Transgena Gnagare analys för att kvantifiera Man Germ Cell Mutant Frekvens

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Brien, J. M., Beal, M. A., Gingerich, J. D., Soper, L., Douglas, G. R., Yauk, C. L., Marchetti, F. Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency. J. Vis. Exp. (90), e51576, doi:10.3791/51576 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Sporadiska DNA mutationer i könsceller kan leda till minskad reproduktionsframgång och, om ärftlig, kan orsaka genetisk sjukdom eller förhöjd predisposition för cancer hos avkomman 1-3. Betydande bevis visar att en stor andel av de novo mutationer ärvs från faderskönsceller 4, och att antalet mutationer hos avkomman är positivt korrelerad med faderlig ålder vid tidpunkten för befruktningen 5. Den högre andelen manliga mutationer tros vara ett resultat av åldersskillnaden under gametogenes mellan könen, det större antalet spermatogenescykler celldelningar jämfört med antalet oogenic celldelningar i den kvinnliga könsceller 2, och en progressiv minskning av DNA reparera effektiviteten med åldern hos män. Alla dessa faktorer bidrar till en ökad sannolikhet för replikering fel i den manliga könsceller 6. Men för att effekterna av faderns exponering Environmental faktorer på hur ofta de novo mutationer fortfarande osäker. Ändå är många miljöfarliga ämnen kända för att inducera könscells mutationer i gnagare 7, och det finns fler bevis för att en del av dessa medel kan också påverka människans könsceller 8. Trots dessa farhågor är kemikalier rutinmässigt testas för sin förmåga att framkalla mutationer i kroppsceller i regleringssyfte och det är allmänt antas att somatiska tester är tillräckliga för att skydda könsceller. Därför är kemikalier endast sällan utvärderas för sin förmåga att inducera könscells mutationer.

En anledning könscellsmutagena tester har till stor del saknas i tillsyns beslutsprocessen är en brist på praktiska metoder. Traditionella gnagare baserade metoder, som till exempel de dominerande dödliga 9 och specifika locus 10 tester, uppskatta könsceller mutationshastigheter genom poängsättning muterade fenotyper i embryon eller avkommaexponerade föräldrar. Dessa analyser kräver användning av ett mycket stort antal djur, tid och resurser för att förvärva statistmeningsfulla resultat.

Även om flera moderna metoder för kvantifiering av könsceller mutation har nyligen dykt upp, många lider brister när det gäller deras genomförbarhet, effektivitet, och biologisk relevans. Exempelvis upprepa längd mutationer vid expanderad enkel tandemupprepning (ESTR) loci kan kvantifieras i manliga könsceller med användning av en enda molekyl PCR strategi 15. Däremot kan utförandet av denna metod vara tekniskt utmanande och mödosam, och till skillnad från punktmutationer, den biologiska och hälsomässiga betydelse för förändringar i upprepningslängden av den mycket instabila ESTR loci fortfarande oklara 16. Moderna hela genomet sekvenseringsteknologier kan ge en mängd biologiskt meningsfulla uppgifter när de appliceras på problemet med ärftliga mutationer 4,17, men den höga kostnaden, hög felfrekvens, tillhörande validering krävsatt bekräfta mutationer, och bioinformatiska utmaningar fortfarande begränsa rutinmässig tillämpning av denna möjlighet i ett lagstadgade tester kapacitet 18.

Häri beskriver vi en praktisk metod för att kvantifiera inducerade mutationer direkt i könscellerna hos transgena möss av hankön. Detta protokoll beskrivs för den transgena MutaMouse modell, som har multipla sammankedjade kopior av en rekombinant λgt10 fagvektor innehållande en Escherichia coli-lacZ-rapportörgenen integrerad i båda kopiorna av kromosom 3 19 (fig 1).

Detta protokoll är också relevant för andra transgena gnagare (TGR) modeller baserade på samma principer (BigBlue mus och råtta, eller lacZ plasmid mus, osv.) Eller något olika reportergener (gpt delta mus och råtta, TGR-modeller omdömet i Lambert et al. 20). Denna metod är baserad på TGR mutationsanalys som beskrivs i en nyligen släpptoch reviderade OECD-testriktlinje 21 och vi vidareutveckla de särskilda överväganden som krävs för att rymma utvärdering av mutationer i den manliga könsceller på grund av de unika egenskaperna hos spermatogenes. I korthet innebär analysen utsätta transgena hanmöss till en mutagen substans, följt av en provtagningstid där pre-mutations lesioner är fästade i stabila mutationer. Vid den valda samplingstiden, möss avlivas och könsceller samlas antingen från cauda epididymis eller sädeskanalerna. Som diskuteras nedan, kan mutagena effekter vid olika faser av spermatogenesen bestämmas genom val av tid mellan exponering och provtagning. Transgena skär, som omfattar flera kopior av λ faggenom per cell, är isolerade från könsceller iskt DNA och packas in i tomma λ fag kapsider skapar smitt λ fagpartiklar som sedan används för att infektera ett E. coli-värd. De infekterade bakterierna odlas på selectiva medier som kan skilja celler som innehåller en vektor med en muterad kopia av lacZ från celler som vildtyp lacZ. Den mutagena effekten vid exponering på den manliga könsceller bestäms genom att jämföra frekvensen av muterade transgener mellan kontroll och behandlade möss (Figur 2, granskas i Lambert et al. 20). Ett stort antal könsceller kan analyseras från en enda mus, vilket ger denna analys överlägsen känslighet jämfört med traditionella metoder, samtidigt som man minskar det antal djur som behövs. Och eftersom ingen specialiserad utrustning eller utbildning krävs, ger denna analys ett praktiskt och effektivt alternativ för könsceller mutation testning i de flesta moderna toxikologi / molekylärbiologiska laboratorier.

