Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P

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Summary

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizienten (P f) der Zellen können helfen zu verstehen, die Regulationsmechanismen der Aquaporine (AQPs). P f die Bestimmung der sphärischen Pflanzenzellprotoplasten Protoplasten umfasst hier dargestellten Isolierung und numerische Analyse der anfänglichen Rate der Volumenänderung als Folge eines osmotischen Herausforderung bei konstanter Badperfusion.

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Shatil-Cohen, A., Sibony, H., Draye, X., Chaumont, F., Moran, N., Moshelion, M. Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example. J. Vis. Exp. (92), e51652, doi:10.3791/51652 (2014).

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Abstract

Studium AQP Regulationsmechanismen ist entscheidend für das Verständnis der Wasser Beziehungen sowohl auf der zellulären und der gesamten Anlage Ebenen. Dargestellt ist hier die einfache und sehr effiziente Methode zur Bestimmung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizienten (P f) in Pflanzenprotoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen wie Frosch-Oozyten. Der erste Schritt des Assays ist die Isolierung von Protoplasten aus dem Pflanzengewebe von Interesse durch enzymatischen Verdau in eine Kammer mit einer geeigneten isotonischen Lösung. Der zweite Schritt besteht aus einem osmotischen Herausforderung Assay: Protoplasten am Boden der Kammer immobilisiert sind, um eine konstante Ausgangs Perfusion durch einen hypotonischen Lösung vorlegt, mit einer isotonischen Lösung und gefolgt. Die Zellschwellung ist Video aufgezeichnet. Im dritten Schritt werden die Bilder offline verarbeitet, um Volumenänderungen zu erhalten, und der Zeitverlauf der Volumenänderungen mit dem Zeitverlauf der Änderung in osmola korreliertheit der Kammer Perfusionsmedium mit einem Kurvenanpassungsverfahren in Matlab (die 'PfFit') geschrieben, um P f ergeben.

Introduction

Wasseraufnahme und Fluss durch Zellmembranen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Pflanzen Existenz sowohl auf zellulärer und die ganze Pflanze Ebenen. Auf zellulärer Ebene, Aquaporine (AQPs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des osmotischen Wasserdurchlässigkeitskoeffizient (P f) der Zellmembran 1-3.

Bisher wurden mehrere Verfahren zur Messung der endogenen P f Protoplasten aus verschiedenen Pflanzenorganen verwendet worden (dh Wurzeln, Mesophyll endodermis usw. Durch Chaumont et al. 4 Bewertung). Einer der Ansätze zur P f zu messen, um die Protoplasten zu einer osmotischen Herausforderung freizulegen und um die anfängliche Rate der Volumenänderung zu überwachen (dh., Die Steigung der linearen Phasen Anfang der Volumenänderung). Zwei verschiedene Verfahren wurden bisher für die dieser Ansatz beschrieben, die beide auf einer momentanen Austausch von Lösungen. Die erste besteht aus immobilizing Protoplasten mit einem Sog Mikropipette und Umschalten der Lösungsstrom 5 und dem zweiten der Übertragung der Protoplasten von einer Lösung zur anderen mit einer Mikropipette 6. Diese Mikropipette Saug-und Mikropipette Übertragung Methoden, die Bildaufnahme ganz am Anfang der schnellen Lösung Austausch zu ermöglichen (die frühe Phase der linearen Volumenänderung zu erfassen), wahrscheinlich beinhalten eine körperliche Belastung zu Protoplasten und erfordern spezielle Ausrüstung und Experten der Mikromanipulation.

Das hier beschriebene Verfahren minimiert die Störung der Zellen, schließt keine Mikromanipulation und ermöglicht die Ableitung von P f, wenn die Badperfusion nicht augenblicklich.

Nach der enzymatischen Verdauung, die Protoplasten in einer isotonischen Lösung eingetaucht ist, sind auf dem Deckglas Boden einer Plexiglas (aka Lucite oder Plexiglas) Kammer, die durch Ladungs-Wechselwirkung immobilisiert. Dann wird während einer konstanten Badperfusion,die isotonische Lösung entfernt von einer hypotonischen Lösung Erzeugung eines hypoosmotischen Herausforderung für die Protoplasten gespült. Die Quellung des Protoplasten ist Video aufgezeichnet und dann durch Kombinieren der Informationen über den Zeitverlauf der Badperfusion und der Zeitverlauf der Zellschwellung, die P f wird durch die Bildverarbeitung und Kurvenanpassungsverfahren bestimmt.

Die Vorteile dieses Verfahrens sind, dass das Experiment ist sehr effizient, das heißt es ist möglich, einige Zellen gleichzeitig in einem einzigen Assay zu überwachen, und dass es keine spezielle Ausrüstung oder insbesondere Mikromanipulationsfähigkeiten erfordern. Mehrere Anwendungen für diese Methode sind möglich. B. Bestimmung der nativen P f eine Vielzahl von Zellen aus verschiedenen Geweben und Pflanzen, wie Mesophyll und Bündelscheidenzellen aus Arabidopsis Blatt 7, Maisblatt Mesophyllzellen oder Wurzelcortexzellen 8-10 oder Suspensionskulturzellen 11,12. In Additiauf, ist es möglich, P f des sphärischen Tierzellen wie Eizellen Zellen 11 zu bestimmen. Ein weiteres Beispiel ist der Prüfung AQP-Aktivität durch transiente Expression ihrer Gens in den Protoplasten (oder andere Gene, die sie beeinflussen können, zB Gene von Kinasen) und Bestimmung von deren Beitrag zur P f; beispielsweise die Expression von Tomaten AQP SlTIP2, 2 in Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten durch PEG-Transformation und die Entschlossenheit der SlTIP2, 2 bezogenen P f 13. Schließlich Prüfung der Wirkung auf P f verschiedener Moleküle / Substanzen (Medikamente, Hormone, etc.) zugegeben, um die Lösungen können ebenfalls untersucht werden, zum Beispiel der AQP Blocker HgCl 2 7.

Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung von Protoplasten von Arabidopsis Mesophyllzellen und die Bestimmung ihrer P f.

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Protocol

1. Herstellung der Lösungen

  1. Vorbereitung isotonischen (600 mOsm) und hypotonische (500 mOsm)-Lösungen, enthaltend 10 mM KCl, 1 mM CaCl 2, und 8 M 2 (N-Morpholin) -ethanesulphonic (MES), pH 5,7, und stellen die Osmolarität mit den entsprechenden Mengen an D-Sorbit: 540 mm für die isotonische und 440 mm für die hypotonischen Lösung. Überprüfen Sie, ob die Osmolarität der Lösung (im Umkreis von 3% des Zielwertes) mit einem Osmometer.
  2. Bereiten Sie ein trockenes Lager der "enzymatischen Mix", die die folgenden Enzyme: 0,55 g Cellulase, 0,1 g Pectolyase, 0,33 g Polyvinylpyrrolidon K 30, 0,33 g BSA (siehe Tabelle 1 unten), mischen Sie die trockenen Pulver durch Wirbel, machen 5,7 mg Aliquots und Lagerung bei -20 ° C.

2. Isolierung von Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten

  1. Bereiten Sie eine Petrischale (10 cm) mit etwa 6 Tropfen (ca.. Jeweils 30 ul) isotonischer Lösung.
  2. Schälen Sie die abaxial (unteren) Arabidopsis Blattoberhaut, cut die geschälte Blatt in Quadrate von etwa 4 x 4 mm 2, dann legen Sie die Quadrate auf der isotonischen Lösung fällt mit der freigelegten abaxial Seite nach unten, berühren Sie die Lösung.
  3. Auflösen 5,7 mg des Enzym-Mix in 165 ul isotonische Lösung (3,3% w / w) in einem 1,5-ml-Röhrchen, vorsichtig mischen für eine Minute oder so, bis sie gelöst, und platzieren Sie mehrere ähnliche Tropfen der Enzymlösung in der gleichen Petri Gericht.
  4. Übertragen Sie die Blattstücke auf die enzymatische Lösung Tropfen, schließen Sie das Gericht Abdichtung der Deckel mit einer Runde der Parafilm und Inkubation für 20 min, schwimmend das Gericht in einem Wasserbad auf 28 ° C eingestellt.
  5. Fügen Sie noch einige Tropfen der isotonischen Lösung in die Schale (2 Tropfen pro jeder Enzymlösung Drop). Übertragen jedes Blattstück mit einem neuen isotonischen Lösung tropfen, dann sequentiell auf einen zweiten Tropfen (um die Enzymlösung abzuwaschen). Heben Sie das Stück am Rand mit einer Pinzette, schütteln Sie sie in der zweiten Tropfen (wie ein Teebeutel), um die Protoplasten freizugeben.Sammeln Sie die Tropfen mit der Protoplasten (unter Verwendung eines abgeschnitten aus 100 ul Pipettenspitze) in ein 1,5-ml-Tube.

3. Die Herausforderung Hypotone Assay: Arabidopsis Mesophyll Zellschwellung

  1. Vorbereitung Perfusionssystem (1A) durch Füllen einer Säule mit dem isotonischen Lösung und einer anderen Spalte mit der hypotonischen Lösung. Das Ventil zu öffnen, lassen einige Lösungsstrom (der ersten hypotonischen, wird die isotonische), um das Rohr ganz nach unten in die Einlassverteiler (1B) zu füllen. Sicherzustellen, dass keine Luftbläschen, und schließen Sie das Ventil.
  2. Siegel ein Deckglas mit Silikonfett (Tabelle 1), um einen Boden für die Kammer innerhalb des Plexiglas Schiebe machen (Abbildung 1B, siehe auch die Schaltpläne der Kammer in 1C). Um den Kammerboden (die nach oben weisenden freigelegten Oberfläche des Deckglases in der Fettring) machen "sticky" für Protoplasten, beschichtenmit positiver Ladung tragenden Protaminsulfat (1% in Wasser; Tabelle 1) oder Poly-L-Lysin (0,1% in Wasser; Tabelle 1). Verbreiten Sie diesen "Leim" über das Deckglas mit einer Pipettenspitze, warten mit 1 - 2 min, spülen Sie 3 - 4 mal mit der isotonischen Lösung und schütteln sich die verbleibende Lösung.
  3. Füllen Sie die Kammer mit der isotonischen Lösung. Dann fügen Sie einen Tropfen von Protoplasten haltige Lösung in die Kammer, mit einer Pipettenspitze abgeschnitten ist, und warten Sie 3 - 4 min für die Protoplasten zu begleichen. Decken Sie die Kammer mit einer transparenten Abdeckung (1D, 1E) Berühren der Oberfläche der Lösung (Vermeidung von Luftblasen unter).
  4. Legen Sie den Schieber (vorsichtig!) Auf einem inversen Mikroskop Tisch, verbinden Sie es mit der Durchblutung System und die Pumpe (Schutz vor Luftblasen im Schlauch!) Und schalten Sie den isotonischen Lösung für konstante Durchflussdurchblutung bei 1 ml / min (schneller Raten kann verwendet werden, bis zu 4 ml / min).
  5. Für die AufnahmeVolumenänderungen wird ein invertiertes Mikroskop, mit einem 20x-Objektiv und ein CCD-Videokamera mit einem PC-Computer verbunden ist. Verwenden Sie die 'CMU 1394 Camera Driver "-Plugin des ImageJ-Software (siehe Tabelle mit den spezifischen Materialien für die Download-Adressen dieser beiden Software-Stücke), um einen 60 Sekunden-Video-Film von ausgewählten unbeweglich Protoplasten aufzeichnen (vermutlich jener, die mit dem Boden fest) bei einer Rate von 1 Bild / s (1 Hz). Start der Aufzeichnung mit einer 15 sec Waschen der isotonischen Lösung (dies bildet den Ausgangswert), um die hypotonischen Lösung für 45 sec Schalter (auf insgesamt 60 Sekunden vom Beginn der Perfusion zu vervollständigen). Speichern Sie den Film im TIF-Format. HINWEIS: Wählen Sie ein Feld mit Blick auf so viele Zellen wie möglich, die folgende Kriterien erfüllen: kugelförmig und mit einem gut fokussierten Zellkontur an ihren größten Umfang (Abbildung 2a).

4. Analyse der Zellvolumenänderung mit ImageJ

Hinweis: Um die AnalyseSerie von Bildern von einem Quellzelle, verwenden Sie den "Image Explorer" und "Protoplasten Analyzer 'plugins in der ImageJ-Software (von Xavier Draye geschrieben) 14. Ausgehend von den gewählten Protoplasten an ihrem ersten Zeitpunkt wird die "Protoplasten Analyzer 'Plugin erkennt automatisch die Protoplasten Kanten (Konturen) und berechnen den Zeitverlauf ihrer Flächen während des Versuchs (die Plugins sind mit dem PfFit Analyseprogramm, unten) .

  1. Starten Sie ImageJ. Um den Film zu öffnen, klicken Sie auf "Datei" auf der ImageJ-Panel, dann nacheinander auf den Dropdown-Menüs, wie sie sich entfalten: "Import" und dann "Image Explorer. Markieren Sie den ausgewählten Film, dann mit der rechten Maustaste darauf klicken, dann links klicken auf "Protoplasten Analyzer". Stöbern Sie in den Film (mit einem Schieberegler an der Protoplasten Bild unten), um Protoplasten, die während des Experiments weitgehend unbeweglich bleiben identifizieren - diese werden analysiert werden. Zurück auf der ersten image, mit der Maus, ziehen Kreise (aus den ImageJ Zeichenwerkzeuge aufgenommen) um die ausgewählten Protoplasten (2B), dann klicken Sie in der Tabelle der "Nachweis Parameter ', die erschien' OK '.
  2. Um die Protoplastenerkennungsalgorithmus zu starten, klicken Sie auf 'Local' auf der Protoplasten Bild oben Panel, dann "Prozess" im Dropdown-Menü. Untersuchen Sie die grüne Kreise um die ausgewählten Protoplasten (Abbildung 2C) während des Films. Speichern Sie das 'Ergebnis' in einer Excel-Datei. Beenden Sie ImageJ. HINWEIS: Im Falle erscheint ein roter Punkt (eine schlechte Passform Kontur zeigen - in der Regel aufgrund einer schlechten Bildkontrast), erneut mit anderen Parametern.
  3. Um die zu jeder Zelle gehörenden Linien zu trennen (- wenn zwei oder mehr Zellen wurden gleichzeitig analysiert - was wird miteinander verflochten werden, da die Analyse Frame für Frame), in Excel, sortieren Sie die gespeicherten Daten von der Zellzahl-Säule ("Objekt" ).
  4. Nach Determine die Pixel-zu-um-Umrechnungsfaktor für den Erhalt der Realwert der P f, Snap ein Bild von einem Mikrometer Herrscher über die gleiche 20X Mikroskop-Objektiv. Ziehen Sie eine Linie (aus den Zeichenwerkzeugen ImageJ abgeholt) entlang der Bild Lineal und lesen Sie die Pixelzahl entspricht der Herrscher Länge an der Unterseite des ImageJ Hauptfeld. Konvertieren Sie die beliebige Pixelbereich Werte in der Excel-Datei in um 2. Speichern Sie die Bereiche Zeitverlauf (für jede Zelle separat) als Textdatei (zwei Spalten mit Zahlen). ANMERKUNG: Dies wird als Eingang zu dem Volumen schlüssige 'PfFit "Programm sein.

5. Modellierung der Währungs Osmolarität Wechsel in der Versuchskammer mit ImageJ und der MATLAB-Programm P f Fit

  1. Add 2 mg Xylencyanol (Tabelle 1, unten), um 100 ml der isotonischen Lösung (die "Indikatorfarbstoff 'zu erzeugen).
  2. Bereiten Sie die Perfusion System (wie in 3.1) mit der Indikatorfarbstoff und der nicht gefärbt hypotonic Lösung.
  3. Siegel ein Deckglas mit Silikonfett auf den Boden der Kammer Plexiglas, dann vorsichtig die Kammer mit der Indikatorfarbstoff zu füllen, bedecken Sie es mit einem Deckglas (wie bei den Protoplasten vor) und legen Sie es auf den Mikroskoptisch.
  4. Schließen Sie die Kammer mit dem Perfusionssystem und der Pumpe, und schalten Sie den Indikatorfarbstoff Fluss für eine konstante Durchblutung bei l ml / min.
  5. Nehmen Sie einen 60 Sekunden-Film mit einer Rate von 1 Hz. Starten Sie die Aufnahme mit 15 Sekunden der Indikatorfarbstoff, wechseln Sie in die hypotone Lösung für 45 Sekunden. Dreharbeiten zu stoppen. Bündig mit der Indikatorfarbstoff (mindestens 30 Sekunden), und starten Sie einen neuen Film. Wiederholen etwa 5 - 6 mal, und speichern Sie alle Filme
  6. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Videobilder von der Indikatorfarbstoff Lässigkeit zu analysieren, um einen gemittelten Zeitverlauf der Veränderung Lässigkeit zu erhalten.
    1. Starten Sie ImageJ, klicken Sie auf "Datei", dann auf "Öffnen", und suchen Sie nach dem Film. Für jeden Film, ziehe eine 10 Pixel breite vertikaleRechteck überall auf dem 1. Bild des Films. Klicken Sie auf "Bild" auf der ImageJ Hauptfeld, und klicken Sie auf 'Crop' im Dropdown-Menü.
    2. Um die 60 Bilder (von der 60 Sekunden-Film) in einer Reihe ausgerichtet, klicken Sie erneut auf 'Bild', dann klicken Sie nacheinander in den Dropdown-Menüs, wie sie sich entfalten: "Stacks" und "Make Montage" (Spalten 60, Reihe 1). Zeichnen Sie ein 1 Pixel hohe horizontale Rechteck überall entlang der ganzen Reihe von Bildern und klicken Sie auf "Analysieren" in der ImageJ Hauptfeld, dann klicken Sie auf "Grundstück Profil" im Dropdown-Menü. HINWEIS: Ein 'Plot der Montage "-Fenster erscheint (nicht gezeigt), und eine Liste der Transmissionsdaten von seinem Menü geöffnet werden. Jedes Bild des Films wird in dieser Liste von 10 Transmissionswerte mit Ursprung in seinem 10 Pixel breiten Rechteck und damit die "Zeitbasis" vertreten (das Bild fortlaufende Nummer) ist 10-mal länger.
    3. Kopieren Sie die Listen der Durchlässigkeit datein (eine Liste pro Film) in eine Excel-Datei. Der Mittelwert der Transmissionszeitkurse von den mehreren Filmen des Indikatorfarbstoffs Wallungen erhalten. Generieren Sie eine Echtzeit-Basis durch Multiplikation der Bild laufende Nummer 0.1. Speichern Sie die gemittelten Zeitverlauf (zwei Spalten) in eine Textdatei. HINWEIS: Vor dem Mittelwertbildung, wenn gewünscht, zu plotten die einzelnen Zeitkurse, um Unregelmäßigkeiten zu verwerfen. Stellen Sie sicher, dass der Film mindestens 5 sec Finale der Steady-State-Durchlässigkeit des Indikatorfarbstoffs.
  7. Starten Sie das Programm Matlab pass P f Fit (Panel "Anzeiger Fit ', Bild 3), um die verschiedenen Parameter der Osmolarität Zeitverlauf zu berechnen. HINWEIS: basierend auf den bekannten anfänglichen und endgültigen Konzentrationen der Lösung in dem Bad wird der zeitliche Verlauf der Veränderung des osmotischen Konzentration der Lösung von den Konzentrationsverlauf berechnet (berechnet, die wiederum von der Indikatorfarbstoff Lässigkeit), vorausgesetzt, es folgt die gleiche Dynamik wie dieFarbstoffkonzentration. P f Fit ist ein Programm zur kostenlosen Nutzung zur Verfügung. Die "PfFit_Installer_web.exe" kann heruntergeladen werden von: P f Fit Benutzerhandbuch "mit ausführlichen Erklärungen und Definitionen ist über Zeus als zusätzliche Datei, die den Benutzer mit der P f Fit-Programm vertraut zu machen hilft zugänglich.
  8. In dem Panel "-Anzeige Fit", importieren Sie die Daten der mittleren Zeitverlauf der Indikatorfarbstoff Lässigkeit ("Indikator-Datendatei", 3A) und legen Sie manuell die aktuellen Experimentparameter und die anfänglichen Vermutungen der Parameter 'Breite' und ' t_half 'den Zeitverlauf der Konzentration der Indikatorfarbstoff (3B beschreibt. Klicken Sie auf "Ausführen", um die Grundstücke der Zeitverläufe der Konzentration der Indikatorfarbstoff (Echtdaten und fit, 4A) und von der modellierten (berechnet) Bad Osmolarität (4B). HINWEIS: agOOD Anpassung an die Daten ist von wesentlicher Bedeutung (eine Empfehlung: Beginnen Sie mit den in Abbildung 3 dargestellten Werte).

6. Die Bestimmung der P f mit der Matlab Fitting-Programm P f Fit

HINWEIS: Zusätzlich zu den grundlegenden Annahmen in Bezug auf das Verhalten von einem Protoplasten als eine wahre und vollkommene Osmometers 11, die Bestimmung der P f beruht auf der Annahme, dass P f sich mit der Zeit ändern, dass diese Dynamik der P f liegt unter der Zeit Verlauf der Zellvolumenänderung und dass drei Parameter aus, um es zu beschreiben: P fi (den Anfangswert des P f), Slope Pf (die Geschwindigkeit der Längenänderung von P f) und Delay (die Zeit vom Beginn des Bades Osmolarität Änderung bis zum Beginn der Zellvolumenänderung). Verschiedene Modelle können getestet werden, darunter verschiedene Kombinationen dieser Parameter und deren Werte, einschließlich Nullwerte 11. P 11, berechnet, die wiederum aus der importierten Reihe von Zell-Konturbereiche (siehe auch die Zusatz 'P f Fit Benutzerhandbuch).

  1. Wechseln Sie auf die "Volume Fit"-Panel (Abbildung 5). Wählen Sie für den Import die Bereiche Datendatei (die Textdatei mit dem zeitlichen Verlauf der "Gebiete" der untersuchten Protoplasten, 5A). Wählen Sie "Letzte Anzeigefitting 'als Parameter Quelle (5B, siehe' P f Fit Benutzerhandbuch" für Alternativen). ANMERKUNG: Diese Parameter (5D) werden dann dem Osmotikum Veränderung des Bades für die Datenträger Anpassungsvorgang zu regenerieren.
  2. In der "Volume Fit"-Panel (5C), zu initialisieren (füllen Sie die Anfangsschätzungen für) die P-f-Parameter: P f, Pf und Slope Delay (eine Empfehlung: Beginnen Sie mit 1, 1, bzw. 30), wählte das Modell 'Klasse' (Empfehlung: Beginnen Sie mit II und Mark "Kontrolle" für alle drei Parameter eingebaut werden). Klicken Sie auf "Ausführen", dann Augapfel den Zwischenwert (5E) und stellen Sie die Delay-Parameter und die Länge des Datensatzes, wenn nötig.
  3. Untersuchen Sie die Ergebnisse Grafik (Abbildung 6), um die Passform zu bewerten Qualität und notieren Sie die Passform Fehler. Ändern Sie die Initialisierung Parameter ein paar falten jedem, und wieder'Run '. HINWEIS: Seien Sie nicht entmutigt werden, wenn das Programm stecken bleibt - das Programm neu starten gerade!
  4. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, beginnend mit verschiedenen Kombinationen von Initialisierung Parameter, mit dem Ziel für den niedrigsten Wert des Passfehler.
  5. Kopieren Sie die Liste der Passform ergibt sich direkt aus dem Bildschirm, oder finden sie in ter PfFit generierte '_FIT_Vol_Results.txt' Datei.

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Representative Results

Um die P f die Aktivität verschiedener AQPs bestimmen und zu vergleichen, werden Mesophyll-Protoplasten aus Arabidopsis Blatt verwendet. Diese Protoplasten wurden gefunden, um niedrigen Grund (Hintergrund) P f Stufen 7 und kann als Funktions-Expressionssystem dienen, um reproduzierbare Messungen P f zu ermöglichen.

Protoplasten aus einer reifen Blatt von einem 6 Wochen alten Arabidopsis-Pflanze wurden isoliert und drei Gen-Konstrukte mit AQP Gene aus Arabidopsis (AtPIP2; 1) und Mais (ZmPIP1, 2 und ZmPIP2, 4) wurden transient (separat), ausgedrückt mit Hilfe der PEG-Transformation Verfahren 15. Unter der Annahme, dass das Ereignis der gleichzeitigen Transformation für eine große Anzahl von Plasmiden in die Zelle unabhängig von deren Art aufgetragen und auf der Grundlage der Ergebnisse, die eine Erfolgsrate von 100% zeigten für synchronisierte transiente Expression von zwei Plasmide in einer Zelle berichtet zuvor für andere Pflanzensysteme15,16, wurden sie um die transformierten Protoplasten (7) kenn co-transformiert mit einem Vektor, der enhanced green fluorescent protein (eGFP) codieren.

Für die P f-Assays wurden Protoplasten in der Versuchskammer (Abbildung 1B) gesetzt und die GFP-markierten Protoplasten wurden durch Video überwacht werden, während sie zunächst mit dem isotonischen Lösung (600 mOsm), dann mit dem hypotonischen Lösung (500 mOsm) gespült wurden, Verwendung Perfusionssystem (1A).

Erstens, das "Image Explorer" und "Protoplast Analyzer" Plugins wurden verwendet, um den Zeitverlauf von Änderungen in der Zellkonturbereich zu erzeugen (Abbildung: Die Zeitverläufe der Zellvolumenänderungen (8A) wurden für jede Zelle in zwei Stufen erhalten 2), dann wird die Matlab Anpassungsprogramm P f Fit (Abbildung 5) wurde verwendet, um zu importieren these-Bereich und wandeln sie in Zellvolumina. Die P-Werte f (8C) wurden für jede Zelle unter Verwendung der P f Fit-Programms (5), bezogen auf den Zeitverlauf der Zellvolumina auf die eingeführte gemittelten Verlauf der Transmissionsänderungen der Anzeige abgeleitet und zusätzlich Farbstoff (Abbildung 3), um den zeitlichen Verlauf der Indikatorfarbstoff Konzentrationsänderung umgewandelt (4A) und dann - an den Zeitverlauf der Veränderung der Osmolarität Bad (4B, 6A und 8B). Es ist erwähnenswert, dass DELC der Unterschied im osmotischen Konzentrationen in der Zelle (CIN) und das Bad (Cout), dh. Die Antriebskraft für den Wasserzustrom, entfällt nahezu ausschließlich auf die Änderung des Cout (6A ). In diesem Experiment erhöhte sich im Test (6B) P f.

Die P f f der Kontrollzelle mit GFP alleine (8C) transformiert.

Figur 1
Abbildung 1: Die Lautstärke-Assay-System. (A) Der Versuchsaufbau: Die Perfusion System enthält Lösungsbehälter (Infusion Säulen, 'Cols'), Schlauch (T), Ventile (V) und eine peristaltische Pumpe (P) auf die Plexiglas Folie auf dem Mikroskoptisch eingerichtet ist. HS = hypotonische Lösung isotonisch Lösung Cm Kamera. (B) eine vergrößerte Ansicht des Plexiglasträger mit der Experimentierkammer (CHR) und der Rohrleitung über einen Einlaß (In) Verteileranschluss angeschlossen. Die Lösung wird aus der Kammer über einen Auslaß (Out) zur Pumpe gesaugt. (C) Schematische Zeichnung Das Plexiglas Schieber (gegen den Uhrzeigersinn: Draufsicht, Seitenansicht lang und Kurzseitenansicht): a = Deckglas, die zentrale Kammer unten; b = Durchsichtiges Klebeband (Tabelle 1), einen Boden für den Einlass und Auslass Lösung Nuten, die zu und von der zentralen Kammer dienen; wenn das Klebeband ersetzt (nur gelegentlich), wird ein Loch in die Kammer unter schnitten; c = ein Plexiglas-Block auf den Objektträger geklebt; d = eine Austrittsstutzen Loch. Zahlen mm (aber die Zeichnung ist nicht maßstabsgerecht). (D) eine vergrßerte Ansicht des Mittelabschnitts des Schiebers mit der transparenten Abdeckung (auch Plexiglas) die zentrale Kammer (Pfeile) teilweise abdeckt. (E) Schematische Darstellung (Drauf und Seitenansicht) der transparenten Abdeckung. Die Größe des transparenten Abdeckung Griff (grün Kunststoff D) ist beliebig. Weitere Details sind, wie in C.

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Abbildung 2: Analyse der Schwellung Protoplasten Bilder mit der "Protoplasten Analyzer"-Plugin. (A) ein, das erste Bild des Films mit Protoplasten, b, wie in a, aber gelbe Kreise zeigen die Auswahl nach der Überprüfung der Film gemacht, bevor die Konturen werden automatisch erkannt, c, von der ersten bis zur letzten Bild die grüne Kreise dicht folgen die Konturen der "brav" Protoplasten Analyse unterzogen. (B) 'Zeit'-Gang-Grundstücke (mit Einheiten der Bildnummer auf der Abszisse) der berechneten Flächen innerhalb der Protoplasten Konturen ("Raum", in quadratischen Pixeln ), für jeden verfolgt (und nummeriert) Protoplasten. (c) die Parameter-Eingabefeld des "Protoplasten Analysator"-Plugin. Vier "Detektionsparameter" kann die Feinabstimmung der Protoplastenerkennungsalgorithmus angepasst werden. Die "Zahl der Grenz Pixel 'Parameter legt die Mindestdicke der Protoplasten Kontur (Standardwert: 5). Der Parameter "relative Gewicht" beeinflusst die Graustufenschwellendifferenz zwischen dem Innenbereich und dem Protoplasten-Außengrenze (Standard: 2). Die "maximale Umfang Verhältnis" definiert einen Schwellenwert für den Ausschluss der Protoplasten, wann immer ihre Form von einem Kreis abweicht. Dieser Parameter ist das Verhältnis der Protoplasten Umfang an den Umfang eines idealen Kreises mit der gleichen Fläche wie die Protoplasten (Standard: 1,05). Die "maximale Flächenzuwachs" (% Steigerung pro Schritt Zeit) Parameter schließt Protoplasten mit Partie steigt über der Parameterwert (Standardwert: 5%). Schließlich übernimmt das Plugin auch kleine Bewegungen, sondern die Protoplasten stoppt Tracking Protoplasten, die sich schnell bewegen, oder dass von der Bildfläche verschwinden. Der Film kann so oft wie nötig wiederholt werden, und eine einzelne Protoplasten können separat erneut analysiert werden..com / files / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Platte des P f Fit-Programm der "Indicator Fit '. Dieser Teil übersetzt die Anzeige Lässigkeit Zeitverlauf in Bad Osmolarität Zeitverlauf. (A) Suchen Sie nach der Datei, die gespeicherten Daten den zeitlichen Verlauf der Durchlässigkeit Änderungen des Indikatorfarbstoffs. (B) Verwenden Sie entweder den zuvor gespeicherten Liste von Variablen und Parametern, oder legen Sie manuell die 5 variable Werte des aktuellen Experiment: "true_C_init 'und' true_C_end '(die Osmolaritäten der Anfangs Bad-Lösung und der über das Bad durchbluteten P f -Assay Lösung),' t_start_wash'(Die Dauer der Grundlinie Probenahme in der Anfangs Indikator-Farbstoff-Ebene), "threshold_%' (% der Baseline-Wert, bei dem das Programm erkennt automatisch die Abfahrt von der Grundlinie Lässigkeit; 1-5% sind in der Regel die effektivste), 'N_steady_st_pts '(die Anzahl der Proben - mit 10 Proben jeden Indikator-Farbstoff Bild genommen, die - am Ende stationären Ebene der Indikatorfarbstoff gemittelt werden, von entscheidender Bedeutung für die Umwandlung der Indikatorfarbstoff Konzentration auf die Osmotikums Konzentration) und Anfangsschätzungen für zwei der vier Parameter des Indikatorfarbstoffs Lässigkeit sigmoidale Zeitverlauf, 'width' und t die Hälfte (In etwa der Dauer der Übergangsteil der Sigmoid bezogen, und ihre Mitte sind; t Hälfte kann negativ sein!). Zwei beste Fit-Parameter, zusätzlich zu 'width' und t die Hälfte, ohne die Notwendigkeit für die anfängliche Vermutung erhaltenES: Verzögerung ("flush_lag '), die Zeit zwischen der Ventilöffnung, um die Ankunft der Lösung in dem Bad, und" C_init', ohne physikalische Bedeutung, aber die für die Beschreibung der Osmolarität Zeitverlauf (siehe den Brief P f Fit Benutzerhandbuch.

Figur 4
Figur 4:. Die Indikatorfarbstoffkonzentration in dem Bad und die Osmolarität des Mediums (A) Der Zeitverlauf des Indikatorfarbstoffes Konzentration, direkt aus den Daten (Punkte) berechnet und von der Best-Fit-Parameter (Zeile), wie es gewaschen weg von einer nicht gefärbten Lösung. (B) Die berechneten zeitlichen Verlauf der Veränderung der Osmolarität der Badelösung, vorausgesetzt, die gleiche Dynamik wie die Veränderung der Indikator-Farbstoff-Konzentration folgt.

Figur 5 Abbildung 5:. Die "Volume Fit 'Platte des P f Fit-Programm (A) für den Bereich durchsuchen Zeitverlaufsdaten-Datei des analysierten Protoplasten (B) Wählen Sie die" Last-Anzeige Fitting "-Option, um die Parameter aus dem Experiment zu importieren. . letzten Lauf durch die "Fit-Indikator" (siehe Zusatz P f Fit Benutzerhandbuch für Alternativen) (C) "Modell Typ" / "Class ': Klasse I enthält das einfachste Modell 1, Klasse II - Modelle 2-5, Klasse III - Modelle 6 - 8. Die Modelle unterscheiden sich in Bezug auf die Parameter fest ist und welche eingestellt wird (dh frei variabel.) während der Anpassungsprozedur (ankreuzen, damit sie variieren), und ob oder nicht ' SlopePf 'und / oder' Verzögerung 'null sind. Der Modusls. 1 - 6 sind an Länge von Moshelion et al 11 diskutiert. "Zusammenschlüsse" listet die Parameterwahlen durch die Wahl der 'Modelltyp' / 'Class' diktiert. Unter Modelle mit einer ähnlichen Anpassungsergebnis - wählen Sie die einfachste! Initialisieren Sie den 'P f "," Slope Pf "(" Slope_Pf') und 'Verzögerung' Parameter wie dargestellt (mehr Details über 'Verzögerung' in E unten). (D) Die Variablen und Parameter, die den zeitlichen Verlauf der Änderung Bad Osmotikums beschreiben, sind Eingangs entweder manuell, oder wie in B (E) ein Zwischenstück beschrieben, indem Sie auf "Ausführen", einer Zeitverlauf der Volumenänderung aufgerufen (berechnet aus den Zellkonturbereiche), die in der Wahl der Anfangswert für den Parameter der "Verzögerung" zu unterstützen. Schätzung von Anglotzen, die Gesamtlänge der Grundlinie aus der 1. Punkt bis zum Beginn der Zellvolumenänderung (die 'inclusive Verzögerung: Die Summe der "T-Start-Wasch '+' Verzögerung '/' UP-Lag '+ der" physiologischen "" Verspätung "). Legen Sie diesen Wert als Eingabeparameter für die "Verspätung" in Feld des 'VolumeFit "und" Ausführen "wieder (siehe auch Zusatz P f Fit Benutzerhandbuch).

Figur 6
Abbildung 6: Die Ergebnisse der Armatur (A) "hinter den Kulissen": die berechneten ultimative Zeitkurse der Osmotikums Konzentrationen in den beiden Kammern. Das Bad (Caus, grüne Linie) und die Zelle (Cin, blaue Linie; Cin berechnet auf Basis der Protoplastenvolumenänderung und der Annahme, dass die Plasmamembran durchlässig ist nur zu Wasser - die "perfekte und wahre Osmometer" 11), und der zeitliche Verlauf der Unterschied zwischen ihnen (DELC, Rote Linie), die die treibende Kraft für Wasserdurchfluss ist, markiert 'Eo-TLag "das Ende der" UP-Lag "und dem Beginn der hypotonischen Herausforderung (hier nur bei ca. 21 sec). Red Box: der Fehler des fit-Wert (fit-ERR, siehe Definition unten in B) (B) das endgültige Ergebnis der Montage der Volumen-Zeit-Verlauf,. Green box: "Eingangsgrößen" sind die über den P f Fit / 'VolumeFit' Platte (in 5A Legende definiert) eingegebenen Werte. Black Box: 'exp-Band "und" Vol-ausgestattet "sind die experimentellen Daten und der berechneten mit den am besten passenden Parameter Volumen bzw. ist' Eo-TLag 'das gleiche wie in A,' Eo-Delay 'markiert den der Beginn der Volumenänderung. 'Area 3%' markiert die Lautstärke, mit der die Fläche um 3% gestiegen, den mutmaßlichen Grenze der Zellmembran Fähigkeit, ohne zu reißen dehnen. "Pf (skaliert) 'ist der zeitliche Verlauf der Montage-based berechnet P f und überspannt die unter dem roten Feld als "Spanne der P f 'angegebenen Werten. Red Box: "angepassten Parameter 'sind die Werte der besten Passform-Parameter:' Pf i '(der anfängliche P f)," Verspätung "(der Zeitraum zwischen dem Beginn der hypotonischen Herausforderung und dem Beginn der Volumenänderung (die, nach dem Modell 5 in diesem Beispiel verwendet wird, ist auch der Beginn einer Veränderung in der P f-Wert), und "-P Steigung f '(die konstante Änderungsrate der P f-Wert' fit_ERR 'in A gezeigt. - die Minimierung der Ziel Matlab Anpassungsverfahren - ist der "root mean square" Abweichung (dh eine Wurzel aus einer gemittelten quadratische Abweichung) von einem grünen Punkt von der schwarzen Linie), als% des Ausgangsvolumens präsentierte es. ist mit diesem Wert, dass der relative Erfolg der wiederholten Montage mit unterschiedlichen Parameterwerten Initialisierung beurteilt wird. AAnmerkung zur Vorsicht: Da die Best-Fit-Parameterwerte könnte das Ergebnis von einem lokalen Minimum in der Fehlerminimierungsverfahren gefunden werden - um sicherzustellen, dass ein globales Minimum gefunden wurde, mehrere Läufe mit unterschiedlichen Initialisierung Werte für diese drei Parameter notwendig (und die niedrigste fit_ERR sollte während dieser Versuche gesucht werden Blue-Box. Deltas sind die Änderungen, die bis Ende des angepassten Volumenänderung Zeitraum aufgetreten: 'avg Volm%' ist die relative Ausmaß der Volumenänderung berechnet Protoplasten und "avg Bereich% ' ist die relative Änderung der Protoplasten Oberfläche. Die anfängliche Größe der Zelle durch "Radius", aus dem Mittelwert des Protoplasten abgeleiteten Basispartie gegeben.

Figur 7
Abbildung 7: Epifluoreszenzmikroskopie Ansicht Mesophyll-Protoplasten (A) unter Durch weißem Licht und (B) bei 488 nm Anregung und 520 nm Emission. Maßstab:. 100 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 8
Abbildung 8:. Volumenänderung und die extrahierte osmotischen Wasserdurchlässigkeit, P f (A) Zeitverlauf (60 sec) der Protoplasten Schwellungen bei Exposition gegenüber hypotonischen Herausforderung (Mittelwert ± SE) (b) der berechneten Osmotikums Konzentration im Bad während der. hypotone Herausforderung. Beachten Sie, dass während der hypotonischen Lösung Fluss wurde auf 15 Sekunden eingeschaltet, das Bad erreicht es erst nach einerLag hier von 5,9 sek. (C) P f (Mittelwert ± SE). Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Kontrolle (p ≤0.05). Daten von wenigstens drei unabhängigen Experimenten für jede Behandlung mit einer insgesamt n Protoplasten (Kontrolle: n = 52, AtPIP2; 1: n = 13, ZmPIP1, 2: n = 28, ZmPIP2, 4: n = 34).

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Discussion

Beschrieben wird hier ein einfaches und sehr effizientes Verfahren zur Messung der P f der isolierten pflanzlichen Protoplasten, grundsätzlich auch auf andere sphärische Zellen, zB., Froschoozyten 11. Diese Methode basiert auf der Messung der P f in Reaktion auf eine osmotische Herausforderung an die Zelle. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die auf diesem Ansatz ist jedoch die Änderung von Lösungen, dh der Osmolarität, nicht plötzlich, sondern allmählich, während eine konstante Badperfusion, beginnend mit der isotonischen Lösung, bei der die Ausgangszellvolumen gegründet. Außerdem funktioniert diese Methode nicht um eine Saugpipette und somit die Störung der Protoplasten minimiert.

Die hier vorgestellte Ansatz ermöglicht Messungen von einer Vielzahl von Protoplasten, aus verschiedenen Pflanzen oder Gewebe. Doch wegen der damit verbundenen Berechnungen können nur sphärische Zellen analysiert werden. Auch die enzymatische Isolierung von the Protoplasten und die Osmolarität der Lösungen müssen auf die Zellen untersucht eingestellt werden (beispielsweise die enzymatische Trennung von Tomaten Mesophyll-Protoplasten dauert ungefähr eine Stunde, deutlich länger als im Falle von Arabidopsis-Protoplasten).

Die Isolierung der Arabidopsis Mesophyll-Protoplasten nach dem Protokoll dargestellt ist einfach, schnell und effizient, was eine hohe Anzahl von Protoplasten. Bemerkenswert ist, dies zusammen mit ihrer niedrigen Grundniveaus P f und ihrer hohen Transformationseffizienz (Figur 8), macht sie zu einem attraktiven System für die funktionelle Expression von AQPs, um quantitative Vergleiche von P f von verschiedenen Isoformen AQP induzierte ermöglichen. Bei der Expression AQPs in diesen Protoplasten mit einem Marker-Gen (zB GFP), kann man leicht zu screenen, die Protoplasten in der Versuchskammer für die fluoreszierenden Zellen zu analysieren.

Es lohnt sich zu prüfen, ob dieses System ist eine praktikable alternative, um Eizellen für die Untersuchung AQPs auch aus tierischen Quellen (das Funktions tierische Proteine ​​in Pflanzenzellen hat bereits gezeigt, 17 ist).

Verwendung der P f Fit Programms zwei Parameter, neben der P f, für die Beschreibung der Protoplasten antwortet hypotone Herausforderungen erhalten: Verzögerung die Zeit zwischen dem Beginn der Volumenänderung und dem Beginn der Badperfusion und Steigung Pf, die Änderungsrate der P F während des osmotischen Herausforderung (im Detail in 11 beschrieben).

Für jede Versuchsdaten die Lautstärke passend Verfahren muss mehrmals durchgeführt werden, liefern verschiedene Startwerte (Initialisierung) für diese Parameter, schließlich die Wahl der Passform mit dem geringsten Fehler. Diese Fehlerminimierung Prozess könnte wie der Suche nach dem tiefsten Tal (eine "globale Minimum") in einer Landschaft aus Tälern mit verschiedenen Tiefen, unter Menschen dargestellt werdeny Hügel, und der Versuch nicht in einer eher flachen Tal (ein "lokales Minimum") gefangen werden.

Zwei Arten von P f erhalten, P f zu Beginn des hypoosmotischen Quellverhalten ("P f Anfangs ') und P f am Ende von 15 Sekunden der Quellung berechnet, gezählt vom Ende der   die Verzögerung ('P f endgültige'). Der Unterschied zwischen den beiden ist vollständig durch Moshelion et al. 11, mit Bezug auf die 6 Modelle analysiert.

Es gibt zwei kritische Schritte in dem Protokoll: Zunächst wird eine gute Anpassung an den Zeitverlauf des Indikatorfarbstoffes Konzentration zweitens eine gute Anpassung an den zeitlichen Verlauf des Volumens der Quellzelle.

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Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen Nationalfonds für Scientific Forschung (FNRS), das Interuniversitäre Attraktion Polen Programm-belgischen Wissenschaftspolitik und die "Communauté française de Belgique-Aktionen de Recherches Concertées" zum FC, von der Israel Science Foundation Jerusalem (unterstützt ISF) zu MM (Grant # 1311-1312) und NM (Grant # 1312-1312).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KCl Chem-Impex International 01247-1 http://www.chemimpex.com
Any source, anal. grade
CaCl2 Merck 11718006 http://www.merck.com
Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) Sigma 15152002 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
D-Sorbitol Sigma 18032003 http://www.sigmaaldrich.com
Any source, anal. grade
Cellulase Worthington, Lakewood, NJ, USA LS002603 http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase Karlan,               Phonix, AZ, USA 8006 http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) Sigma 81420 http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9418-5G http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate Sigma P4380 http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine Sigma P8920 http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol Sigma X4126 http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy Merck 107921 https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope  Nikon Eclipse TS100/TS100F http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump BIO-RAD EP-1 Econo Pump http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera Scion Corporation CFW-1308M http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ Carnegie Mellon http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html
Free software
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit BIO-RAD 731-9006 http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold DirectMed http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns) Welford IF-BR-001 http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing TYGON R-3603 http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear Viking Industrial, UK VKMONO25 http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8
any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK

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References

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