améliorer l'efficacité en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. La ligne directrice de l'OCDE pour les mutations somatiques recommande un temps d'administration de 28 jours, suivie d'une période d'échantillonnage de trois jours (28 + 3). Analyse de la queue des spermatozoïdes peut offrir une faible sensibilité à ce point de temps, car il cible les cellules exposées surtout pendant les spermatocytes et spermatides phases de la spermatogenèse (figure 3). Les cellules de ces phases ne synthétisent pas l'ADN et perdent progressivement leur capacité de réparation de l'ADN 6 </ Sup>. En outre, l'échantillonnage de la queue des spermatozoïdes à ce point dans le temps ne permettrait pas de détecter des mutations qui se produisent dans les cellules de spermatogonies et souches. Ainsi, pour l'intégration dans la conception 28 + 3, la directrice de l'OCDE recommande la collecte de cellules germinales à partir des tubules séminifères. Cette population mixte contient des cellules dérivées de la synthèse d'ADN et de types de cellules de réparation compétent, notamment les cellules souches, et sont exposés à travers la majorité des phases spermatogenèse. Toutefois, en raison de la nature mixte de ces cellules, séminifère analyse de cellules de tubules ne fournit pas d'information spécifique à la phase. En outre, il est à craindre que la présence de cellules non-cibles peuvent influencer le MF observé (par exemple faux positifs appels mutagène sur les cellules germinales en raison de la contamination de cellules somatiques mutés, ou dilution d'un signal de cellules germinales muté à partir de cellules germinales réparation de l'ADN déficientes) . Actuellement, il n'existe pas de données suffisantes pour conclure si les résultats des cellules des tubules séminifères à 28 + 3 offre la même sensibilité et la spécificité d'uns de la queue des spermatozoïdes à des moments ultérieurs. Notre laboratoire compare actuellement les CM induits dans les cellules des tubules séminifères et la queue des spermatozoïdes prélevés après différents temps d'échantillonnage pour aborder cette question. Nous notons que la directrice de l'OCDE suggère une période d'échantillonnage de remplacement de 28 jours pour les tissus en division lente tels que le foie qui peut également être adapté à l'analyse des cellules germinales. Néanmoins, les données disponibles sont encore insuffisantes et nous sommes actuellement pas en mesure de recommander un modèle expérimental unique pour l'analyse simultanée de cellules somatiques et les cellules germinales en utilisant le test de mutation TGR à des fins réglementaires.

Une des caractéristiques de cet essai qui devrait être noté est que les événements de mutation sont évalués sur un transgène non murin. Cependant, il ya suffisamment de preuves pour suggérer que le transgène répond aux agents mutagènes environnementaux d'une manière similaire à des gènes endogènes 20. En outre, parce que les origines précises des événements mutationnels indépendants sont difficiles àrésoudre, les résultats sont généralement rapportées comme une fréquence de mutants (par opposition à une fréquence de mutation). La fréquence de mutation peut être effectivement résolu que si les résultats sont corrigés pour l'expansion clonale (par exemple. La division et la multiplication d'une cellule mutée qui peut contribuer à la fréquence observée des mutants transgéniques) par séquençage d'ADN. Le séquençage des transgènes mutants peut être effectuée pour caractériser les mutations de lacZ, et identifier les mutants qui peuvent être dérivés à partir des événements de l'expansion clonale, bien que cela augmente considérablement le temps et le coût de l'analyse. En plus du gène lacZ, theλgt10 vecteur transgénique héberge un gène par mutation reporter alternatif dépendant de la température: une variante du gène λ du cil, ce qui est plus court (294 pb par rapport à la 3021 pb lacZ, figure 1) et plus facile à la séquence 29. Le séquençage permet également l'analyse du spectre de mutation induite, donnant un aperçu de la mutatiomécanisme final du composé en question. Un exemple extrême de l'expansion clonale est l'apparition d'un "jackpot" mutation (c'est à dire., Mutations transgéniques à un stade très précoce du développement d'un organe qui contribuent à une MF considérablement élevée, parfois des centaines de milliers de fois supérieures à fond). Animaux ou des tissus avec un "jackpot" mutation doivent être retirés de l'analyse.

Le test que nous avons décrit est largement applicable à d'autres modèles, tels que la TGR BigBlue souris et le rat, la souris et le plasmide lacZ, qui abritent une mutation vecteurs rapporteurs similaires (passés en revue dans 20). La grande majorité des études sur les cellules germinales menées à ce jour qui emploient des méthodes similaires ont porté presque exclusivement sur ​​mutagènes bien caractérisées telles que FRA et le rayonnement (revue dans 30). Il est prévu que la récente publication de la ligne directrice d'essai de l'OCDE pour l'essai TGR, ce test serade plus en plus populaire pour le dépistage chimique et évaluation réglementaire. L'incorporation de la cellule germinale test de mutation TGR dans une batterie de test réglementaire comblera le vide existant en permettant une évaluation efficace de l'induction de mutations dans les cellules germinales 11. De plus, ce dosage peut être utilisé pour mesurer MF dans pratiquement n'importe quel tissu, en fournissant un moyen adapté pour comparer les sensibilités relatives des cellules somatiques et les cellules germinales à l'induction de mutations par points de terminaison à des agents environnementaux génétiques identiques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MutaMouse Covance -
E. coli (lacZ-/galE-) Covance - See reference 25 in manuscript
Chloroform Caledon 3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) Gibco 14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 Sigma-Aldrich 03690 FLUKA
Isoamyl alcohol Caledon 2/10/7900
Lennon LB broth base Invitrogen 12780-029
Stainless steel mesh filter Sigma-Aldrich S3770
Transpack packaging extract Agilent Technologies 200220
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) Commercial Alcohols -
Ampicilin Gibco 11593-027 prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin Gibco 11815-024 prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol Invitrogen 15509-097 Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) Sigma-Aldrich P6501 dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K Invitrogen 25530-031 prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc) Fisher Scientific BP333-500 prepare 3 M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4390 prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
LB Broth 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC) 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 
SM Buffer 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8

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References

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