En viktig förutsättning för en effektiv tillämpning av TGR könsceller mutation analys är en förståelse för den spermatogenescykler cykeln (Figur 3). Tiden för musen könsceller till framsteg från stem celler i sädeskanalerna till spermatogonier, spermatocyter, spermatider och slutligen mogna spermier i bitestiklarna (dvs. spermatogenes) är ca 49 dagar. Mutation kan ske vid olika stadier i denna cykel och ofta förening specifikt. Två viktiga funktioner som är av särskild betydelse för mutagenes i manliga könsceller är upphörandet av DNA-syntes under tidig meios och progressiv förlust av DNA-reparation kapacitet 6 under sen efter meios, två processer som krävs för induktion och fixering av flesta mutationer.

På grund av dessa unika egenskaper spermatogenesen, finns det tre viktiga experimentella variabler för genomförandet av TGR könsceller mutation assay: (1) testföreningen administrationstiden; (2) samplingstiden; och (3) val av könsceller befolkningen att samlas för analys (figur 3 och tabell 1). Administrering tid är experimental variabel som bestämmer hur långa målceller exponeras för testföreningarna. Längden på administreringstiden kan också användas för att rikta exponeringar mot specifika celltyper eller faser av spermatogenes. Till exempel kan en enda dag administrering användas för att bestämma effekterna av en akut exponering på en särskild celltyp. På samma sätt kan exponeringen fokuseras till en hel spermatogenescykler fas, till exempel genom att rikta bara meiotiskt delande spermatocyter eller mitotiskt dela spermatogonier med hjälp av en 2 veckors administration tid och en lämplig samplingstiden. Kroniska och under kronisk administration tider används för att bedöma effekterna av långvarig exponering, för att säkerställa tillräcklig farmakokinetiska fördelning av testföreningen, eller tillåta tillräcklig ansamling av mutationer från svaga mutagener (t.ex. 28 dagars administrationstiden rekommenderas i OECD test riktlinje).

Samplingstiden är kritisk variabel för att bestämma vid vilkenfasen av spermatogenes målcellerna var i vid tidpunkten för exponering. Tids provtagning dikterar hur mycket tid, och därmed hur mycket vidare längs spermatogenescykler cykeln cellerna passera efter exponering. Till exempel, för att undersöka effekter i stamcells spermatogonier, en provtagningstid> 49 dagar krävs om att samla fullt mognat spermier, eller> 42 dagar, om insamling av omogna könsceller från sädeskanalerna, för att säkerställa att alla insamlade celler har haft tillräckligt med tid för att utvecklas från utsatta stamceller. Det är viktigt att notera att en provtagningstid om minst 70 dagar skulle vara bättre att visa en sann stamcellseffekt att ge tillräcklig tid för farmakokinetiska distribution av giftet, för eliminering av celler som exponeras vid senare faser av spermatogenes, och ta hänsyn till en period av tillfällig sterilitet som kan inträffa ~ 6 veckor efter exponering för starkt mutagena föreningar 22. På samma sätt skulle en provtagningstid på 21 dagar så att spermier colleCTED från cauda epididymis hade just avslutat meios på den sista dagen av exponering.

Könsceller kan samlas in som mogna spermier från cauda epididymis, eller som en blandning av olika spermatogenescykler celltyper från sädeskanalerna. Mogna spermier kvar i cauda för ~ 3 dagar, vilket gör det möjligt att med relativ noggrannhet celltypen eller fas av spermatogenes som sperman härstammar för varje given experimentell design. Således analys av cauda spermier tillstånd välriktade undersökningar av scenspecifika mutationseffekterna. Å andra sidan, cellsuspensioner uppsamlade från sädeskanalerna innehålla en blandning av olika bakterie-celltyper i olika utvecklingsfaser, och därmed erbjuda sämre upplösning av spermatogenescykler fas där mutationer har sitt ursprung. Dessutom cellsuspensioner återvunnits från sädeskanalerna tenderar att innehålla en överrepresentation av spermatider, följt av spermatocyter och very få spermatogonier och stamceller (dessa andelar representeras av graderade vita staplar i figur 3). Dessutom kan suspensioner framställda från sädeskanalerna även innehålla olika somatiska celler. Således, eftersom så många celltyper är närvarande, mutations effekter kan påverkas av en mängd icke-målceller. Men att samla prover från sädeskanalerna ger ett ekonomiskt alternativ för att samtidigt screena flera könscellstyper och enkel integrering av könsceller analys i standarden OECD testprotokoll för somatisk mutation.

För att upprepa, beroende på behoven av utredaren, administrationstid, samplingstiden och den uppsamlade cellpopulationen kan justeras för att förhöra effekterna av exponering i olika celltyper och vid olika faser av spermatogenes. Genom att noggrant välja dessa variabler kan experiment utformas för riktade mekanistiska studier, eller för mer generaliserad föreskrivna provningsing ändamål.

För att uppnå kunskaper i analysen, rekommenderar vi användning av en akut oral administrering av 100 mg / kg N-etyl-N-nitrosourea (ENU), följt av en 70 dagars provtagningstid som positiv kontroll. Analys av cauda spermier riktar alltså spermatogoniala stamceller (Figur 3), som normalt uppvisar en 4-5 faldig ökning av mutationsfrekvens (MF) över kontrollerna efter denna mycket mutagen dos ENU. Det bör noteras att denna dos är känd för att inducera sterilitets 6 veckor efter exponering, så det inte kan vara en lämplig kontroll dos för kortare samplingstider. Denna dos kommer också att producera en detekterbar ökning av MF i de flesta somatiska vävnader 20. De representativa resultat som presenteras nedan genererades efter en akut 70 exponeringsbehandling med användning av tre doser av ENU upp till och med 100 mg / kg.

Protocol

Alla protokoll som handlar om djurhållning, underhåll och hantering godkändes av Health Canadas djurvård kommitté.

1. Djur exponeringar

  1. Slumpmässigt distribuera transgena hanmöss (8-12 veckor gamla) för att styra grupper och behandlingsgrupper (min = 5 per grupp) .Treat möss med testförening och relevant kontroll genom ett lämpligt exponeringsvägen för den valda administrationstiden. Välj lämplig samplingstiden i enlighet med den spermatogenescykler celltyp av intresse (Figur 3).
  2. Efter samplingstiden, avliva möss genom halshuggning i isofluorane anestesi (eller annan lämplig metod). Dra försiktigt testiklarna från ett snitt i buken eller pungen och skära cauda bitestiklar. (Figur 4, för att visa en detaljerad video bitestiklarna samling se Duselis et al. 24). Alternativt, samla testiklarna om analys sädeskanalens tubuliS-celler. Frys i flytande kväve och förvara vid -80 ° C för senare användning.

2 Isolering och Rötning av Cauda Sperm

  1. Upptining cauda epididymis på is. Överför tinade cauda till en petriskål och noggrant mala med en skalpell eller rakblad.
  2. Lägg 700 l av rumstemperatur D-PBS till petriskål. Med hjälp av en bred borrning 1,000 l pipettspets, frigör spermier från cauda genom att rita och släppa suspensionen tills D-PBS blir grumlig med spermier (ca 10 gånger). OBS: För att framställa bred borrning pipettspets skära 2-3 mm från änden av en plast pipettspets.
  3. Filter suspensionen genom ett rostfritt stålnät filter till ett nytt 1,5 ml rör. Tvätta petriskål med ytterligare 700 l av D-PBS och överför till samma 1,5 ml rör genom nätfiltret. Ta mesh, placera röret på is.
  4. Upprepa steg 2,1-2,3 för kvarvarande prov.
  5. Spin samplesat 11.000 xg under 3 min. Dekantera försiktigt supernatanten. Undvik att störa pelleten.
  6. Lägg 1,0 ml kall 1x salin natriumcitrat (SSC). Vortex tills pellets är helt åter avbrytas. Detta kommer ibland ta flera omgångar av virvelbildning.
  7. Lägg 15 ul av 10% SDS. Invertera / skaka kraftigt under 30 sekunder för att störa utan spermier. Skakning alltför försiktigt kommer att resultera i otillräcklig störning och pelleten bildar inte ordentligt i det följande steget.
  8. Snurra vid 11.000 xg under 2 min. Ett löst, "fluffig" pellet är indikativ för ofullständig upplösning av somatiska celler på grund av otillräcklig skakning i steg 2,7. Om detta sker, helt enkelt skaka provet igen och respin tills en tät pellet bildas. Försiktigt dekantera supernatanten. Undvik att störa pelleten. Snurra kort igen och ta bort kvarvarande supernatanten med 200 l pipett.
  9. Lägg 940 l 0,2x kalla SSC och skaka tills återsuspenderas. Denna pellet kan vara mycket svår att återsuspendera och kan ta flera omgångar av virvling. Ibland klumpar av sperm är oundvikliga.
  10. Lägg 120 | il β-merkaptoetanol, 100 | il 10% SDS, 20 | il 0,5 M EDTA, pH 8, och 20 ul proteinas K (60 mg / ml, bereddes färskt). Blanda väl och smälta över natten med rotation vid 37 ° C. Gå vidare till fenol / kloroform-extraktion.

3 Fenol / kloroform Extraktion av DNA från Cauda Sperm

OBS: På grund av att kärn-DNA i sen fas spermatider och mogna spermier är komplex med protaminer och är mycket kondens jämfört med DNA från somatiska celler, konventionella nukleinsyraisolering metoder kommer inte att generera DNA tillräckligt utbyte och renhet för mutationstest att arbeta effektivt. Flera fenol-kloroformextraktioner efter en aggressiv matsmältningen krävs för att frigöra och rena spermiens DNA (baserad på metoder från 15).

  1. Transfer spermie smälta till en 15 ml polypropylen rör.
  2. Tillsätt 2 ml fenol: kloroform-blandning (1: 1). Rotera röret vid 22 rpmför 3 min.
  3. Centrifugera vid 1600 xg under 10 min och överföra vattenhaltiga övre skiktet tillsammans med det luddiga gränssnittsskiktet till ett färskt 15 ml rör.
  4. Upprepa steg 3.1.2 och 3.1.3 3x, men att ändra rotationstider till 3 min, 4 min och 6 min. På den sista upprepning, undvika att överföra något av "fuzzy" gränssnittslager.
  5. Efter 4: e utvinning, tillsätt 70 ìl av 3M NaAc, pH 5,2 per 1 ml vattenextrakt och 2 ml kloroform: isoamylalkohol (24: 1). Rotera röret vid 22 rpm i 12 min.
  6. Centrifugera vid 1600 xg under 10 min och överföra vattenhaltiga övre skiktet till ett färskt 15 ml rör.
  7. Fällning DNA genom tillsats av två volymer absolut etanol och försiktigt roterande röret på sidan med försiktig skakning.
  8. Samla DNA genom att buffra på spetsen av en värmeförsluten betesmark pipett. Skölj DNA genom virvlande pipettspetsen i 70% etanol och lufttorka i 5 min.
  9. Efter extraktion, lös DNA fällningen i 40-100 pl Tris-EDTA-buffert, pH 8 Lagra vid 4 ° C. Låt DNA för att lösa upp vid 4 ° C under minst två dagar innan du fortsätter till lacZ mutationsanalys. Om problem löslighetsegenskaper påträffas kan DNA upplöstes ytterligare vid 65 ° C under 15 min före användning. Bestäm koncentrationen av DNA med ett spectrophotometre vid A 260 och säkerställa att koncentrationen av det lösta DNA: t är mellan 200-2000 ng / ul.

4 Isolering och Rötning av könsceller från sädeskanalerna

  1. Om fryst, tina testis på is (ca 1 h). Överföring testiklar till en slipad glasplatta.
  2. Håll ena änden av testikel med en pincett. Vid den andra änden av testis, punktera ett hål i den epiteliala kapsel med användning en annan pincett eller ett par av dissektion sax (figur 5A). Kläm sädeskanalerna genom punktering och kassera epiteliala kapseln (Figur 5B).
  3. Ettdd 500 fil rumstemperatur D-PBS till decapsulated sädeskanalerna.
  4. Vinkel a vävnadsrullen (silikongummi tätt inpassad över en fritt roterande 5 mm diameter rör av rostfritt stål, eller liknande apparat) så att en ände är i kontakt med plattan vid en ungefärlig vinkel av 5-10 ° (fig 5C). Utan att något tryck, rör försiktigt rullen fram och tillbaka över tubuli tills de är tillplattade och D-PBS blir grumlig med frigjorda celler (ca 5-10x).
  5. Lägg ytterligare 500 l av D-PBS över tubuli och försiktigt rulla över tubuli ytterligare några gånger.
  6. Överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrofugrör och samtidigt minimera mängden av fristående tubuli överförs (Figur 5D).
  7. Upprepa steg från 4,5 till 4,6 för att samla fler celler vid behov.
  8. Tillåt 1-2 min för eventuella misstag insamlade tubuli för att sedimentera till botten av röret. Överför D-PBS till en frESH 1,5 ml rör lämnar bakom de sedimente tubuli (ca 100 | il av D-PBS). Kan kontrolleras En liten dos av denna suspension under ett mikroskop (fas kontrast) för att bedöma sammansättningen av cellpopulationen.
  9. Centrifugera ner cellerna vid 11.000 xg under 30 sek. Försiktigt dekantera supernatanten utan att störa pelleten. Cellpelleten kan frysas vid -80 ° C vid denna punkt om så behövs.
  10. Tina celler om så erfordras. Överföring till ett 15 ml polypropylenrör och återsuspendera cellerna i 5 ml lyseringsbuffert (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg / ml proteinas K, 1% SDS). Digest övernattning i kuvös med rotation vid 37 ° C.
  11. Gå vidare till fenol / kloroform-extraktion.

5. fenol / kloroform extraktion av DNA från sädeskanalens tubuli könsceller

OBS: En mindre aggressiv utvinning används för att isolera sädeskanalerna DNA i könsceller, eftersom dessa celltyper ännu inte har utvecklats genom nuclear kondensation.

  1. Tillsätt 5 ml fenol: kloroform-blandning (1: 1) för att över natten sädeskanalerna cell matsmältning. Rotera röret vid 22 rpm under 20 min.
  2. Centrifugera vid 1600 xg under 10 min och överföra vattenhaltiga övre skiktet, samtidigt som man undviker den "fuzzy" gränssnittslager, till ett färskt 15 ml rör.
  3. Tillsätt 100 pl av 5 M NaCl per 5 ml vattenextrakt (vanligtvis 5 ml återvinns)
  4. Lägg 5 ml kloroform: isoamylalkohol (24: 1). Rotera röret vid 22 rpm i 12 min.
  5. Centrifugera vid 1600 xg under 10 min och överföra vattenhaltiga övre skiktet till ett färskt 15 ml rör.
  6. Fällning DNA genom tillsats av två volymer absolut etanol och försiktigt roterande och invertera rören.
  7. Samla DNA genom att buffra på spetsen av en avtätad betesmark pipett. Skölj DNA genom virvlande pipettspetsen i 70% etanol och lufttorka i 5 min.
  8. Upplös DNA i 40 till 100 | il Tris-EDTA-buffert, pH 8 Lagra vid 4 ° C. Tillåt DNA för att upplösas vid 4 ° C under ett minimum av tvådagar innan du fortsätter till lacZ mutationstest (se steg 3.9). Om problem löslighetsegenskaper påträffas kan DNA upplöstes ytterligare vid 65 ° C under 15 min före användning. Bestäm koncentrationen av DNA med ett spectrophotometre vid A 260 och säkerställa att koncentrationen är mellan 200 och 2000 ng / ul.

6. LacZ mutationstest

Bakteriell eller svampkontaminering kan interferera med förpackningseffektiviteten, liksom placktillväxt och poängsättning. Det är därför kritiskt att utföra lacZ-analysen med användning av de lämpliga aseptiska åtgärder för att förhindra kontaminering av förpacknings reaktionen värdkultur och tillväxtmedier.

  1. Dagen före analys: Förbered Bottom Agar och natten kultur
    1. Åtta plattor (4 plattor att göra mål mutanter, fyra plattor att räkna titer) innehållande 8 ml botten agar vardera krävs per prov (dvs., 64 ml per prov). Botten agar är identisk för bådede muterade och titer räkna plattor. Förbered tillräckligt botten agar för antalet prover som bearbetas. Aseptiskt häll i 90 mm petriskålar (8 ml per skål) och låt agar stelna. NOTERA: Botten agarplattor kan framställas upp till en vecka i förväg.
    2. I en 50 ml tub lägga 10 ml LB-buljong, 100 ul av 20% maltos-lösning, 25 | il ampicillin (20 mg / ml) och 20 ^ il kanamycin (5 mg / ml). Inokulera med E. coli (lacZ - / galE -) 25 och växa över natten vid 37 ° C med skakning vid 240 rpm.
  2. Dag 1: Underkultur Celler
    1. Sub-kulturceller genom att bereda en 1: 100 spädning av övernattskultur i färskt LB (inga antibiotika). Det behövs en volym på 8 ml subkultur per prov. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 240 rpm under ca 3,5 h tills OD 600 = 1.
    2. När OD 600 = 1, dividera cellsuspensionen jämnt i 50 ml rör och centrifugera vid 1300 xg vid 15 ° C under 10min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i hälften av den ursprungliga volymen (dvs.., 4 ml per prov) i LB innehållande 10 mM MgSO 4. Sätt celler åt sidan tills det behövs [steg 6.2.4.3].
  3. Dag 1: Emballage DNA i lambdafag Partiklar
    1. Värm upp ett vattenbad till 30 ° C.
    2. Med hjälp av en bred-borrningen 10 mikroliter pipettspets, överföra 4 ^ il DNA till ett 1,5 ml rör. OBS: Detta steg kan utföras en dag eller mer i förväg för att minska förberedelsetid.
    3. Värm upp det första röret (röd) från en fagförpackningsextrakt kit (1 rör för varje 2 prover). Snurra korthet att samla extrakt i botten av röret.
    4. Överför 4.8 l av förpacknings utdrag ur det första röret till DNA-provet och blanda genom försiktig omrörning med pipettspetsen. Snurra kort ner prover i rör. Inkubera under 1,5 h i 30 ° C vattenbad.
    5. Värm upp den andra (blå) förpackningsextrakt rör (1 rör för ~ 15 prover). Snurra korthet att samla extrakt vid bottenav röret.
    6. Överför 4.8 l av förpacknings utdrag ur det andra röret till DNA-provet och blanda genom försiktig omrörning. Snurra kort ner prover i rör. Inkubera under ytterligare 1,5 h i 30 ° C vattenbad.
    7. Återsuspendera förpackade fagpartiklar i 500 | il SM-buffert och blanda genom att rotera under 30 min vid 20 rpm.
    8. Efter att rotera, kort virvel prover och centrifugera vid 11.000 xg under 30 sekunder för att samla in prover på botten av rör. Fagpartiklar är redo för infektion [steg 6.2.4].
  4. Dag 1: Förbered Top Agar
    1. Bered separat toppagar för titerplattor och mutanta selektionsplattor. Varje prov kräver 4 titerplattor och fyra muterade plattor. Varje platta kräver 8 ml toppagar. Lägg det selektiva medlet fenyl-β-D-galaktopyranosid (P-Gal) till mutantselektion toppagar endast. Förbered båda topp agar i förväg (dag av analys) och hålls kvar vid 50 ° C före tillsats MgSO 4 till båda topp agar, och PGal mutantvalet agar.
  5. Dag 1: infektera celler med förpackad Fag och plätering
    1. Märk två 50 ml rör per prov: 1 "mutant" rör per prov och 1 "titer" rör per prov
    2. Etikett 8 agarplattor per prov: 4 "mutant" plattor per prov och 4 "titer" plattor per prov
    3. Alikvotera 2 ml resuspenderade celler [från steg 6.2.1.2] till varje rör.
    4. Lägg 500 l av förpackade fagpartiklar [från steg 6.2.2.8] till "mutant" 50 ml tub (innehållande celler). Blanda försiktigt och tillåta fagpartiklar för att infektera celler för 30 min vid rumstemperatur.
    5. Efter 30 min, kort virvel infekterade celler och överföra 15 l av infekterade celler till den lämpliga 50 ml "titer" röret (innehållande celler).
    6. Till plattan titer prov, tillsätt 30 ml varmt (50 ° C) "titer" top agar (INTE innehåller P-Gal) till "titer" 50 ml tub. Omedelbart distribute agar / cellblandningen mellan de fyra "titer" plattor (~ 8 ml per platta). Arbeta snabbt så att den övre agar inte svalna i pipetterna, och försöka att inte införa luftbubblor.
    7. Plate de "muterade" prov nästa. Se till P-Gal sätts till "mutant val" top agar. Tillsätt 30 ml varmt "mutant val" agar (innehållande P-Gal) till "mutant" 50 ml tub. Omedelbart distribuera agar / cellblandningen mellan de fyra "mutant" plattor (~ 8 ml per platta).
    8. Låt plattorna stelna (~ 15 min) därefter invertera och inkubera vid 37 ° C över natten.
  6. Dag 2: Räkna Plack
    1. Efter inkubering över natt, räknas antalet plack på plattorna mutanta och titer. För ett stort antal placker, räknas endast en del av plattan för att uppskatta det totala antalet (t.ex.., Ofta ¼ av titern plattan kommer att ha mellan 100-200 placker). Minst 100 plack bör räknas per platta när counting en del av plattan.
    2. Beräkna antalet plackbildande enheter (PFU) per | il av celler. Detta görs genom att dividera antalet plack på "titer" plattor med volymen av celler pläterade (15 pl).
    3. Använd antalet PFU / xl för att uppskatta det totala antalet PFU i den totala volymen av infekterade celler utstrukna på de "mutant"-plattor (PFU / il * [2 ml celler + 0,5 ml förpackade fagpartiklar - 15 ul för titerplattor] ).
    4. Uppskatta MF genom att dividera det totala antalet muterade plack räknade på de 4 "mutant" plattor av det uppskattade totala antalet PFU i den totala volymen av infekterade celler bestäms från "titer" plattor.
  7. När spontana lacZ MF är i storleksordningen 3 x 10 -5 i kontrollgruppen, eftersom den för MutaMouse könsceller, rekommenderar OECD riktlinje minst 125.000 till 300.000 icke-muterade PFU per djur vara skärmed för mutation för att få en pålitlig grund signal. Andra transgena modeller kan ha lägre spontan MF, i vilket fall ett större antal PFU skulle krävas. En statistisk styrka test kan utföras för att fastställa det minsta antalet PFU och djur krävs för att få önskad upplösning. Data från flera replikat kan slås samman för att uppfylla detta minimi PFU krav, förutsatt att de inte producerar signifikant olika mutantfrekvenser.

7. Statistik

Den experimentella enheten för analysen är musen. Data som framställts av denna analys är i allmänhet inte normalfördelade. Som sådan, välj statistisk metod för analys baserat på fördelningen egenskap av uppgifterna.

OBS: Standard parametriska analyser (. T.ex. ANOVA) kan användas om lämpliga uppgifter transformation tillämpas för att utjämna variationen av svar inom alla observationstion. Poisson eller binomial regressionsanalyser är ofta lämpligare. Nonparametric analys kan också användas. Vi använder rutinmässigt Poisson regression med generaliserad linjär modell förfarande (dvs., Proc Genmod) i SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC) som beskrivits av Lemieux et al 26.

Representative Results

Med en genomsnittlig plack räkna till 200.000 plack per djur, vi vanligtvis iaktta en genomsnittlig bakgrund MF på ca 2,8 x 10 -5 i manliga könsceller med en standardavvikelse på 1,7 x 10 -5 i våra kontrollgrupper (baserat på data från åtta oberoende experiment). Med denna plack räkna, bakgrundsnivån och varians, dosgrupperna med n = 5 djur vardera är tillräckliga för att upptäcka en 2-faldig ökning av MF med makt> 0.8.

Resultaten typiskt rapporteras i tabellform eller grafiskt. Tabell 2 och figur 6 visar representativa resultat från cauda spermier av MutaMouse hanar (n = 5 per grupp) som utsätts för en enda akut oral dos av 0, 25, 50, och 100 mg / kg N-etyl-N-nitrosurea (ENU) följt av en 70 dagars samplingstid. Denna 70-dagarsperiod möjliggör mätning av mutationshändelser som inträffade i spermier som var spermatogoniala stamceller vid tidpunkten för exponering (Figur 3). Typiska placktäthet på mutanta och titerplattor visas i Figur 7. Såsom visas i tabell 2 och fig 6, akut ENU exponering inducerade en signifikant dosberoende ökning av MF spermatogoniala stamceller. Den låga dosen framkallade en signifikant 2,6-faldig ökning jämfört med kontroller, som hade en baslinje MF på 2,6 x 10 -5. Maximal induktion inträffade i höga doser, vilket framkallade en 4,4-faldig ökning jämfört med kontroller.

Ett exempel på denna analys utförs på seminiferous tubulus könsceller kan hittas i al. Douglas et 27, där MF bestämdes i tubuli könsceller vid olika tidsintervall efter en 5 dagars upprepad intraperitoneal injektion av 50 mg / kg ENU. I den studien, mutantfrekvenser i seminiferous celler ökas upp till 15 dagar efter behandling och förblev konstant därefter.

Exposäker regim Uppsamlat vävnad Uppsamlat celltyp (målcellen) Fas av målcellen i början av exponeringen Faser passerade under exponering
Akut + 70 Cauda Mogna spermier Stamcells Stamcells
14 + 21 Cauda Mogna spermier Spermatogonier Spermatid
14 + 35 Cauda Mogna spermier Stamcells Spermatocyte
28 + 3 Cauda Mogna spermier Spermatocyte Spermatocyte
Spermatid
Mogna spermier
Tubuli Stamcells Stamcells Stamcells
Spermatogonier Spermatogonia Spermatogonier
Spermatocyte Spermatocyte
Spermatid Spermatid
28 + 49 Cauda Mogna spermier Stem cel Stamcells
Tubuli Stamcells
Spermatogonier
Spermatocyte
Spermatid
Stamcells Stamcells

Tabell 1 Cell typer och faser av spermatogenes som är riktade genom den transgena gnagare mutationsanalys av olika experimentella design.

Dosgruppen Animal # Mutant PFU Totalt pfu MF (x10 -5) Genomsnitt MF (x 10 -5) Fold förändring p-värde
Kontroll 1 5 180.245 2,8 2,6 1,0 -
2 4 137.835 2,9
3 11 385.672 2,9
4 2 431.396 0,5
5 6 152.413 3,9
25 mg / kg 6 17 162.353 10,5 6,9 2,6 0,0002
7 14 150.094 9,3
8 4 154.401 2,6
9 9 154.401 5,8
10 12 196.978 6,1
50 mg / kg 11 17 155.727 10,9 9,3 3,6 <0,0001
12 11 135.847 8,1
13 25 193.499 12,9
14 12 133.859 </ Td> 9,0
15 14 252.807 5,5
100 mg / kg 16 26 170.968 15,2 11,5 4,4 <0,0001
17 28 234.584 11,9
18 10 145.289 6,9
19 35 292.236 12,0
20 22 190.848 11,5

Tabell 2. lacZ mutationsfrekvens i cauda sperma av transgen manliga mis utsätts akut till ENU när de var spermatogoniala stamceller (administration tid = 1 dag, provtagningstid = 70 dagar). PFU = plackbildande enhet, MF = mutationsfrekvens.

Figur 1
Figur 1 En schematisk representation av λgt10 fag konstruktet.

Figur 2
Figur 2 En översikt av den transgena gnagare könscellsmutationsanalys.

Figur 3
Figur 3 En schematisk ritning av spermatogenes hos mus och celltyper och phases som är riktade genom den transgena gnagare mutationsanalys av olika experimentella designer. OBS: De graderade vita staplarna representerar den relativa andelen av celltyper som finns i cellsuspensioner framställda från sädeskanalerna (dvs. spermatider> spermatocyter> spermatogonier> stamceller). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4 Insamling av musen cauda epididymis. A) Gör ett snitt i buken mot pungen. B) Identifiera epididymal fettkudden. C) Dra försiktigt ut fettkudden att dra ut testiklarna och bitestiklarna. D) Leta upp och skära cauda epididymis.


Figur 5 Beredning av suspension av könsceller från sädeskanalerna. A) Ett snitt görs i den epiteliala kapsel av testiklarna, utsätta sädeskanalerna. B) sädeskanalerna kläms ut ur kapseln. C) En vävnads välten försiktigt passera över tubuli vid en 5-10 ° vinkel i förhållande till frigöra könsceller som finns i. D) Den könscell suspensionen samlas in för vidare bearbetning.

Figur 6
Figur 6 Grafisk representation av lacZ mutationsfrekvens i MutaMouse spermier utsatt akut som stamceller till ENU (n = 5). Varjetriangel representerar MF av ett djur. * p <0,05 enligt bestämning med Poisson regression.

Figur 7
Figur 7. Representativa agarplattor från den transgena gnagare mutationsanalys med plack som bildas på en matta av E. coli-värdbakterier. A) De "muterade" plattor kommer att ha mycket få plack (markerade med pilar), särskilt i kontroll dosgrupperna, som ibland kommer att ha noll plack på vissa plattor. B) De "titer" plattor kan ha hundratals plack.

Discussion

Jämfört med traditionella metoder ger TGR könsceller mutation assay ett snabbare, mer ekonomiska, och känsligare metoder att kvantifiera inducerad in vivo könsceller mutationer. Genom att bedöma transgen MF direkt i spermier, i motsats till avkomma, antalet djur, är tid och resurser som krävs för att bedöma könsceller mutagenicitet varje enskild förening betydligt. När det gäller känslighet, kunde vi upptäcka en signifikant 2,6-faldig ökning av spermatogonier stamcells MF efter exponering för 25 mg / kg ENU med endast fem djur per dos grupp. Däremot den specifika locus analysen kunde inte upptäcka någon väsentlig förändring av MF vid samma dos med hjälp av> 3.000 möss i den exponerade gruppen och> 500.000 kontrollmöss 28.

Förutom dess lämplighet för både mekanistiska och regulatoriska utredningar, ger denna metod en möjlighet för jämförande studier mellan somatisk och könsceller Mutatiom priser. De senaste rönen visar att för vissa agenter könsceller mutationer kan induceras vid lägre koncentration än vad som krävs för somatisk mutation. Till exempel långvarig exponering för N-hydroxymethylacrylamide, en metabolit av cancerframkallande livsmedels akrylamid 12, ökar frekvensen av dominerande dödliga könscells mutationer hos möss utan att påverka mikrokärnfrekvens i röda blodkroppar, ett traditionellt mått på somatisk cell cytogenetisk skada 13. Dessutom exponeras möss till både vanliga och sidoström tobaksrök ger förhöjda mutationsfrekvenser vid tandem upprepa DNA loci i spermier vid doser som inte ökar blodmikrokärnfrekvens 14. Dessa resultat utmanar antagandet att somatiska genotoxicitetstester alltid skyddande av könsceller, och stärka efterfrågan på ett effektivare och kostnadseffektivt sätt att kvantifiera könsceller mutationsfrekvensen. Dock är fortfarande svag bevisen för förmånskönscellsmutagener, Främst på grund av bristen på tillgängliga data för att jämföra mutationshastigheter på somatiska och könscellvävnader. Den TGR mutationstest möjliggör parallell testning och jämförelse av inducerade mutationshastigheter i flera vävnader med samma transgenen. Således jämförande mutation testning med hjälp av TGR-analysen skulle hjälpa fylla uppgiftsluckor kring möjligheten till förmånliga groddceller.

Samtidig bedömning av somatiska och könsceller mutation för lagstadgade tester skulle också förbättra effektiviteten genom att minska antalet djur som krävs. OECD riktlinje för somatisk mutation rekommenderar en 28 dagars administration tid, följt av en tre dagars provtagningstid (28 + 3). Analys av cauda spermier kan erbjuda svaga känslighet vid denna tidpunkt, eftersom den riktar celler som utsätts oftast under spermatocyte och spermatid faser spermatogenes (Figur 3). Celler i dessa faser inte syntetisera DNA och gradvis förlorar sin förmåga till DNA-reparation 6 </ Sup>. Dessutom skulle provtagning cauda spermier vid denna tidpunkt inte upptäcker mutationer uppträder i spermatogonier och stamceller. Således, för att integreras i det 28 + 3 designen rekommenderar OECD riktlinje samla könsceller från sädeskanalerna. Denna blandade populationen innehåller celler som härrör från DNA-syntes och reparations kompetenta celltyper, inkluderande stamceller, och exponeras över flertalet spermatogenescykler faser. Men på grund av den blandade karaktären av dessa celler, sädeskanalerna cellanalys ger inte fas-specifik information. Dessutom finns det oro för att närvaron av icke-målceller kan påverka den observerade MF (t.ex. falskt positiva mutagena samtal på grund av kontaminering av muterade somatiska celler, eller utspädning av en muterad könscell signal från DNA-reparation-brist könsceller) . För närvarande finns det inte tillräckligt med data för att avgöra om resultaten från sädeskanalerna celler vid 28 + 3 erbjuder samma känslighet och specificitet as cauda spermier vid senare tidpunkter. Vårt laboratorium är för närvarande jämföra inducerade MFs i sädeskanalerna celler och cauda sperma som samlats in efter olika provtagningstider för att ta itu med denna fråga. Vi noterar att OECD riktlinje föreslår en alternativ provtagningstiden på 28 dagar för långsamt delande vävnader såsom levern som också kan vara lämpliga för könsceller analys. Ändå finns uppgifter fortfarande otillräckliga och vi är för närvarande inte rekommendera en enda experimentell design för samtidig analys av somatiska celler och könsceller med hjälp av TGR mutationsanalys för lagstadgade tester.

Ett kännetecken för denna analys som bör noteras är att mutationshändelser bedöms på ett icke-mus-transgen. Men det finns gott om bevis för att transgenen reagerar på miljömutagener i ett liknande sätt till endogena gener 20. Dessutom, eftersom de exakta ursprunget oberoende mutationshändelser är svåra attlösa, är resultaten i allmänhet rapporteras som en mutant frekvens (i motsats till en mutationsfrekvens). Själva mutationsfrekvensen kan lösas om resultaten korrigeras för klonal expansion (dvs. Den division och multiplikation av ett enda muterad cell som kan bidra till den observerade frekvensen av transgena mutanter) genom DNA-sekvensering. Sekvensering av de muterade transgener kan utföras för att karakterisera de lacZ-mutationer, och identifiering av mutanter som kan vara härledda från klonal expansion händelser, även om detta ökar avsevärt till tiden och kostnaden för analysen. Förutom den lacZ-gen, härbärgerar theλgt10 transgen vektor en alternativ temperaturberoende mutation-reportergen: en variant av λ cll-genen, som är kortare (294 bp vs 3021 bp lacZ, figur 1) och lättare att sekvensera 29. Sekvense tillåter också analysen av den inducerade mutationsspektrum, som ger inblick i mutational mekanism av föreningen i fråga. Ett extremt exempel på klonal expansion är förekomsten av en "jackpot" mutation (dvs., Transgen mutationer vid ett mycket tidigt skede av ett organ utveckling som bidrar till en dramatiskt förhöjd MF, ibland hundratals till tusentals gånger större än bakgrunden). Djur eller vävnader med "jackpot" mutation bör tas bort från analysen.

Den analys som vi har beskrivit i stort sett tillämpas på andra TGR modeller som BigBlue mus och råtta, och lacZ plasmiden musen, som alla hyser liknande mutation reporter vektorer (granskas i 20). De allra flesta studier könsceller som hittills som använder liknande metoder har fokuserat nästan uteslutande på väl karakteriserade mutagener såsom ENU och strålning (över 30). Det förväntas att med den senaste utgåvan av testet OECD-för TGR-analysen, kommer denna analys attallt populärare för kemisk screening och reglerande utvärdering. Införlivandet av könsceller mutation assay TGR till ett lagstadgade tester batteri kommer att fylla den nuvarande luckan genom att tillåta en effektiv bedömning av mutations induktion i könsceller 11. Dessutom kan denna analys användas för att mäta MF i praktiskt taget alla vävnader, vilket ger ett lämpligt medel för att jämföra de relativa känsligheter somatiska celler och könsceller för induktion av mutationer av miljöfarliga ämnen vid identiska genetiska slutpunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MutaMouse Covance -
E. coli (lacZ-/galE-) Covance - See reference 25 in manuscript
Chloroform Caledon 3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) Gibco 14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 Sigma-Aldrich 03690 FLUKA
Isoamyl alcohol Caledon 2/10/7900
Lennon LB broth base Invitrogen 12780-029
Stainless steel mesh filter Sigma-Aldrich S3770
Transpack packaging extract Agilent Technologies 200220
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) Commercial Alcohols -
Ampicilin Gibco 11593-027 prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin Gibco 11815-024 prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol Invitrogen 15509-097 Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) Sigma-Aldrich P6501 dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K Invitrogen 25530-031 prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc) Fisher Scientific BP333-500 prepare 3 M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4390 prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
LB Broth 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC) 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 
SM Buffer 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284, (6), 696-704 (1999).
  2. Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1, (1), 40-47 (2000).
  3. Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320, (1), 19-23 (1989).
  4. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488, (7412), 471-475 (2012).
  5. Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151, (7), 1431-1442 (2012).
  6. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7, (4), 572-581 (2008).
  7. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75, (2), 112-129 (2005).
  8. Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53, (3), 166-172 (2012).
  9. Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
  10. Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
  11. Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51, (8-9), 919-928 (2010).
  12. Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13, (6), 517-522 (2000).
  13. Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41, (2), 111-120 (2003).
  14. Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (31), 12811-12814 (2011).
  15. Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500, (1-2), 147-156 (2002).
  16. Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598, (1-2), 61-72 (2006).
  17. Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44, (11), 1277-1281 (2012).
  18. Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750, (2), 96-106 (2012).
  19. Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25, (6), 609-616 (2010).
  20. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590, (1-3), 1-280 (2005).
  21. OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. (2011).
  22. Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17, (1-2), 77-80 (1983).
  23. Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122, (1), 25-36 (2004).
  24. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
  25. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20, (12), 3254 (1992).
  26. Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52, (9), 756-765 (2011).
  27. Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (16), 7485-7489 (1995).
  28. Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, (11), 3589-3591 (1982).
  29. Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34, (2-3), 201-207 (1999).
  30. Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598, (1-2), 164-193 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics