यकृत metastases के एक पूर्व नैदानिक ​​murine मॉडल

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

यकृत मेटास्टेसिस की एक preclinical, murine मॉडल एक hemispleen इंजेक्शन तकनीक के माध्यम से प्रदर्शन किया.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Soares, K. C., Foley, K., Olino, K., Leubner, A., Mayo, S. C., Jain, A., Jaffee, E., Schulick, R. D., Yoshimura, K., Edil, B., Zheng, L. A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases. J. Vis. Exp. (91), e51677, doi:10.3791/51677 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

कई murine मॉडल मानव के कैंसर का अध्ययन करने और कैंसर के इलाज और विकास की समझ अग्रिम करने के लिए विकसित किया गया है. इधर, syngeneic murine अग्नाशय के ट्यूमर कोशिकाओं की एक hemispleen इंजेक्शन के माध्यम से यकृत मेटास्टेसिस की एक preclinical, murine अग्नाशय के ट्यूमर मॉडल में वर्णित है. इस मॉडल जिगर को metastatic रोग के साथ रोगियों में नैदानिक ​​स्थितियों के कई mimics. चूहे लगातार मेटास्टैटिक प्रक्रिया की जांच, प्रायोगिक चिकित्सा परीक्षण, और ट्यूमर इम्यूनोलॉजी अनुसंधान के लिए अनुमति जिगर में मेटास्टेसिस का विकास.

Introduction

अग्नाशय ductal ग्रंथिकर्कटता (पीडीए) संयुक्त राज्य अमेरिका 1 में कैंसर से संबंधित मौतों का चौथा प्रमुख कारण है. मेटास्टैटिक पीडीए के साथ रोगियों के लिए पांच वर्ष जीवित रहने की 2-12% 1 है. अग्नाशय के कैंसर के लिए सहायक और neoadjuvant कीमोथेरेपी आज सबसे अधिक प्रभावी है, अभी भी उपन्यास उपचार के लिए एक दरकार बनी हुई है.

उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास विश्वसनीय preclinical पशु मॉडल जरूरी. चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल का उपयोग करने के लिए सरल कर रहे हैं, कमियां मानव के कैंसर में देखा ट्यूमर प्रगति और microenvironments metastasize और नकल करने के लिए इन ट्यूमर की अक्षमता शामिल हैं. इस तरह के क्रास और P53 तोड़े में oncogenic उत्परिवर्तन (KPC मॉडल) 2 और एक YFP वंश ट्रेसर (PKCY मॉडल) के साथ KPC मॉडल युक्त अनुवांशिक इंजीनियर माउस के रूप में आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल, 3 immunocompete में प्राकृतिक रूप से उत्पन्न ट्यूमर के अध्ययन के लिए अनुमतिNT चूहों. साथ ही, ट्यूमर microenvironment अनछुए और अधिक बारीकी से मानव ट्यूमर प्रगति में देखा कि जैसा दिखता है. दुर्भाग्य से, ट्यूमर के विकास के समय यह मुश्किल प्रायोगिक उपचारों का अध्ययन करने के लिए बनाता है जो इन मॉडलों के भीतर चर रहा है. साथ ही, इन चूहों की backcrossing समय और हमेशा संभव नहीं है, जो वित्तीय प्रतिबद्धता की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है. अंत में, प्रत्यारोपित xenograft पीडीए माउस मॉडल बदल दिया है जो चूहों, या अनुपस्थित ट्यूमर microenvironments immunocompromised जरूरत. नतीजतन, इन preclinical मॉडल में प्रदर्शन प्रायोगिक उपचारों की प्रभावकारिता अक्सर मानव नैदानिक ​​परीक्षणों 4 में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं.

इस hemisplenectomy माउस मॉडल C57BL / 6 चूहों 5, 6 से व्युत्पन्न एक अत्यधिक tumorigenic, methylcholanthrene प्रेरित अग्नाशय के ट्यूमर सेल लाइन हैं जो Panc02 ट्यूमर कोशिकाओं का इस्तेमाल. साथ ही, अन्य murine पीडीए सेल लाइनों KPC mic से व्युत्पन्नई इस मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है. Schulick एट अल. पहले एक hemisplenectomy तकनीक विकसित की है और पेट के कैंसर मेटास्टेसिस 7 के एक syngeneic माउस मॉडल बनाया है. इस hemisplenectomy मॉडल (चित्रा 1) उपन्यास चिकित्सीय एजेंट 7-10 की जांच करने के लिए खुद को उधार असुरक्षित चूहे में लगातार और बराबर ट्यूमर टीका प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों को पुष्टि, और जानवरों के आकलन और प्रयोगशाला की देखभाल के प्रत्यायन (AAALAC) के लिए एसोसिएशन के दिशा निर्देशों के अनुसार बनाए रखा गया. शल्य प्रक्रिया प्रति घंटे पंद्रह हवा एक्सचेंजों की एक न्यूनतम आए कि एक ऑपरेटिंग कमरे में बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है. सभी उपकरणों की प्रक्रिया के दौरान पूर्व प्रत्येक माउस के बीच में 70% इथेनॉल के साथ प्रक्रिया को और फिर autoclaving द्वारा निष्फल रहे हैं. शल्य प्रक्रिया जीवित रहने की उम्मीद नहीं है कि सभी चूहों संज्ञाहरण के तहत अब भी है, जबकि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद 3 मिनट के लिए सीओ 2 के तहत euthanized हैं.

1 सेल तैयार

  1. 2 x10 7 कोशिकाओं / एमएल फॉस्फेट बफर खारा में सुसंस्कृत Panc02 कोशिकाओं Resuspend, और बर्फ पर रहते हैं.

2 माउस तैयारी

  1. Ketamin प्रशासनxylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ मिश्रित ई (100 मिलीग्राम / किग्रा) intraperitoneally के लिए 8-12 सप्ताह विभाजित खुराकों में पुराने C57BL 6 / मादा चूहों.
  2. पैर के अंगूठे चुटकी वापसी पलटा माउस पूरी तरह anesthetized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए समाप्त कर दिया है कि जांच देखने के लिए.
  3. पूरी तरह से चूहों anesthetize की जरूरत के रूप में xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ मिश्रित Ketamine की अतिरिक्त खुराक (100 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन.
  4. चूहों संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं, जबकि सुखाने को रोकने के लिए चूहों की आंखों को Puralube डॉक्टर मरहम लागू करें.
  5. घाव के संक्रमण से बचने के लिए चूहों की शल्य चिकित्सा के क्षेत्र दाढ़ी.
  6. तो आयोडीन 70% इथेनॉल और साथ चीरा की बाईं subcostal क्षेत्र प्रस्तुत करने का.
  7. बाँझपन बनाए रखने के लिए पेट के आसपास एक सर्जिकल कपड़ा रखें.

3 Laparotomy

  1. त्वचा के माध्यम से और एक स्केलपेल का उपयोग पेरिटोनियम के माध्यम से बाएं कान के साथ लाइन में एक छोड़ दिया subcostal चीरा.
  2. एक साथ डिजिटल पी लगाने से चीरा के माध्यम से तिल्ली एक्सप्रेसचीरा के कपाल और दुम पहलुओं साथ ressure.
  3. तिल्ली के अवर अंत में प्लीहा रक्त वाहिकाओं का पता लगाएँ.
  4. प्लीहा के खंभे पर प्लीहा रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए सावधान किया जा रहा तिल्ली के केंद्र में दो क्षितिज मध्यम आकार ligating क्लिप रखकर तिल्ली फूट डालो.
  5. संक्रमण से बचने के लिए वापस पेरिटोनियम में तिल्ली के ऊपरी ध्रुव रखें.

4 ट्यूमर इंजेक्शन

  1. एक 26 जी एक्स 5/8 "सिरिंज में फॉस्फेट बफर खारा के 150 μl ड्रा.
  2. इंजेक्शन के दौरान हर समय एक ईमानदार स्थिति में सिरिंज को बनाए रखने के लिए एक ही सिरिंज में 100 Panc02 के μl (2 X10 6) कोशिकाओं ड्रा.
  3. एक 70% इथेनॉल समाधान में सुई डुबकी. सुई बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए 70% इथेनॉल में डूबा हुआ है.
  4. सिरिंज हर समय ईमानदार रखा है सुनिश्चित किया जा रहा उजागर hemispleen में धीरे धीरे कोशिकाओं इंजेक्षन. syrin का उठावजीई तिल्ली के तहत कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने से बचने के लिए प्लीहा कैप्सूल के माध्यम से हर समय मनाया जाना चाहिए. तिल्ली और रक्त वाहिकाओं के एक whitening इंजेक्शन पर मनाया जाना चाहिए.
  5. तिल्ली तरक्की और प्लीहा रक्त वाहिकाओं रोक देना तिल्ली के तहत एक मध्यम क्षितिज क्लिप लागू होते हैं.
  6. अग्न्याशय और प्लीहा जहाजों के सबसे बाहर का पहलू पर एक छोटा सा क्षितिज क्लिप को लागू करें.
  7. क्षितिज क्लिप ऊपर काटने से hemispleen से अग्न्याशय और प्लीहा वाहिकाओं ligate.
  8. 'अपने पक्ष पर माउस प्लेस, और आसुत जल से चीरा सिंचाई.

संज्ञाहरण से 5 पेट की क्लोजर और रिकवरी

  1. 4-0 चल रहा सिलाई के साथ पेरिटोनियम बंद करें.
  2. त्वचा चीरा बंद दो से तीन त्वचा क्लिप को लागू करें.
  3. सर्जरी के बाद दर्द को कम करने के लिए 0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine या 5-10 मिलीग्राम / किग्रा Carprofen subcutaneously प्रशासन.
  4. आरईसी के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस रखेंओवरी मोबाइल तक और माउस नियमित श्वास पैटर्न को दर्शाता है. पशु केवल पूरी तरह से शल्य प्रक्रिया से उबरने के बाद दूसरे जानवरों की कंपनी को लौट रहे हैं.

6 Necropsy परीक्षा और लिवर की कटाई

  1. सर्जरी के बाद 30 से 60 दिनों के बीच, चूहों मेटास्टेसिस के नैदानिक ​​लक्षण दिखाने के लिए शुरू हो जाएगा और इच्छामृत्यु की आवश्यकता होगी. मानवीय इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है मेटास्टैटिक रोग के लक्षण बढ़े हुए पेट और जलोदर का विकास शामिल है. सीओ 2 की साँस लेना द्वारा चूहों euthanize.
  2. साँस लेना के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं.
  3. पशु उत्तरदायी गैर होने के लिए निर्धारित किया गया है के बाद, कैंची का उपयोग पेट को बेनकाब करने के लिए पेरिटोनियम के माध्यम से एक चीरा बनाने.
  4. संदंश और कैंची का प्रयोग, धीरे पेट से बाहर जिगर काटा.
  5. अक्टूबर परिसर में जिगर, जगह और फ़्लैश तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए फ्रीज. -80 डिग्री सेल्सियस पर जिगर स्टोर. वैकल्पिक रूप से, लाइवआर एम्बेडेड 24 घंटा और तेल के लिए आरटी पर 16% तटस्थ बफर formalin में तय किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hemispleen में इंजेक्शन Panc02 ट्यूमर कोशिकाओं तकनीक सही ढंग से किया जाता है तो फेफड़ों और पेरिटोनियल मेटास्टेसिस नहीं मनाया जाता है, जबकि चित्रा (1) चूहों की 100% में फार्म जिगर metastases,. इस तकनीक को कई स्वतंत्र प्रयोगों में Panc02 कोशिकाओं का उपयोग कर एक सौ से अधिक चूहों पर किया गया है, और reproducibly, सभी अनुपचारित चूहों hemisplenectomy प्रक्रिया (चित्रा 2) के बाद 30 और 60 दिनों के बीच यकृत मेटास्टेसिस के साथ मर जाते हैं. इलाज और इलाज समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए, समूह प्रति दस चूहों की जरूरत है. हालांकि, इस नंबर का इस्तेमाल किया सेल लाइन और उपचार योजना के संबंध में अलग अलग होंगे. Panc02 कोशिकाओं इस मॉडल में उपयोग किया जाता है, कई जिगर metastases necropsy (चित्रा 3) पर देखा जा सकता है.

ऊतक विशेष क्रास और P53 होने ट्रांसजेनिक चूहों से ली गई एक syngeneic अग्नाशय के ट्यूमर सेल लाइन हैं जो KPC ट्यूमर कोशिकाओं, तोड़े मेंम्यूटेशन 11, भी इस मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह जिगर metastases में इन कोशिकाओं परिणामों का उपयोग (चित्रा 4). एक अलग सेल लाइन का उपयोग कर जिगर मेटास्टेसिस गठन का मूल्यांकन करते समय सभी अनुपचारित चूहों यकृत मेटास्टेसिस विकसित बहरहाल, जब तक, इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या titrated किया जाना चाहिए. Panc02 कोशिकाओं सर्जरी सही ढंग से प्रदर्शन किया गया था कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. जिगर metastases और अस्तित्व के गठन की हद तक एक प्रयोग के भीतर इस्तेमाल सेल लाइन, के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, जबकि महत्वपूर्ण बात है,, सभी अनुपचारित चूहों एक समान बोझ में जिगर metastases के विकास और reproducibly समय की एक छोटी अवधि के भीतर इन मेटास्टेसिस से मर जाते हैं. इस तकनीक का उपयोग करते हैं, इसलिए, अल्ट्रासाउंड द्वारा ट्यूमर बोझ को सामान्य बनाने के लिए आवश्यक नहीं है.

विफलता प्रक्रिया ठीक से प्रदर्शन नहीं किया गया था कि संकेत हो सकता है जो necropsy पर एक सामान्य दिखने जिगर, में यकृत मेटास्टेसिस परिणाम उत्पन्न करने के लिए. हालांकि, विफल रही है या डीमेटास्टेसिस के elayed गठन लंबे समय तक अस्तित्व में है, जिसके परिणामस्वरूप को दबाने या metastatic विकास को बाधित कि चिकित्सा (चित्रा 5) के साथ इलाज के बाद हो सकता है. इसलिए, इस मॉडल ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस के गठन पर विभिन्न चिकित्सीय एजेंटों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

यह अल्ट्रासाउंड से जिगर का मूल्यांकन करने के लिए तकनीकी रूप से संभव है, क्योंकि एक छोटे जानवर अल्ट्रासाउंड (चित्रा 6) 12 जिगर में मेटास्टेसिस के vivo गठन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, मेटास्टेसिस के गठन आगे necropsy (चित्रा 7) निम्नलिखित ऊतकविकृतिविज्ञानी द्वारा जांच की जा सकती.

चित्रा 1
प्रयोग किया जाता है जो hemisplenectomy मॉडल चित्रा 1 योजनाबद्ध,Panc02 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ अग्नाशय यकृत मेटास्टेसिस बनाने के लिए.

चित्रा 2
C57BL / 6 चूहों की चित्रा 2 प्रतिनिधि अस्तित्व 0 दिन पर Panc02 hemisplenectomy के दौर से गुजर के बाद (n = 10). इस मॉडल में Panc02 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों सब के बाद 30 और 60 दिनों के बीच मर जाएगा कापलान-Meier वक्र में दिखाया गया है प्रक्रिया विरोधी नियोप्लास्टिक उपचारों प्रशासित नहीं कर रहे हैं.

चित्रा 3
Hemispleen में Panc02 कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद जिगर की चित्रा 3 सकल परीक्षा जिगर metastases पता चलता है (इंडिकातीर द्वारा टेड). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
Hemispleen में KPC ट्यूमर कोशिकाओं के hemispleen इंजेक्शन के बाद जिगर की चित्रा 4 सकल परीक्षा सामान्य यकृत पैरेन्काइमा (सफेद तीर) की जगह है कि यकृत मेटास्टेसिस (काला तीर) से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5 >
प्रभावी चिकित्सीय हस्तक्षेप के बाद जिगर के 5 चित्रा सकल परीक्षा. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6 hemisplenectomy प्रक्रिया के बाद जिगर (काला तीर) में एक बड़ी मेटास्टैटिक घाव के साथ एक माउस पर एक Vevo 660 छोटे पशु अल्ट्रासाउंड का उपयोग लिवर अल्ट्रासोनोग्राफी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ig7highres.jpg "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 51677 / 51677fig7.jpg "/>
7 चित्रा hemisplenectomy मॉडल में Panc02 कोशिकाओं द्वारा गठित आयल एम्बेडेड जिगर metastases के एच ई धुंधला हो जाना. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक hemispleen इंजेक्शन तकनीक के माध्यम से जिगर को अग्नाशय के कैंसर मेटास्टेसिस के इस preclinical murine मॉडल जिगर को metastatic रोग के साथ रोगियों के नैदानिक ​​और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्थितियों के कई दर्पण है कि वर्णित पहला मॉडल है. इस मॉडल को अन्य murine मॉडल पर कई लाभ प्रदान करता है. चूहों का केवल 30% जिगर और मेटास्टेसिस गठन के समय से मेटास्टेसिस जो विकास में अग्नाशय कैंसर की ट्रांसजेनिक मॉडल काफी परिवर्तनशील है के विपरीत पहले, इस मॉडल एक पर चूहों की 100% में जिगर को लगातार प्राप्त करने मेटास्टेसिस का लाभ प्रदान करता है वर्दी समय, शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए इस सेटिंग में मेटास्टैटिक रोग अध्ययन करने के लिए. साथ ही, इस मॉडल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल में परिधीय रक्त प्रतिरक्षा विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए एक अनुभवहीन hemispleen बरकरार रखती है. इसके अलावा, विरोधी नियोप्लास्टिक चिकित्सा के अभाव में, चूहों प्रारंभिक ट्यूमर लोड के आधार पर एक सुसंगत समय बिंदु पर ट्यूमर प्रगति से मर जाते हैं, और अस्तित्व के अनुरूप हैएक प्रयोग से अगले करने के लिए. अंत में, इस मॉडल जिगर मेटास्टेसिस 13, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी 10, और प्रायोगिक चिकित्सा परीक्षण 9 का अध्ययन सहित आवेदन की एक किस्म है.

इस तकनीक का महत्वपूर्ण कदम सेल निलंबन की तैयारी, ट्यूमर सेल इंजेक्शन, क्षितिज क्लिप की नियुक्ति, और त्वचा क्लिप की नियुक्ति कर रहे हैं. एक सफल सर्जरी सुनिश्चित करने और परिणाम की संभावित skewing से बचने के लिए महत्वपूर्ण कदम के निम्न संशोधन आवश्यक हो सकता है. सबसे पहले, सेल निलंबन की तैयारी के दौरान, यह कोशिकाओं का एक भी निलंबन प्राप्त और hemispleen में इंजेक्ट किया कि जरूरी है. ट्यूमर कोशिकाओं के माइनर clumping प्लीहा वाहिकाओं रोक देना और सर्जरी के दौरान अकाल मृत्यु का परिणाम देगा. यह एक declumping एजेंट में कोशिकाओं resuspending द्वारा और तुरंत इंजेक्शन के लिए पहले इंजेक्शन के लिए प्रत्येक सिरिंज तैयारी से बचा जा सकता है. साथ ही, की तैयारी के दौरानसिरिंज, यह कोशिकाओं नहीं फॉस्फेट बफर खारा फ्लश के साथ मिश्रण आवश्यक है. यह पहला फॉस्फेट बफर खारा ड्राइंग और फिर बहुत धीरे धीरे हर समय एक ईमानदार स्थिति में सिरिंज को बनाए रखने, मिश्रण से बचने के लिए कोशिकाओं ड्राइंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. दूसरा, ट्यूमर सेल इंजेक्शन चरण के दौरान, सिरिंज का उठाव तिल्ली के तहत कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने से बचने के लिए प्लीहा कैप्सूल के माध्यम से हर समय मनाया जाना चाहिए. तिल्ली और रक्त वाहिकाओं के एक whitening ट्यूमर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक तिल्ली में इंजेक्शन दिया गया है कि जो इंगित करता है, इंजेक्शन पर मनाया जाना चाहिए. छोटे spleens साथ युवा चूहों में, यह तिल्ली से लीक जोखिम से फ्लश कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. किसी भी लीक संदिग्ध है, उनके पक्ष में चूहों रखना और इंजेक्शन चरण के दौरान लीक हो सकता है कि किसी भी कोशिकाओं को हटाने में मदद करने के लिए चूहों suturing से पहले आसुत जल से तिल्ली धो लो. परिणाम होगा कि इन कोशिकाओं को दूर करने में विफलतापर्याप्त मेटास्टेसिस को प्राप्त करने के लिए मौत से पहले कारण हो सकता है जो इंजेक्शन साइट पर ट्यूमर के विकास में. तीसरा, hemispleen तहत क्षितिज क्लिप की नियुक्ति hemispleen को निकालने के बाद कोई खून बह रहा है कि सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. अतिरिक्त क्षितिज क्लिप आवश्यक रूप वाहिकाओं रोक देना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक की अंतिम महत्वपूर्ण कदम त्वचा क्लिप का स्थान है. चूहों के अस्तित्व के लिए निम्नलिखित जा रहा है, बल्कि यह त्वचा क्लिप का उपयोग करने से चूहों की त्वचा सीवन के लिए आवश्यक हो सकता है. कभी कभी, त्वचा क्लिप संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील चूहों प्रदान सकता है जो त्वचा के घाव से भरा चिकित्सा, करने से पहले गिर जाएगा. त्वचा की suturing, इस समस्या को रोकने जाएगा, पेरिटोनियम से अलग.

इस तकनीक मेटास्टैटिक प्रक्रिया और metastatic रोग के अध्ययन के लिए अमूल्य है, इस मॉडल कुछ सीमाएँ हैं. सबसे पहले, इस मॉडल की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रकृति यह ट्रांसजेनिक और orthotopi अधिक पसंद बनाता हैमेटास्टैटिक प्रक्रिया और मेटास्टैटिक स्थलों पर ट्यूमर microenvironment के अध्ययन के लिए सी मॉडल. हालांकि, क्योंकि मॉडल की प्रकृति के कारण, मेटास्टैटिक प्रक्रिया, तरल पदार्थ का स्त्राव और उपनिवेशवाद के केवल अंतिम कदम है, का अध्ययन किया जा सकता है. इस पूरे मेटास्टैटिक प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल की उपयोगिता की सीमा और ट्यूमर कोशिकाओं के intravasation उत्तेजित कि संकेतों में जांच के लिए अनुमति नहीं है. यह hemispleen के आधे बनाए रखने के द्वारा इन चूहों में पूर्ण प्रतिरक्षा समारोह को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि दूसरा, जिगर में लिम्फोसाइटों का विश्लेषण एक पक्षपाती प्रतिनिधित्व में परिणाम सकता है जो ट्यूमर microenvironment, से दोनों सामान्य जिगर से लिम्फोसाइटों के साथ ही लिम्फोसाइटों शामिल ट्यूमर microenvironment भीतर सच प्रतिरक्षा स्थिति की. जिगर को और अधिक व्यापक मेटास्टेसिस के लिए नेतृत्व कि अधिक आक्रामक ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग मॉडल की इस सीमा को पार करने में मदद कर सकता है. मेटास्टेसिस necropsy पर दिखाए जा रहे हैं इसके अतिरिक्त, यदि यह संभव हो सकता हैई सामान्य जिगर से मेटास्टेसिस काटना और ही आगे इस समस्या circumventing मेटास्टेसिस में पाया लिम्फोसाइटों का विश्लेषण करने के लिए. इस मॉडल को कई नुकसान है, जबकि सारांश में, यह भी अन्य मॉडलों पर कई लाभ प्रदान करता है और इसलिए जिगर को metastatic रोग का अध्ययन करते समय इन मॉडलों के पूरक इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई प्रासंगिक संघर्ष किया है.

Acknowledgements

KF और KO एस के साथ पहली लेखकों सह रहे हैं

इस काम AHPBA फैलोशिप (एस), एनआईएच K23 CA148964-01 (LZ), चिकित्सा जॉन्स हॉपकिंस स्कूल नैदानिक ​​वैज्ञानिक पुरस्कार (LZ), Viragh फाउंडेशन और जॉन्स हॉपकिंस पर छोड़ें Viragh अग्नाशय के कैंसर केंद्र (EMJ और द्वारा समर्थित किया गया था LZ), राष्ट्रीय अग्न्याशय फाउंडेशन (LZ), Lefkofsky परिवार फाउंडेशन (LZ), गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर P50 CA062924 में NCI बीजाणु (EMJ, LZ), Lustgarten फाउंडेशन (LZ), और सोल गोल्डमैन अग्नाशय के कैंसर केंद्र के अनुदान (KS , BHE, LZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture media and components will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline Gibco by Life Technologies 10010-023
15 ml centrifuge tubes Corning 430052
Curved Operating Scissor Roboz Surgical Store RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps Roboz Surgical Store RS-5130
Needle holder (regular) World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled Teleflex 137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled Teleflex 237115
Weck Horizon medium ligating clips Teleflex 002200
Weck Horizon small ligating clips Teleflex 001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip Becton Dickinson 309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip Becton Dickinson 309597
9 mm Autoclip Applier Mikron 427630
9 mm Autoclip Becton Dickinson 427631
Heating pad Sunbeam CAT93
70% Ethanol sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride  Hospira 22395DD
Xylazine hydrochloride Sigma X1251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. Atlanta. (2013).
  2. Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
  3. Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
  4. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
  5. Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
  6. Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
  7. Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
  8. Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
  9. Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
  10. Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
  11. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
  12. Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
  13. Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390 (2011).

Comments

6 Comments

  1. Thank you for your video and method. A small confusion, we draw up PBS first and then draw up tumor cells slowly to avoid mixing , but why mixing is needed to be avoided? What is the purpose of this step? If tumor cells mix with PBS in the syringe, what will happen? First PBS second tumor cells, so when we inject into the spleen, tumor cells will be sent into the spleen first, why we need to inject 150ul PBS?(This time the tumor cells have already been injected). Look forward to hearing from you! Regards!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 18, 2016 - 4:28 PM
  2. The purpose of the PBS flush is to push the cells that were injected into the spleen into the liver by way of the splenic vasculature. If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few, if any, hepatic metastases will develop. If the PBS flush is performed correctly, all of the tumor cells will be flushed into the liver, which will also help reduce mouse-to-mouse variability and ensure that roughly the same number of cells make it to the liver to develop hepatic metastases. I hope this helps to clarify.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 18, 2016 - 4:58 PM
  3. It's very useful! And one more thing pls, "If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few", why do mice die when tumor cells colonize? Thank you for replying!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 19, 2016 - 9:32 AM
  4. The mice will die prematurely because the tumors will grow very quickly, so the mice will die from the large tumors.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 20, 2016 - 3:16 PM
  5. This is not my field of expertise so please excuse my ignorance. What is the purpose of using this hemisplenectomy injection technique instead of injecting into the entire spleen and leaving it intact? Is it due to the aggressiveness of these cancer cells? Do you think this surgery is necessary when injecting agents other than tumor cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 21, 2017 - 12:13 PM
  6. If the spleen is injected, left intact and in situ, tumor growth will then occur in the spleen instead of being limited to liver only disease. I can not speak to agents other than tumor cells. This model was designed as aa preclinical, murine tumor model of hepatic metastases.

    Reply
    Posted by: Kevin S.
    June 22, 2017 - 9:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics