הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice. J. Vis. Exp. (89), e51660, doi:10.3791/51660 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה נערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית (IACUCs) בשעה ממוריאל סלואן קטרינג במרכז הסרטן.

1. שאיפה של מח העצם (BM) תאים מעצם הירך

  1. להרדים את העכבר שיעבור שאיבת מוח עצם הירך עם isoflurane (1-4%) מנוהל עם מאדה דיוק. עומק ההרדמה צריך להיות במעקב כל דקות 5-10 לאורך כל ההליך על ידי התבוננות, כי אין שינוי בקצב נשימה הקשורים למניפולציה כירורגית ו / או אוזן, בוהן, וקמצוץ זנב. הרדמה מושרה עם isoflurane וגם נשמרה לאורך כל ההליך עם isoflurane. מנה טרום פרוצדורליים מנע של עצירות במינון של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם תת עורי כל שעות 6-12 יכול לשמש כדי למנוע כאבים הקשורים בהליך כadjunct לCarprofen.
  2. החל משחה העיניים לעיניים של האינדוקציה הבאה העכבר של הרדמה כדי למנוע התייבשות של קרנית.
  3. הפרווה נחתכה בקפידה מתוך שטח של עור כ 150% יותר מאשר באזור של אתר האיפה המיועדת. Loose פרווה מוסרת עם כרית גזה לחה. נא לשמור את העכבר על משטח במחזור מים חם או משטח תרמוסטטית נשלט בטוח אחר כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההליך.
  4. לחטא את הרגל כולה המכילה את עצם הירך שתעבור שאיפה עם שלושה סטים של עלובי לסירוגין (לסירוגין עם שני povidone-יוד (פולידין) או כלורהקסידין (לשפשף Nolvasan) ו70% אלכוהול איזופרופיל או 70% ספוגים גזה ספוגות אתנול).
  5. הרטב 0.5 מיליליטר חפת מזרק (נפח: 0.5 סמ"ק; מד: 27.5 G) עם פוספט בופר סליין סטרילי (PBS) לפני aspirating BM. מלא את המזרק עם 200-500 μl של PBS ולגרש מייד את PBS. חזור על הליך זה לא 2-3עורכי שיטות קלט.
  6. שמור כפוף שוקה מעצם הירך על ידי לחיצה על עצם השוק עם או הקמיצה או האצבע החמישית. לאשר כי מטוס הרדמה מתאים הושג. המזרק מוחזק באמצעות האגודל והאצבע המורה. זה מאפשר condyles להיחשף ומקל על החדרת המחט.
  7. לאחר הרטבת המזרק, להכניס את המחט דרך גיד הפיקה, כך שהמחט נתקעה באופן מאובטח בין שני condyles של עצם הירך. על ידי החזקת diaphysis הקרוב לepiphysis של עצם הירך עם האגודל ואצבע המורה, המחט מוחדרת לתוך הפיר של עצם הירך בקלות.
  8. לסובב את המחט החוצה וכלפי מעלה, כך שהוא מקביל לפיר של עצם הירך. פעולה זו מאפשרת שליפה של תכני מח עצם מן פיר עצם הירך.
  9. הפעל את השעון ונגד כיוון שעון בזמן שהמחט דוחף אותו לאט לתוך חלל מח עצם הירך. לאשר את המיקום הנכון של המחט בעדינות על ידי נע סאיringe רוחבי.
  10. משוך בעדינות את בוכנת המחט לאחור, יוצר לחץ שלילי, ואילו הזזת המחט קדימה ואחורה בתוך חלל BM. הערה: הנפח של BM aspirated יהיה כ 5 μl אשר בדרך כלל מתאים ל0.4-0.8 x 10 6 תאים חד גרעיניים. שאיפה מוצלחת תאושר מבחינה ויזואלית על ידי הופעתו של דם בחלק העליון של המחט בבסיס של המזרק. אם אין דם נראה במזרק סביר להניח כי שבר עצם או רקמה קטן תקוע במחט. זו ניתן להסיר את המחט על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה ב-PBS (זו אחת סיבות למה המזרק צריך להיות prefilled עם PBS לפני aspirating BM). אם הרקמה לא ניתן וחילצה מן המזרק, להשתמש במחט ומזרק (שוב להרטיב את המזרק עם 200-500 μl של PBS) חדשות.
  11. ברגע שBM הוא להישאף בהצלחה מעצם הירך, להוציא את המחט והמזרק מעצם הירך והעכבר.
  12. הזז aspirated BM ליחסי ציבור צינור microfugeefilled עם 500 μl של PBS. עבור רוב היישומים, תאי BM אז צריכים להיות כל הזמן על קרח עד עיבוד נוסף במידת האפשר.
  13. לאחר השלמת ההליך, לנהל משכך כאבים עם carprofen 5 מ"ג / קילוגרם תת עורי. לאחר מכן להסיר את העכבר מההרדמה ומניח על משטח לוהט עד התאושש באופן מלא. הערה: לא צריך להיות שום סיבוך או מצוקה חווה בעקבות הליך השאיפה אם נעשה כראוי.
  14. לפני החזרת עכברים לאזור המגורים, לוודא שהם מסוגלים ambulate ולהגיע למזון ומים. שימו לב לעכברים סימנים של מצוקה או לאחר זיהום הליך בשעה 24 הבאה. סימנים כוללים: דימום בלתי פוסק, אנמיה, עייפות. אם כל אחד מהסימנים הללו נראים שלאחר הליך, בעלי החיים (ים) צריכים להיות מורדמים. הערה: שאיפת BM / דגימה ניתן לחזור אך ההליך חוזר צריכה להתבצע על הירך הנגדית כדי למנוע טראומה חוזרת ונשנית באותה הרגל. אין מידע זמין קטן לגבי frequency ניתן לבצע שאיפת BM. שאיבת מוח עצם הירך היא בדרך כלל חוזרת ונשנית לא בתדירות גבוהה יותר מאשר כל 2 שבועות.

