माउस मॉडल में अवर रग Cava क्षेपक भ्रष्टाचार के आरोपण

1Tissue Engineering Program and Surgical Research, Nationwide Children's Hospital, 2Department of Cardiothoracic Surgery, Nationwide Children's Hospital, 3Pediatric Surgery, Nationwide Children's Hospital
Medicine

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Summary

सेलुलर और आणविक neotissue गठन के हमारे ज्ञान में सुधार, TEVG के एक murine मॉडल हाल ही में विकसित किया गया था. grafts C57BL 6 / चूहों में अधोमूत्र पिंडीय रग क्षेपक grafts के रूप में प्रत्यारोपित किया गया. यह मॉडल हमारे चिकित्सीय जांच में हासिल की उन लोगों के लिए इसी तरह के परिणाम प्राप्त होता है, लेकिन अभी तक एक छोटा समय पाठ्यक्रम पर.

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Lee, Y. U., Yi, T., Tara, S., Lee, A. Y., Hibino, N., Shinoka, T., et al. Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model. J. Vis. Exp. (88), e51632, doi:10.3791/51632 (2014).

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Abstract

अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear (BMCs) के साथ वरीयता प्राप्त biodegradable scaffolds अक्सर जन्मजात हृदय विसंगतियों का इलाज करने के लिए पुनर्निर्माण सर्जरी के लिए उपयोग किया जाता है. लंबी अवधि के नैदानिक ​​परिणामों प्रकार का रोग की महत्वपूर्ण घटनाओं के साथ, तथापि, उत्कृष्ट प्रत्यक्षता दर दिखाया. संवहनी neotissue गठन के सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच और ऊतक इंजीनियर संवहनी grafts (TEVGs) में एक प्रकार का रोग के विकास को रोकने के लिए, हम लगभग 1 मिमी आंतरिक व्यास के साथ भ्रष्टाचार के एक माउस मॉडल विकसित किया है. सबसे पहले, TEVGs एक polyglycolic एसिड nonwoven से गढ़े biodegradable ट्यूबलर scaffolds से इकट्ठे हुए थे ε-caprolactone और एल Lactide copolymer के साथ लेपित जाल लगा. scaffolds तो, एक lyophilizer में रखा 24 घंटे के लिए vacuumed, और सेल बोने तक एक desiccator में संग्रहीत किया गया. दूसरा, अस्थि मज्जा दाता चूहों से एकत्र किया गया था और mononuclear कोशिकाओं घनत्व ढाल centrifugation द्वारा अलग थे. तीसरा, लगभग एक लाख कोशिकाओं थेएक पाड़ पर वरीयता प्राप्त और ओ / एन incubated अंत में, वरीयता प्राप्त scaffolds तो C57BL 6 / चूहों में अधोमूत्र पिंडीय रग क्षेपक grafts के रूप में प्रत्यारोपित किया गया. प्रत्यारोपित grafts thromboembolic जटिलताओं या एन्यूरिज़्म गठन के सबूत के बिना उत्कृष्ट प्रत्यक्षता (> 90%) का प्रदर्शन किया. इस murine मॉडल को समझने में सहायता और TEVG में neotissue गठन के सेलुलर और आणविक तंत्र बढ़ाता जाएगा.

Introduction

जन्मजात हृदय दोष संयुक्त राज्य अमेरिका में जीवित जन्मों के लगभग 8% प्रभावित करने वाले गंभीर स्थितियां हैं. जन्मजात हृदय दोष या 2.4 प्रति 1,000 जीवित जन्म के साथ उन शिशुओं का लगभग 25%, उनके जीवन 1 के पहले वर्ष में आक्रामक उपचार की आवश्यकता होती है. जन्मजात हृदय रोग के लिए सबसे प्रभावी उपचार पुनर्निर्माण सर्जरी है. दुर्भाग्य से, वर्तमान में उपलब्ध संवहनी conduits के उपयोग से उत्पन्न होने वाली जटिलताओं पश्चात रुग्णता और मृत्यु दर का सबसे महत्वपूर्ण कारण हैं.

इस समस्या का समाधान करने के लिए, हम नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए 2 पहले ऊतक इंजीनियर संवहनी grafts (TEVGs) विकसित की है. TEVGs ऑटोलॉगस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं mononuclear (BM-एमएनसी) के साथ वरीयता प्राप्त और जन्मजात हृदय शल्य चिकित्सा के लिए शिरापरक conduits के रूप में प्रत्यारोपित biodegradable पॉलिएस्टर ट्यूब से निर्माण किया गया. परिणाम अनुवर्ती 1-3 साल में उत्कृष्ट प्रत्यक्षता दर दिखाया, लेकिन एक प्रकार का रोग की महत्वपूर्ण घटनाओं के साथ 5,6 बनाया गया था. इस मॉडल में, TEVGs सफलतापूर्वक रहने वाले जहाजों में तब्दील और आकारिकी और देशी नसों के समारोह में दोनों में समान थे. एक बड़े पशु मॉडल का यह प्रयोग TEVGs की चिकित्सीय उपयोग सहायता प्राप्त महत्वपूर्ण है कि पूर्व नैदानिक ​​जानकारी प्रदान करने में एक अच्छा पहला कदम था. हालांकि, बड़े पशु मॉडल का उपयोग TEVGs में संवहनी neotissue गठन के सेलुलर और आणविक तंत्र की पूरी समझ के कारण प्रजातियों विशिष्ट आणविक उपकरणों की कमी के कारण संवहनी सेल phenotypes की आणविक लक्षण वर्णन में सीमाओं तक ही सीमित है. इन कमियों को दूर करने के लिए, TEVGs के एक murine मॉडल माउस आनुवंशिकी में तेजी से उन्नति और उनके व्यापक molecula की वजह से विकसित किया गया थाएक छोटा समय के पैमाने के अतिरिक्त लाभ के साथ आर विशेषता.

murine IVC क्षेपक मॉडल ईमानदारी से बड़े जानवरों और इंसानों में होता है कि neovessel गठन की प्रक्रिया recapitulated, लेकिन एक बहुत कम समय बेशक 6-9 से अधिक. इधर, biodegradable scaffolds का उपयोग छोटे पैमाने पर भ्रष्टाचार के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, बी.एम. बहुराष्ट्रीय कंपनी कटाई और अलगाव, पाड़ पर BM-बहुराष्ट्रीय कंपनी बोने, और एक murine मॉडल में भ्रष्टाचार आरोपण का वर्णन किया गया.

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. भ्रष्टाचार विनिर्माण

  1. एक धूआं हुड के तहत 2 मिलीलीटर dioxane में 100mg पी (ला / सीएल) जोड़कर ε-caprolactone और एल Lactide copolymer पी (ला / सीएल) समाधान करें. एक भंवर पर समाधान प्लेस और पूरी तरह से भंग करने के लिए 1-1.5 घंटे के लिए लगातार मिश्रण.
  2. इस बीच, (पीजीए) फ्रीजर से लगा polyglycolic एसिड की एक चादर को हटाने और कई 5 x 8 मिमी वर्गों में कटौती. इसके अलावा बस फिल्टर ऊपर एक 0.1-10 μl पिपेट की नोक काट दिया.
  3. एक pipet टिप के बाहर का अंत में एक 19 जी सुई (1.5 लंबाई) डालें और पीजीए सूक्ष्म संदंश का उपयोग कर सुई के आसपास लगा लपेटो.
  4. 19 जी सुई इसे सम्मिलित किया जाता है, जबकि ध्यान से, लुमेन एक कुंद 18 जी सुई का उपयोग करते हुए, समीपस्थ भाग से straighter है जहां pipet टिप के बाहर का अंत करने के लिए लगा धक्का.
  5. पिपेट40 μl पी (सीएल / ला) शीर्ष से पिपेट टिप में समाधान. पीजीए समाधान के साथ महसूस किया तर. फिर एक विंदुक निकालने की मशीन का उपयोग कर हवाई बुलबुले बाहर धक्का. यदि आवश्यक हो तो इस प्रक्रिया को दोहराएं.
  6. प्लेस एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में grafts और 20 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें. सुई का सिर नीचे की ओर का सामना करना सुनिश्चित करें.
  7. एक lyophilizer में ट्यूब स्थानांतरण और 24 घंटे के लिए वैक्यूम. Airflow है के लिए ट्यूब का ढक्कन खोलने के लिए सुनिश्चित करें.
  8. Grafts के बाहर ले जाओ और सुइयों से उन्हें हटा दें. एक ~ 5 मिमी अनुभाग छोड़ने भ्रष्टाचार के दोनों सिरों कट और उनके आकार बनाए रखने के लिए सुइयों पर उन्हें वापस डाल दिया. एक desiccator में grafts रखें.
  9. एक जैव सुरक्षा हुड हे / एन से पहले सेल बोने में पराबैंगनी प्रकाश के तहत पाड़ रखें.

2. अस्थि मज्जा mononuclear सेल कटाई और अलगाव

  1. Ketamine / xylazine अधिक मात्रा (ketamine, 200 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine, 20 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों euthanize.
  2. निकालें हड्डियों (femurs एक10 सीसी RPMI के साथ एक पेट्री डिश में 10 भ्रष्टाचार implantations और जगह के लिए 3 चूहों से डी tibias). 3 सीसी RPMI के साथ एक नया पेट्री डिश में एक 25 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग हड्डियों और फ्लश अस्थि मज्जा के दोनों सिरों काटें. एक 15 सीसी ट्यूब में अस्थि मज्जा और RPMI समाधान लीजिए और बीएम के शेष इकट्ठा करने के लिए अतिरिक्त 2 सीसी RPMI साथ पेट्री डिश धोने.
  3. नमूना (5-10 μl) ले लो और एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या. परिणाम रिकार्ड.
  4. एक 15 सीसी अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 सीसी Ficoll रखो और अस्थि मज्जा और RPMI समाधान जोड़ने. Ficoll साथ मिश्रण से रोकने के लिए बहुत धीरे समाधान जोड़ें.
  5. 24 डिग्री सेल्सियस पर "कोई ब्रेक" के साथ 30 मिनट के लिए 528 XG पर अपकेंद्रित्र
  6. ऊपरी गुलाबी परत निकालें. बहुराष्ट्रीय कंपनी परत है जो बीच स्पष्ट परत चित्रा 1, ले लीजिए, और पीबीएस 01:01 के साथ यह पतला.
  7. 24 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 528 XG पर पतला बहुराष्ट्रीय कंपनी समाधान अपकेंद्रित्र
  8. सतह पर तैरनेवाला और Di निकालेंवीणा 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ गोली.
  9. 24 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 528 XG पर गोली समाधान अपकेंद्रित्र
  10. सतह पर तैरनेवाला निकालें. RPMI (~ 200 μl) की उचित मात्रा के साथ गोली पतला.
  11. एक 5-10 μl नमूना ले लो और एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती. परिणाम रिकार्ड. एक बार और गिनती सेल दोहराएँ और औसत सेल संख्या की गणना.
  12. RPMI का उपयोग μl 1,000,000 cells/10 के लिए सेल एकाग्रता पतला.

3. सेल बोने

  1. 5 मिनट के लिए luminally 5 μl RPMI जोड़कर Prewet पाड़, तो RPMI हटा दें.
  2. पाड़ लुमेन के लिए कदम 2.12 से RPMI में 10 μl अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मोनो परमाणु कोशिकाओं जोड़ें और 10 मिनट कोशिकाओं पाड़ पर संलग्न करने की अनुमति देने के लिए के लिए प्रतीक्षा करें.
  3. 1 सेमी लंबाई के लिए एक 19 जी सुई कट और पाड़ के आकार रखने के लिए पाड़ के लुमेन में सुई डाल दिया. 24 अच्छी तरह से थाली में नमूना रखें. </ ली>
  4. अच्छी तरह से प्रत्येक को 1,000 μl RPMI जोड़ें और एक मशीन में ओ / एन सेते हैं.

4. भ्रष्टाचार आरोपण

  1. सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव: ठीक कैंची, 3x सूक्ष्म संदंश, 2x सूक्ष्म संवहनी clamps, 1x दबाना लागू करने संदंश, 1x सूक्ष्म सुई धारक, 1x वसंत कैंची, 1x प्रत्याकर्षक 1x.
  2. महिला 6-8 सप्ताह पुराने C57BL 6 / ऊतक इंजीनियर संवहनी भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. अपने पिंजरे से माउस निकालें और यह तौलना, तो एक ketamine / xylazine कॉकटेल (ketamine, 100 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine, 10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पेट के निचले सही चक्र में एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से anesthetize. Ketoprofen (5 मिलीग्राम / किलो, आईपी) एक पूर्व संज्ञाहरण एनाल्जेसिक के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  3. कहानी pinching द्वारा बेहोश करने की क्रिया के स्तर की जाँच करें, तो पेट हेयर क्लिप. बाँझ नेत्र मरहम के साथ आंखों चिकना, और एक पैड पर एक पृष्ठीय लेटना स्थिति में माउस जगह. Betadine और शराब पैड के साथ पेट कीटाणुरहित. सहएक बाँझ कपड़ा के साथ माउस देखें और केवल चीरा क्षेत्र का पर्दाफाश.
  4. Suprapubic क्षेत्र को xyphoid नीचे से एक midline laparotomy चीरा, और एक स्वयं को बनाए रखना retractor डालें. खारा सिक्त धुंध में आंतों लपेटें. दो टूक अधोमूत्र पिंडीय महाधमनी और रग को परिभाषित.
  5. समीपस्थ और महाधमनी और रग के बाहर दोनों पक्षों पर दो सूक्ष्म संवहनी clamps जगह तो दो टूक रग आड़ा काट रग से महाधमनी अलग. यदि आवश्यक हो, पतली सुई पर एक 10-0 monofilament टांके के साथ उदर महाधमनी शाखाओं ligate.
  6. एक बाँझ 10-0 सीवन का उपयोग anastomoses समाप्त करने के लिए समीपस्थ और बाहर का अंत के साथ एक अवर रग Cava क्षेपक भ्रष्टाचार प्रत्यारोपण. माउस की शारीरिक रचना पर निर्भर भ्रष्टाचार, आम तौर पर 1-2 मिमी, ट्रिम. प्रॉक्सिमल और बाहर दोनों सिरों पर एक सिलाई के साथ भ्रष्टाचार को सुरक्षित और भ्रष्टाचार के दूसरी तरफ से 4-5 stiches साथ लगातार सिवनी लगते हैं. सामने की ओर पूरा करने के बाद, clamps और grafts फ्लिपदूसरी तरफ और भ्रष्टाचार के पीछे की ओर सीवन. आरोपण के दौरान, तीव्र घनास्त्रता को रोकने के लिए अक्सर हेपरिन समाधान के साथ भ्रष्टाचार के फ्लश.
  7. समीपस्थ दबाना निकालें और एक सामयिक absorbable बाँझ hemostat एजेंट लगाने से नकसीर नियंत्रित करते हैं. नकसीर पूरी तरह से बंद हो जाता है, बाहर का दबाना हटाने और नकसीर उसी तरह नियंत्रित करते हैं. भ्रष्टाचार के माध्यम से सुनिश्चित करें कि रक्त प्रवाह सुनिश्चित करें.
  8. शामिल पिरोया सुई के साथ एक 6-0 काली पॉलियामाइड monofilament सीवन का उपयोग कर दो परतों में पेट की मांसलता और त्वचा को बंद करें.
  9. 0.5 मिलीलीटर खारा subcutaneously इंजेक्षन और माउस को पूरी तरह से मोबाइल है जब तक एक वार्मिंग पैड पर एक वसूली पिंजरे में माउस जगह. वसूली करने पर, कागज बिस्तर के साथ एक नए पिंजरे के लिए माउस वापसी. 48 घंटे के लिए दर्द की दवा (ब्रुफेन 30 मिलीग्राम / किग्रा, पीने के पानी) दीजिए.

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Representative Results

TEVG आरोपण का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है. अस्थि मज्जा एक दाता माउस से काटा गया था और मोनो परमाणु कोशिकाओं घनत्व centrifugation का उपयोग अलग थे और उसके बाद एक biodegradable पाड़ पर वरीयता प्राप्त. वरीयता प्राप्त scaffolds हे / एन incubated और एक अवर रग Cava क्षेपक भ्रष्टाचार के रूप में एक प्राप्तकर्ता माउस को प्रत्यारोपित किया गया.

चित्रा 2 पीजीए पी (सीएल / ला) पाड़ की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दिखाता है. आंतरिक व्यास लगभग 1 मिमी था और दीवार मोटाई लगभग 0.17 मिमी था. कुल porosity 78.5% था और ध्यान में लीन होना आकार 45.4 ± 17.6 माइक्रोन थे मतलब.

C57BL 6 / चूहों की IVC में interposed एक TEVG के सकल छवि आरोपण (ए) और आरोपण (बी) के बाद 2 सप्ताह के बाद चित्रा 3. अधिकार में दिखाया गया है. (सी) की तुलना में एक देशी IVC के सकल छवि को दर्शाता है. यह स्पष्ट है किभ्रष्टाचार neotissue से भर गया था, हालांकि, यह अभी भी मूल भ्रष्टाचार की आकृति रखा. हमारे पिछले परिणाम कुल भ्रष्टाचार गिरावट 12 सप्ताह 10 तक लग जाते हैं कि पता चला है.

TEVG प्रत्यारोपित एक 2 सप्ताह की अल्ट्रासाउंड बी मोड और रंग डॉपलर छवि प्रत्यारोपित grafts के प्रत्यक्षता दिखाने के लिए 4 ए बी रु. एक देशी IVC छवि तुलना (चित्रा 4, सी) के लिए जोड़ा गया है. सेल बोने काफी भ्रष्टाचार की प्रत्यक्षता में सुधार, गैरवरीय और वरीयता प्राप्त grafts के लिए 2 सप्ताह में patencies क्रमश: 65% और 91%, (पी <0.05, फिशर सटीक परीक्षण) कर रहे हैं.

चित्रा 5 आरोपण के 2 हफ्तों के बाद सेल घुसपैठ और TEVG में बाह्य मैट्रिक्स बयान से पता चलता है. एच एंड ई धुंधला के साथ दाग explanted grafts पाड़ सामग्री (ए) के भ्रष्टाचार और शेष भर neotissue गठन दिखाया. Harts और मैसन का trichrome दाग में में elastin के बयान से पता चलाtimal परत (बी) और औसत दर्जे का परत (सी) में कोलेजन. Endothelial सेल अस्तर intimal परत (डी) भर में मनाया जाता है और क्रमश: CD31 और αSMA धुंधला द्वारा दिखाया के रूप में मिला हुआ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को विशेष रूप से अस्तर चुनाव आयोग (ई) के नीचे, TEVG भर में मौजूद थे. F4/80 धुंधला (एफ) के साथ संकेत के रूप में आरोपण के बाद दूसरे सप्ताह तक, बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ, स्पष्ट किया गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. TEVG आरोपण के योजनाबद्ध. अस्थि मज्जा मोनो परमाणु कोशिकाओं, एक दाता माउस से काटा एक biodegradable पाड़ पर वरीयता प्राप्त है, और फिर एक प्राप्तकर्ता माउस के लिए एक IVC क्षेपक भ्रष्टाचार के रूप में प्रत्यारोपित किया गया.

पतली पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 2
एक पाड़ की चित्रा 2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों. औसत बाहरी व्यास luminal व्यास 1.1 मिमी था, 1.45 मिमी था, और लंबाई 3 मिमी था.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रत्यारोपित TEVG 2 सप्ताह और देशी IVC के बाद. ए) तुरंत आरोपण के बाद, तुलना के लिए बी) 2 हफ्तों के आरोपण के बाद, और सी) देशी IVC.

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चित्रा 4. अल्ट्रासाउंड छवियों 2 सप्ताह और देशी IVC. तुलना के लिए 2 सप्ताह. सी) निवासी IVC के बाद TEVG की ए) बी मोड और बी) रंग डॉपलर छवि.

चित्रा 5
2 सप्ताह की चित्रा 5. प्रतिनिधि छवियों ऑपरेटिव TEVG पोस्ट. ए) एच एंड ई (भीतरी लुमेन), बी) Harts (गुलाबी = इलास्टिन), सी) massion के trichrome (नीला = कोलेजन), डी) CD31 (ब्राउन = endothelial सेल), ई) αSMA (ब्राउन = चिकनी पेशी सेल), और एफ ) F4/80 (ब्राउन = बृहतभक्षककोशिका).

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Discussion

TEVG के माउस मॉडल neotissue गठन और एक प्रकार का रोग के विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. वरीयता प्राप्त बी.एम. एमएनसी भ्रष्टाचार 11 पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के दोनों ऊतकीय और SEM चित्र में दिखाया गया था. सेल बोने दक्षता भी एक डीएनए परख 7 का उपयोग कर दिखाया गया था. इस मॉडल प्रणाली का उपयोग हम सेल बोने हमारे मानव नैदानिक ​​परीक्षण 3 में विफलता के प्राथमिक मोड था जो TEVG एक प्रकार का रोग के विकास की घटनाओं को कम कर देता है कि पता चला है. वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के तेजी से वे एक paracrine तंत्र 8,12 के माध्यम से अपने प्रभाव डालती है, सुझाव है कि TEVG से गायब हो गया. यह भी neovessel गठन एक प्रतिरक्षा की मध्यस्थता पुनर्योजी प्रक्रिया है, और neovessel पाड़ की luminal सतह के साथ पड़ोसी पोत दीवार से नाड़ी कोशिकाओं (ईसी और एसएमसी) की अंतर्वृद्धि से उठता है कि कि दिखाया गया था. इसके अलावा, सामान्य बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ, संवहनी neotissue गठन के लिए आवश्यक हैइस प्रक्रिया से अत्यधिक है लेकिन जब यह TEVG प्रकार का रोग 7,8 का विकास होता है. इन परिणामों से मानव रोग के लिए इस माउस मॉडल की प्रासंगिकता दिखा. microsurgical तकनीक धमनी grafts 13 और शिरापरक फिस्टुला के लिए धमनी सहित अन्य संवहनी आवेदन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

हम हर साल 1,000 IVC क्षेपक भ्रष्टाचार implantations से अधिक काम करते हैं और मृत्यु दर 1% से कम है. एक सफल भ्रष्टाचार आरोपण के लिए, का उल्लेख करने के लिए कई महत्वपूर्ण बातें हैं.

यह सम्मिलन के दौरान कई बार के आसपास माउस बारी करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि सबसे पहले, इंजेक्शन संज्ञाहरण इस कार्रवाई के लिए पसंद किया जाता है. संज्ञाहरण के प्रभाव आमतौर पर एक घंटे के आसपास रहता है और एक कुशल माइक्रो सर्जन के लिए पूरे सर्जरी समय सर्जरी को पूरा करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है, जो लगभग 30-45 मिनट है. पशु शल्य चिकित्सा के दौरान जाग हो, तो एक संज्ञाहरण कॉकटेल के 0.05-0.1 मिलीलीटर intramus इंजेक्शन जा सकता हैcularly.

दूसरा, छोटे महाधमनी शाखाओं के सबसे IVC और पेट क्षेत्र से महाधमनी को अलग करते हुए अतिरिक्त खून की कमी को रोकने के लिए ligated होने की जरूरत है. इसके अलावा यह महाधमनी से अलग है जब IVC घायल नहीं ध्यान में रखना है.

भ्रष्टाचार sutured किया गया था जब तीसरा, दोनों पक्षों पर पहले दो टांके पूरी प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. वे ध्यान नहीं रखा जाता है, यह IVC के आगे और पीछे की परतों को अलग करना मुश्किल है. परतों स्पष्ट रूप से पहचान नहीं कर रहे हैं, गलती से उन्हें एक साथ सीवन एक उच्च मौका है. भ्रष्टाचार को IVC suturing जबकि, इस पर फाड़ पैदा कर सकता है जो IVC, फैलाने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. इसके अलावा भ्रष्टाचार के एक ही लंबाई को बदलने के लिए बहुत ज्यादा IVC नाश करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें. आमतौर पर IVC के लगभग 1 से 2 मिमी कारण IVC के अनुदैर्ध्य तनाव के लिए एक 3 से 5 मिमी भ्रष्टाचार को बदलने के लिए हटा दिया गया था. IVC का एक ही लंबाई निकाल दिया जाता है, तो यह anasto बनाता हैMOSIS बेहद चुनौतीपूर्ण है.

चौथा, TEVG गठन और एक प्रकार का रोग के विकास के संबंध में विविधताओं तनाव महत्वपूर्ण तनाव रहे हैं. उदाहरण के लिए, गैरवरीय C57BL 6 / चूहों (जंगली प्रकार) SCID / बीजी चूहों की तुलना में एक प्रकार का रोग का एक बहुत उच्च दर (immunodeficient चूहों) 8,12 दिखाया. इसके अलावा, हमारे अनुभव से, SCID / बीजी चूहों की वजह से अपनी stiffer IVC दीवार से 14 C57BL 6 / चूहों की तुलना में संचालित करने के लिए आसान कर रहे हैं. चूहों की एक नई नस्ल के संचालन पर जब मन में रखें कि.

भ्रष्टाचार विनिर्माण, बी.एम. बहुराष्ट्रीय कंपनी कटाई, और सेल बोने प्रक्रियाओं के जानकार होने के लिए प्रक्रियाओं का केवल एक जोड़े हैं, सीधे आगे रहे हैं. पहला, भ्रष्टाचार के निर्माण के लिए, यह नहीं 18 जी कुंद सुई का उपयोग कर इसे धक्का जबकि लगा 'गुच्छा' के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हम नीचे pipet सुझावों के बाहर का अंत करने के लिए महसूस करने के लिए धक्का विभिन्न तरीकों की कोशिश की है. एक कुंद सुई के साथ भ्रष्टाचार धक्का दूर से, सबसे अच्छा परिणाम दिखाया. आंतरिककुंद सुई का व्यास लगा चारों ओर लपेटा जाता है कि सुई के बाहरी व्यास की तुलना में थोड़ा बड़ा है. इसलिए, छोटे सुई snugly बड़ा कुंद सुई में स्लाइड कर सकते हैं और महसूस किया बाद में सब महसूस की गुच्छन को रोकता है जो महसूस किया है, की परिधि के चारों ओर बल के बराबर राशि के साथ नीचे धकेल दिया जा सकता है. हम पहले से bunched grafts के 2 सप्ताह में कम प्रत्यक्षता से पता चला है कि मनाया. बुलबुले पाड़ सतह और रक्त पर छेद आरोपण के बाद छेद के माध्यम से लीक करेंगे कारण होगा, क्योंकि इसके अलावा, यह सभी बुलबुले को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. हड्डियों बी.एम. बहुराष्ट्रीय कंपनी एकत्रित करने के लिए अलग हो रहे हैं जब दूसरा, वे बहुत अधिक मांसपेशियों या बालों शामिल नहीं हैं तो हड्डी जितना संभव हो साफ करने के लिए सुनिश्चित करें. यदि आवश्यक हो, यह घनत्व centrifugation प्रक्रिया से पहले एक ऊतक झरनी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.

TEVG का यह मॉडल एक कम दबाव और उच्च प्रवाह प्रणाली है जो शिरापरक परिसंचरण, पर अच्छी तरह से काम किया. हालांकि, धमनी संचलन में, एकउच्च रक्तचाप और उच्च प्रवाह प्रणाली, हम अपनी तेजी से गिरावट विशेषता के कारण पीजीए grafts के साथ संबंध विच्छेद की उच्च दर मनाया. जो neotissue धमनी दबाव का विरोध करने के लिए पर्याप्त शक्ति लाभ से पहले भ्रष्टाचार इसकी संरचनात्मक ताकत खो देता है इसका मतलब है. हम polylactic एसिड (पीएलए) पहले से grafts इस्तेमाल किया, लेकिन धमनीविस्फार गठन की उच्च व्यापकता से पता चला है. इसके अलावा यह पूरी तरह से चूहों की जीवन अवधि की तुलना में अधिक है जो इन विवो में पीएलए नीचा करने के लिए अधिक से अधिक 2 साल लग जाते हैं. धमनी संचलन भ्रष्टाचार उत्पादन तकनीक में एक भविष्य आवेदन के लिए, उदाहरण के लिए, एक electrospun भ्रष्टाचार विकास के अंतर्गत वर्तमान में है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस काम CKB लिए एनआईएच (RO1 HL098228) से अनुदान द्वारा, भाग में, का समर्थन किया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyglycolic acid (PGA) felt Biomedical Structures Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl  Fisher Sientific 02-707-456
Lyophilizer  Labconco 7070020
RPMI medium 1604 Gibco 11875-093
Petri dish BD 353003
24-well plate Corning 3526
15 cc tube  BD 352096
Ficoll Sigma 10831-100ml Also called 'Histopaque'
DPBS Gibco 14190-144
Littauer bone cutter 4.5" Straight Roboz RS-8480 For BM harvesting
Forceps 4.5" Roboz RS-8120 For BM harvesting
Scissors 4.5" Roboz RS-5912 For BM harvesting
Microscope Leica M80
C57BL/6J (H-2b), Female Jackson Laboratories 664 8-12 weeks
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
Xylazine sterile solution Akorn Inc. NADA# 139-236
Ketoprofen Fort Dodge Animal Health NDC 0856-4396-01
Ibuprofen PrecisionDose NDC 68094-494-59
Heparin sodium Sagent Pharmaceticals NDC 25021-400
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) Hospira Inc. NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10
Petrolatum ophthalmic ointment Dechra Veterinary Products NDC 17033-211-38
Iodine prep pads Triad Disposables, Inc. NDC 50730-3201-1
Alcohol prep pads McKesson Corp. NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators Fisher Scientific 23-400-118
Fine scissor FST 14028-10
Micro-adson forcep FST 11018-12
Clamp applying forcep FST 00072-14
S&T Vascular clamp FST 00396-01
Spring scissors FST 15008-08
Colibri retractors FST 17000-04
Dumont #5 forcep FST 11251-20
Dumont #7 - fine forceps FST 11274-20
Dumont #5/45 forceps FST 11251-35
Tish needle holder/forceps Micrins MI1540
Black polyamide monofilament suture, 10-0 AROSurgical Instruments Corporation TI638402 For suturing the graft
Black polyamide monofilament suture, 6-0 AROSurgical Instruments SN-1956 For musculature and skin closure
Non-woven sponges McKesson Corp. 94442000
Absorbable hemostat Ethicon 1961
1 ml Syringe BD 309659
3 ml Syringe BD 309657
10 ml Syringe BD 309604
18 G 1.5 in, Needle BD 305190
25 G 1 in, Needle BD 305125
30 G 1 in, Needle BD 305106
Warm water recirculator Gaymar TP-700
Warming pad Gaymar TP-22G
Trimmer Wahl 9854-500

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References

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