2. הערכה של תוכן סלולארי בתאים להישאף BM

  1. גלולה תאים נאספו מאיפה בע"מ ומקום בצינור microfuge על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בC o 4 או RT.
  2. לשאוב supernatant ואז resuspend את הכדור ב500 μl של חיץ תמוגה תא דם אדום ACK (מאגר תמוגה "אמוניום כלוריד, אשלגן").
  3. דגירה התאים במאגר תמוגה התא אדום עבור 10 דקות ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של PBS ומסובב את התערובת שוב XG 300 5 דקות בC o 4 או RT. הערה: גלולה lysed תאי דם האדומים עם החברה מורכבת מתאים מונונוקלארים BM. אלה יכולים להיות מושעים עבור מכתים FACS, ספירת תאים, השתלה, ניתוח cytospin ו / או כל שימוש אחר (בדיוק כמו תאי BM שנקטפו מעכברים הקריבו יהיו בשימוש).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שאיפת הירך BM של עכבר C57/B6 חי נוצלה להשיג תאים מונונוקלארים BM אחרי קציר BM הקונבנציונלי של אותו העכבר לאחר הקרבה. תאים מונונוקלארים BM מתקבלים על ידי שתי השיטות נותחו לאחר מכן על ידי (1) ניתוח ציטולוגית של תאי BM, (2) קביעת השכיחות היחסית של תאי גזע / אבות היווצרות הדם (HSPCs), ו (3) לשעבר vivo תרבות של HSPCs הממוין. בניסוי, Sca1 השושלת שלילית האחרון + c-KIT + תאים (LSK) מוינו מהתאים חד גרעיניים שהושגו על ידי שאיפה BM כמו גם מקציר BM קונבנציונלי. 150 תאי LSK מתקבלים על ידי כל אחת משיטות ואז היו מצופים בתקשורת חצי מוצק methylcellulose המכילה ציטוקינים מיאלואידית-erythroid במשך 7 ימים בשני עותקים טכניים. הנתונים שמוצגים באיור 1, B ממחיש כי סוגים ופרופורציות דומים של תאים וHSPCs תפזורת נתפסו על ידי מורפולוגיים ולזרום ניתוח cytometric או באמצעות שאיפת BM הירך או קציר BM קונבנציונלי.

על מנת לקבוע את אחוז LSK ובתאי מיאלואידית ראה עם קציר מח עצם קונבנציונלי לעומת שאיבת מוח עצם הירך כמותית, השווינו את אחוז אוכלוסיות LSK וחבר הפרלמנט כתדירות של תאים חיים הכולל ב3 שאיפות עצמאיות ויבולי מח קונבנציונליים. נתונים אלה, המוצגים באיור 1C, מגלה ירידה בתת אוכלוסיות LSK וחבר פרלמנט ממח עצם שנאספו על ידי שאיפה הירך בהשוואה לקציר מח קונבנציונלי (אם כי הבדל זה לא היה משמעותי סטטיסטי עבור כל אוכלוסייה).

מיון של תאי LSK ואחריו תרבות vivo לשעבר בmethylcellulose הביא מספרי מושבה וסוגי תאים המתקבלים על ידי שאיבת מוח עצם הירך וקציר BM הקונבנציונלי דומה (כפי שמוצג באיור 1D). סוגי המושבה נצפו ומנוי כוללים CFU-GEMM (גרנולוציט, כדורית אדומה, מונוציטים, megakaryיחידת ocyte מושבה יוצרים), CFU-GM (גרנולוציט, יחידת המושבה להרכיב מונוציטים), וBFU-E (erythroid יחידת יוצרים פרץ).

איור 1
איור 1. מח עצם הירך שאיפה (BM) בעכברים חיים כדי להקל על בדיקה של תכולת מח בלי הקרבה של עכברים. () רייט Giemsa מוכתם cytospins של תאים חד גרעיניים שהושג באמצעות שאיפת BM של עכברים חיים. ניתן לקבל כ 0.4-0.8 x 10 6 תאים חד גרעיניים בכל שאיפת הירך בודדת. מוצג כאן הם בדרך כלל מח תוכן של עכברי C57/B6 בן 6 שבועות wildtype הושג על ידי שאיפה BM הירך (מימין) מול בידוד תא BM קונבנציונלי דרך הקרבה של עכברים (משמאל) (סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר). שאיפת הירך בע"מ (B) מספק מספר מספיק של תאים להערכהment של תא גזע / אבות היווצרות הדם כפי שמודגם כאן (מימין: תאים מלשאוב BM; שמאל: תאים מתקבלים על ידי קצירה של מח מעכברים הקריבו). SCA-1 + c-KIT Lineage שלילי + תאים (LSK) המכילים תאי גזע hematopoietic כמו גם שושלת שלילית SCA-1-C-KIT + אבות מיאלואידית ותת כפי שהוגדר על ידי CD34 וביטוי FcγR נותחו (שער הורה הוא חי , תאי שושלת שלילית). האחוזים מוצגים מתייחסים לאחוזים של תאים בתוך שער. (C) כימות LSK (תאים, ותאי מיאלואידית (תאי MP), אבות מיאלואידית משותפים (SCA-1-C-KIT + CD34 + FcγR + ביניים שושלת שלילית), ותאי גרנולוציט-מקרופאג (שושלת שלילית SCA-1-C-KIT + CD34 + FcγR +), ובתאי megakaryocyte-erythroid (שושלת שלילית SCA-1-C-KIT + CD34-FcγR-), כתדר של תאי חיים מקציר מח קונבנציונלי (n = 3) ושאיבת מוח עצם הירך (n = 3). ברים שגיאה מייצגים דה סטנדרטיתתמונות נציג viation. (ד ') של assay המושבה methylcellulose תוצאות שבוע אחד לאחר ציפוי של 150 תאי LSK במיאלואידית / erythroid מכיל methylcellulose (לעיל) ומספרים וסוגים של מושבות נצפו באמצעות תאי LSK מכל שיטה. סוגי המושבה נצפו ומנויים כוללים CFU-GEMM (גרנולוציט, כדורית אדומה, מונוציטים, יחידת מושבה יוצרי megakaryocyte), CFU-GM (גרנולוציט, יחידת המושבה להרכיב מונוציטים), וBFU-E (יחידה פרצו יוצרי erythroid). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שאיפת BM סידורי היא הליך שגרתי קריטי לחקירה קלינית של הפרעות המטולוגיות בבני אדם. היכולת לבצע דגימה סידורי מקבילה של BM בעכברים לאפיון של ההרכב התאי ומרכיבים של BM לאורך כל ניסויים ממושכים היא גם יקר מאוד. הליך זה שימושי לאפיון של HSPC של מבלי להקריב את העכבר, אלא גם לגילוי הנוכחות של סוגים נוספים של תאים בBM במקרים שבם התוכן של הדם ההיקפי לא יכול להיות שיקוף של התאים המתגוררים בBM. שאיפת BM סידורי נעשתה שימוש יעיל מאוד למטרה מאוחר יותר בניטור נוכחותם של תאים אנושיים xenografted לעכברים immunocompromised למשל 3. בהתחשב בכך ש0.4-0.8 x 10 6 תאים מאוחזרות בדרך כלל עם כל שאיפת BM, יכולים להיות מנוצלים בתאים אלה למספר המטרות, כולל ניתוח ציטולוגית (איור 1 א), קוטרcytometry זרימת גנוסטי (איור 1), לזרום הפרדת cytometric תא ואחריו שימוש נוסף במורד הזרם של תאים ממוינים, כולל תרבות של תאים (איור 1 ג), מיצוי חומצות גרעין, מיצוי חלבון למבחנים המותאמים לאפיון proteomic של מספרים סלולריים מוגבלים, ואפילו השתלה נוספת של חילוץ תאים. במקביל, חשוב לציין כי מספר HSCs לאחזר בכל שאיפת הירך מוגבל במספר הכולל של תאי לאחזר בהליך זה. לדוגמא, בהתחשב בהגדרה של HSCs כSca1 שושלת שלילית + cKIT + CD150 + CD48-CD244-תאים, התדירות של HSCs היא כ 10 HSCs/100, 000 תאים 7. בהתבסס על תדר זה, כ 40-80 HSCs צפוי להאסף בכל הליך שאיפה. כמו כן, כפי שצוין באיור 1 ג, תדירות LSK ובתאים היא נמוכה יותר, אם כי לא הגיע למובהקות סטטיסטיות, בMarro העצםתאי w הושגו באמצעות שאיבת מוח עצם הירך בהשוואה לקציר מח עצם קונבנציונלי. אנו מאמינים ירידה זו היחסית בLSK ותדירות אב ראתה עם שאיפה ביחס לקציר מח עצם כירורגית קשורה לזיהום בדם היקפי שמתרחש עם שאיבת מוח עצם הירך. מגבלות אלו של שאיבת מוח עצם הירך בהערכת אוכלוסיות תאים נדירות במח יש לציין. הערה נוספת אחת היא שיש לנו לבצע הליך זה בדרך כלל בעכברים של 6 שבועות ומעלה. אנו מאמינים כי הליך זה יהיה יותר ויותר מאתגר מבחינה טכנית עם עכברים פחות מ 6 שבועות של גיל.

טכניקה זו גם מתאימה כדי להעריך את chimerism של BM בניגוד לדם ההיקפי בהקשר של ניסוי הכינון מחדש תחרותי מתמשך. במבחנים אלה, את הפוטנציאל התפקודי של HSC של מסט ניסיוני של עכברים נבדק כנגד מספר קבוע הידוע של HSC &# 8217; של עם קריאת הנתונים להיות chimerism דם היקפי, כמו גם chimerism של HSC של (ראה סקירה על ידי Purton ואח' 8.). Chimerism של הדם ההיקפי עשוי לעמת מchimerism בBM אם הפרעות המשפיעות על תוצאת תא בתאי גזע hematopoietic בבידול לקוי של HSPC של לתאי דם במחזור בוגרים. בהתחשב בכך שhematopoiesis הסופי אינו מבוסס לפחות עד 16 שבועות לאחר השתלה 9 וchimerism שעשויים להשתנות לאחר תקופות ארוכות עוד יותר של זמן 10, טכניקות המאפשרות גישה מוקדם יותר לתא HSPC כגון מאויר כאן עשוי להיות שימושי במיוחד. בדוגמא אחת האחרונה, השתלה תחרותית של תאי BM מעכברים עם מחיקה לאחר לידה הומוזיגוטים של Dnmt3a ידי חשף chimerism challen et al. מופחתת מעכברי Dnmt3a-null בדם ההיקפי אך עלייה פרדוכסלית בchimerism HSC של Dnmt3aNull-HSC של ב11 BM. תוצאה זו מעידה על פגם בידול של Dnmt3a - / - HSC של למרות עלייה בהתחדשות עצמית. יתר על כן, תוצאה זו הייתה לראות רק בהקרבה בעיתוי של עכברים מושתלים נמען בניסויי השתלה תחרותיים סידוריים במרווחים של כל 16 שבועות. לכן מבחני המאפשרים דגימה של תאי BM במקביל עם דם היקפי ללא צורך בהקרבה של העכברים ומאפשרים תצפית מתמשכת של עכברים הם די שימושיים.

כפי שהוזכר קודם לכן, את הטכניקה הפגינה כאן היא דומה לטכניקה מנוצל להזרקת intrafemoral ישירות לתוך חלל חלל מח של עכברי 2,3. הזרקת intrafemoral ישירה הוכיחה להיות מאוד שימושי בהנחיית מחקרי xenograft אנושיות בעכברים שבו הוכח לספק engraftment המשופר בהשוואה ישירה עם הזרקה תוך ורידית 6,12,13. טכניקה זו אף תאפשראד לזיהוי ברמה שלא היה ידועה במהירות של אכלוס HSCs האנושי.

בשלב זה לא ידוע האם דגימה חוזרת ונשנית של BM בעכברים דרך אותה עצם הירך משפיעה על ההרכב התאי של BM או מספר תאי מח מאוחזר עם שאיפות חוזרות ונשנות. יתר על כן, פרק זמן המינימאלי מומלץ לבצע הליכי שאיפה לחזור מאותו עצם הירך אינו ידוע. בעת ביצוע שאיפות מח עצם הירך חזרו באותו העכבר, להחליף את עצם הירך המשמשת לשאיפה בע"מ ולבצע aspirates BM הסידורי במרווחים של> 2 שבועות. מאמצים נוספים התמקדו בהבנת ההשפעות הפוטנציאליות, אם בכלל, של נהלים סידורי הירך BM שאיפה בעכברים במרווחים זמן ספציפי על הסוגים ומספר התאים נאספו מBM או ארכיטקטורה של BM יש צורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS PAA H15-002
Bovine serum albumin PAA K41-001
ACK lysis buffer Homemade in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride Fisher Scientific A661-500
1 g Potassium bicarbonate Fisher Scientific P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8 Gibco 15575-038
RPMI 1640 PAA E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G Becton Dickinson 305620
Sterile cell strainer 70 μm Fisher Scientific 22363548
Isoflurane, USP Attane NDC:66794-014-25
Blunt-end needle Stemcell Technologies 28110
PrecisionGlide needle 23 G Becton Dickinson 305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip Becton Dickinson 309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well Becton Dickinson 351146
12 x 75 mm 5 ml tubes  Becton Dickinson 352054 FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap Becton Dickinson 352235 FACS staining
NK1.1 APC-Cy7 Biolegend 108723
CD11b APC-Cy7 Biolegend 101225
CD45R (B220) APC-Cy7 Biolegend 103223
CD3 APC-Cy7 Biolegend 100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 Biolegend 108423
Ter119 APC-Cy7 Biolegend 116223
CD19 APC-Cy7 Biolegend 302217
CD4 APC-Cy7 BioLegend 317417
CD117 (c-KIT) PE BioLegend 105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 Biolegend 122513
CD34 APC Biolegend 128612
CD16/32 e450 eBioscience 48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich 32670
MethoCult GF M3434 STEMCELLTECHNOLOGIES 3434 For methocellulose culture
Carprofen Crescent Chemical Company C11045850 1 dose (5mg/kg) 
Flow cytometer, LSRFortessa Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) Dechra-US 17033-211-38

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
  2. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
  3. Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
  4. Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
  5. Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
  6. Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
  7. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  8. Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
  9. Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
  10. Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
  11. Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
  12. Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
  13. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics