Et præklinisk musemodel af levermetastaser

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En prækliniske murin model af levermetastaser udføres via en hemispleen injektionsteknik.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Soares, K. C., Foley, K., Olino, K., Leubner, A., Mayo, S. C., Jain, A., Jaffee, E., Schulick, R. D., Yoshimura, K., Edil, B., Zheng, L. A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases. J. Vis. Exp. (91), e51677, doi:10.3791/51677 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Talrige murine modeller er blevet udviklet til at studere humane cancere og fremme forståelsen af ​​kræftbehandlingen og udvikling. Her er et præklinisk, murin pancreas tumor model af levermetastaser via en hemispleen injektion af syngene murine pancreas tumorceller beskrevet. Denne model efterligner mange af de kliniske tilstande i patienter med metastatisk sygdom i leveren. Mus stadighed at udvikle metastaser i leveren giver mulighed for undersøgelse af den metastatiske proces, eksperimentel afprøvning terapi, og tumor immunologi forskning.

Introduction

Pancreas ductal adenokarcinom (PDA) er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA 1. De fem års overlevelse for patienter med metastatisk PDA er 2-12% 1. Selvom adjuverende og neoadjuverende kemoterapi for kræft i bugspytkirtlen er mere effektiv i dag end nogensinde før, er der stadig et desperat behov for nye behandlingsformer.

Udviklingen af ​​nye lægemidler nødvendiggør pålidelige prækliniske dyremodeller. Selv subkutane tumormodeller er ligetil at bruge, ulemper indbefatter den manglende evne af disse tumorer til at metastasere og efterligne tumorprogression og mikromiljøer ses i humane cancere. Gensplejsede modeller, såsom gensplejsede mus indeholdende Kras og p53 knock-i onkogene mutationer (KPC modellen) 2 og KPC model med YFP afstamning sporstof (den PKCY modellen) 3 giver mulighed for undersøgelse af naturligt forekommende tumorer i immunocompetent mus. Derudover tumormikromiljøet er uændret og mere ligner den, der ses i human tumorudvikling. Desværre er timingen af ​​tumor udvikling variable inden for disse modeller, hvilket gør det svært at studere forsøgsbehandlinger. Derudover tilbagekrydsning af disse mus kræver en betydelig mængde tid og finansiel forpligtelse, hvilket ikke altid er muligt. Endelig nødvendiggøre implanterede xenograft PDA musemodeller immunkompromitterede mus, der har ændret eller fraværende tumor mikromiljøer. Som et resultat, effekten af forsøgsbehandlinger påvist i disse prækliniske modeller er ofte ikke reproduceres i humane kliniske forsøg 4.

Denne hemisplenectomy musemodel udnytter Panc02 tumorceller, og som er en meget tumorigen, methylcholanthren induceret pankreatisk tumor cellelinie afledt fra C57BL / 6 mus 5, 6. Derudover andre murine PDA cellelinier afledt fra KPC mikrofone kan anvendes i denne model. Schulick et al. Har tidligere udviklet en hemisplenectomy teknik og skabt en syngen musemodel for tyktarmskræft metastaser 7. Denne hemisplenectomy model (Figur 1) tilbyder konsekvent og lige tumorinokulation i immunkompetente mus udlån sig til undersøgelse af nye terapeutiske midler 7-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care og brug Udvalg for Johns Hopkins University, og dyrene blev holdt i overensstemmelse med retningslinjerne i Sammenslutningen for vurdering og akkreditering af Laboratory Care (AAALAC). Den kirurgiske procedure udføres under sterile betingelser i en operationsstue, der gennemgår mindst femten luftudskiftninger timen. Alle instrumenter steriliseres ved autoklavering forud for proceduren og igen med 70% ethanol i mellem hver mus under proceduren. Alle mus, der ikke forventes at overleve det kirurgiske indgreb aflives under CO2 i 3 minutter efterfulgt af cervikal dislokation, mens den stadig under anæstesi.

1. Celle Fremstilling

  1. Resuspender dyrkede Panc02 celler i phosphatbufret saltvand ved 2 x10 7 celler / ml, og holde på is.

2. Mus Forberedelse

  1. Administrer ketamine (100 mg / kg) blandet med xylazin (10 mg / kg) intraperitonealt til 8-12 uger gamle C57BL / 6 hunmus i doser.
  2. Kontroller at se, at tåen tilbagetrækning knivspids refleks afskaffes for at sikre, at musen er fuldt bedøvet.
  3. Administrere yderligere doser af ketamin (100 mg / kg) blandet med xylazin (10 mg / kg) som nødvendig for fuldt ud at bedøve musene.
  4. Påfør Puralube Vet salve til øjnene af mus for at forhindre udtørring, mens musene er under anæstesi.
  5. Barber det kirurgiske område af mus for at undgå forurening af såret.
  6. Prep venstre subcostal område af snittet med 70% ethanol og derefter iod.
  7. Placer en operationsafdækningsstykke omkring maven til at opretholde sterilitet.

3. Laparotomi

  1. Lav en venstre subcostal indsnit i overensstemmelse med den venstre øre gennem huden og gennem bughinden hjælp af en skalpel.
  2. Udtryk milten gennem snittet ved at anvende simultan digital pUdsugning langs kranie og caudale aspekter af incisionen.
  3. Find de milt blodkar på ringere ende af milten.
  4. Divider milten ved at placere to Horizon mellemstore ligaturklemmer i midten af ​​milten være omhyggelig med at undgå at beskadige milten blodkar på milt poler.
  5. Anbring den øverste pol af milten tilbage i peritoneum for at undgå forurening.

4. tumorinjektion

  1. Udarbejde 150 ul phosphatpufret saltvand ind i en 26 G x 5/8 "sprøjte.
  2. Tegn op til 100 pi Panc02 (2 x10 6) celler i den samme sprøjte fastholde sprøjten i en oprejst stilling på alle tidspunkter under injektionen.
  3. Dyp nål i en 70% ethanolopløsning. Nålen er dyppet i 70% ethanol for at sikre sterilitet.
  4. Injicer cellerne langsomt ind i den udsatte hemispleen være sikker på, at sprøjten holdes oprejst på alle tidspunkter. Facet af syrinGE skal overholdes på alle tidspunkter gennem miltkapslen at undgå indsprøjtning af cellerne under milten. En kridtning af milten og blodkar skal overholdes ved injektion.
  5. Løft milt og anvende et medie Horizon klip under milten at occlude milt blodkar.
  6. Påfør en lille Horizon klip til den mest distale aspekt i bugspytkirtlen og milt fartøjer.
  7. Ligere bugspytkirtlen og milt fartøjer fra hemispleen ved at skære over horisonten klip.
  8. Anbring musen på dets 'side, og skylles indsnit med destilleret vand.

5. abdominal lukning og Recovery fra anæstesi

  1. Luk bughinden med en 4-0 kørende søm.
  2. Påfør 2-3 hudclips at lukke hudincision.
  3. Dosis er 0,1 mg / kg buprenorphin eller 5-10 mg / kg Carprofen subkutant at lindre post operative smerter.
  4. Placer musen på en varmepude til recOvery indtil mobil og musen demonstrerer regelmæssige vejrtrækning mønstre. Dyrene kun returneres til selskab med andre dyr efter returnere fra den kirurgiske procedure.

6. Obduktion Undersøgelse og Høst af leveren

  1. Mellem 30 til 60 dage efter operationen, vil mus begynde at vise kliniske symptomer på metastaser og vil kræve eutanasi. Tegn på metastatisk sygdom, der kræver human dødshjælp omfatter forstørrede underliv og udvikling af ascites. Aflive mus ved indånding af CO 2.
  2. Efter inhalation, udføre halsdislokation.
  3. Efter at dyret er blevet bestemt til at være ikke lydhør, lave et snit gennem bughinden at eksponere maven med en saks.
  4. Brug pincet og saks, forsigtigt skåret leveren ud af maven.
  5. Placer leveren i OCT-forbindelse, og flash fryse hjælp af flydende kvælstof. Opbevar leveren ved -80 ° C. Alternativt levender kan fikseres i 16% neutral pufret formalin ved stuetemperatur i 24 timer og paraffinindlejret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Panc02 tumorceller injiceret i hemispleen (Figur 1) formular levermetastaser i 100% af musene, mens lunge og peritoneale metastaser ikke overholdes hvis teknikken udføres korrekt. Denne teknik er blevet udført på over hundrede mus under anvendelse Panc02 celler i flere uafhængige eksperimenter og reproducerbart, alle ubehandlede mus dør med levermetastaser mellem 30 og 60 dage efter hemisplenectomy procedure (figur 2). For at opnå statistisk signifikans mellem de ubehandlede og behandlede grupper er der behov for ti mus pr gruppe. Imidlertid vil dette antal variere med hensyn til cellelinie og behandling ordningen anvendes. Når Panc02 celler anvendes i denne model, kan flere levermetastaser ses efter obduktion (figur 3).

KPC tumorceller, som er en syngen pancreatisk tumor cellelinje afledt fra transgene mus med vævsspecifik Kras og p53 knock-imutationer 11, kan også anvendes i denne model. Ved hjælp af disse celler resulterer i tilsvarende levermetastaser (figur 4). Men når evaluering levermetastaser dannelse ved hjælp af en anden cellelinie, antallet af injicerede celler bør titreres indtil alle ubehandlede mus udvikler levermetastaser. Panc02 celler kan anvendes som en positiv kontrol for at sikre, at operationen udføres korrekt. Vigtigere er det, medens omfanget af dannelsen af ​​levermetastaser og overlevelse kan variere afhængigt af den cellelinie, i et eksperiment, alle ubehandlede mus udvikle levermetastaser ved en lignende byrde og dø af disse metastaser reproducerbart inden for et kort tidsrum. Derfor normalisering af tumorbyrde ved ultralyd er ikke nødvendigt, når du bruger denne teknik.

Manglende fremkalde levermetastase resulterer i et normalt udseende lever ved obduktion, hvilket kan indikere, at proceduren ikke blev udført korrekt. Imidlertid mislykkedes eller delayed dannelse af metastaser kan resultere efter behandling med behandlinger, der hæmmer eller hæmmer metastatisk vækst (Figur 5), hvilket resulterer i forlænget overlevelse. Derfor kan denne model bruges til at vurdere effekterne af forskellige terapeutiske midler på tumorvækst og dannelsen af ​​metastaser.

Fordi det er teknisk muligt at evaluere leveren ved ultralyd, et lille dyr ultralyd (figur 6) 12 kan anvendes til at vurdere in vivo-dannelsen af metastaser i leveren. Desuden kan dannelsen af metastaser undersøges yderligere ved histopatologi efter obduktion (figur 7).

Figur 1
Figur 1. Skematisk af hemisplenectomy model, som anvendesat skabe pancreas levermetastaser med Panc02 tumorceller.

Figur 2
Figur 2. repræsentant overlevelse C57BL / 6 mus efter undergår Panc02 hemisplenectomy på dag 0 er vist i Kaplan-Meier-kurve (n = 10). Mus injiceret med Panc02 tumorceller i denne model vil alle dø mellem 30 og 60 dage efter procedure, hvis antineoplastisk terapier er ikke administreres.

Figur 3
Figur 3. Gross undersøgelse af leveren efter injektion af Panc02 celler i hemispleen afslører levermetastaser (indicated med pile). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Brutto undersøgelse af leveren efter hemispleen injektion af KPC tumorceller i hemispleen afslører levermetastaser (sorte pile), som erstatter den normale hepatiske parenkym (hvid pil). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 >
Figur 5. Brutto undersøgelse af leveren efter en effektiv terapeutisk indgriben. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Lever ultralydsundersøgelse ved hjælp af en Vevo 660 lille dyr ultralyd på en mus med et stort metastatisk læsion i leveren (sort pil) efter hemisplenectomy procedure. Klik her for at se en større version af dette tal.

ig7highres.jpg "src =" / filer / ftp_upload / 51677 / 51677fig7.jpg "/>
Figur 7. H & E farvning af paraffin indlejret levermetastaser dannet af Panc02 celler i hemisplenectomy modellen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne prækliniske murin model af pancreascancer metastaser til leveren via en hemispleen injektionsteknik er den første model, der er beskrevet som afspejler mange af de kliniske og immunologiske tilstande hos patienter med metastatisk sygdom til leveren. Denne model giver flere fordele frem for andre murine modeller. Først, i modsætning til transgene modeller af bugspytkirtelkræft, hvor kun 30% af musene udvikler metastaser til leveren og timingen af ​​metastaser dannelse er ganske variabel, denne model giver den fordel, konsekvent få metastaser til leveren i 100% af musene ved en ensartet tid, muligt for forskerne at studere metastatisk sygdom i denne indstilling. Derudover bevarer denne model en naiv hemispleen at muliggøre perifert blod immun analyse på en reproducerbar model. Endvidere, i fravær af anti-neoplastiske behandling, mus dør fra tumorprogression på en konsekvent tidspunkt afhængigt af den oprindelige tumor belastningen og overlevelse er i overensstemmelsefra et eksperiment til det næste. Endelig er denne model har en bred vifte af applikationer, herunder studiet af levermetastaser 13 tumorimmunologi 10 og eksperimentel terapi test 9.

De kritiske trin af denne teknik er fremstillingen cellesuspensionen tumorcellen injektion placeringen af ​​Horizon klip, og placeringen af ​​hudclips. For at sikre en vellykket operation og undgå potentiel skævvridning af resultaterne, kan følgende ændringer af de kritiske trin være nødvendigt. Først er det under cellesuspension forberedelse bydende nødvendigt, at der opnås en enkelt suspension af celler og injiceret i hemispleen. Mindre sammenklumpning af tumorceller vil occlude milt skibe og resultere i for tidlig død under operationen. Dette kan undgås ved at resuspendere cellerne i et declumping middel og ved at fremstille hver sprøjte til injektion umiddelbart før injektionen. Desuden blev der i udarbejdelsen afsprøjte, er det bydende nødvendigt, at cellerne ikke blandes med phosphatbufret saltvand flush. Dette kan opnås ved først at udarbejdelsen af ​​phosphatbufret saltvand og derefter meget langsomt udarbejdelsen af ​​celler for at undgå blanding, opretholdelse sprøjten i en oprejst stilling på alle tidspunkter. For det andet, under injektion trin tumorcellen, facet af sprøjten skal overholdes på alle tidspunkter gennem miltkapslen at undgå indsprøjtning af cellerne under milten. En blegning af milt og blodkar skal overholdes ved injektion, hvilket indikerer, at tumorcellerne er blevet injiceret i milten. I yngre mus med mindre milt, kan det være nødvendigt at injicere et mindre volumen af ​​flush end risiko cellerne siver ud fra milten. Hvis der er mistanke lækker, lægge mus på deres side og vask milten med destilleret vand før suturering mus for at hjælpe med at fjerne eventuelle celler, der kan have lækket under trin injektionen. Manglende fjernelse af disse celler vil resulterei tumorvækst på injektionsstedet, som kan forårsage døden inden på at opnå tilstrækkelig metastaser. Tredje placering af Horizon klip under hemispleen er vigtigt for at sikre, at der ikke er nogen blødning efter fjernelse af hemispleen. Yderligere Horizon clips kan anvendes til at okkludere fartøjer som nødvendigt. Det endelige kritiske trin af denne teknik er placeringen af ​​hudclips. Hvis musene bliver følgende for overlevelse, kan det være nødvendigt at suturere musenes hud snarere end ved hjælp hudclips. Lejlighedsvis vil hudclips falde forud for fuld heling af hudsår, som kunne gøre mus modtagelige for infektion. Sutur af huden, adskilt fra peritoneum, vil forhindre dette problem.

Selv om denne teknik er uvurderlig for at studere den metastatiske proces og metastatisk sygdom, denne model har et par begrænsninger. Først reproducerbar karakter af denne model gør det foretrækkes frem transgene og orthotopic modeller for at studere den metastatiske proces og tumormikromiljøet på steder med metastaser. Men på grund af arten af ​​modellen, kun de sidste trin i den metastatiske proces ekstravasation og kolonisering, kan studeres. Dette begrænser anvendeligheden af ​​denne model til at studere den fulde metastatisk proces, og ikke giver mulighed for undersøgelse af de signaler, der stimulerer intravasation af tumorceller. For det andet, mens det er vigtigt at bevare fuld immunfunktionen hos disse mus ved at beholde halvdelen af ​​hemispleen analyse af lymfocytter i leveren omfatter både lymfocytter fra normal lever samt lymfocytter fra tumormikromiljøet, hvilket kan resultere i en skæv repræsentation af den sande immunstatus i tumormikromiljøet. Brugen af ​​mere aggressiv tumor cellelinier, der fører til mere omfattende metastaser til leveren kan hjælpe med at overvinde denne begrænsning af modellen. Desuden, hvis metastaserne visualiseres ved obduktion, kan det være possible for at dissekere metastaser fra normal lever og analysere kun lymfocytterne fundet i metastaser yderligere omgår dette problem. Sammenfattende mens denne model har flere ulemper, det giver også mange fordele i forhold til andre modeller, og bør derfor anvendes supplere disse modeller, når man studerer metastatisk sygdom til leveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen relevante interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgements

KF og KO er co første forfattere sammen med KS

Dette arbejde blev støttet delvist af AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Klinisk Forsker Award (LZ), Virágh Foundation og Spring Virágh Bugspytkirtelkræft Center på Johns Hopkins (EMJ og LZ), National Bugspytkirtel Foundation (LZ), Den Lefkofsky Family Foundation (LZ), NCI SPORE i Mave Kræft P50 CA062924 (EMJ, LZ), den Lustgarten Foundation (LZ) og Sol Goldman Bugspytkirtelkræft os stipendier (KS , BHE, LZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture media and components will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline Gibco by Life Technologies 10010-023
15 ml centrifuge tubes Corning 430052
Curved Operating Scissor Roboz Surgical Store RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps Roboz Surgical Store RS-5130
Needle holder (regular) World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled Teleflex 137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled Teleflex 237115
Weck Horizon medium ligating clips Teleflex 002200
Weck Horizon small ligating clips Teleflex 001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip Becton Dickinson 309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip Becton Dickinson 309597
9 mm Autoclip Applier Mikron 427630
9 mm Autoclip Becton Dickinson 427631
Heating pad Sunbeam CAT93
70% Ethanol sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride  Hospira 22395DD
Xylazine hydrochloride Sigma X1251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. Atlanta. (2013).
  2. Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
  3. Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
  4. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
  5. Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
  6. Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
  7. Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
  8. Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
  9. Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
  10. Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
  11. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
  12. Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
  13. Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390 (2011).

Comments

6 Comments

  1. Thank you for your video and method. A small confusion, we draw up PBS first and then draw up tumor cells slowly to avoid mixing , but why mixing is needed to be avoided? What is the purpose of this step? If tumor cells mix with PBS in the syringe, what will happen? First PBS second tumor cells, so when we inject into the spleen, tumor cells will be sent into the spleen first, why we need to inject 150ul PBS?(This time the tumor cells have already been injected). Look forward to hearing from you! Regards!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 18, 2016 - 4:28 PM
  2. The purpose of the PBS flush is to push the cells that were injected into the spleen into the liver by way of the splenic vasculature. If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few, if any, hepatic metastases will develop. If the PBS flush is performed correctly, all of the tumor cells will be flushed into the liver, which will also help reduce mouse-to-mouse variability and ensure that roughly the same number of cells make it to the liver to develop hepatic metastases. I hope this helps to clarify.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 18, 2016 - 4:58 PM
  3. It's very useful! And one more thing pls, "If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few", why do mice die when tumor cells colonize? Thank you for replying!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 19, 2016 - 9:32 AM
  4. The mice will die prematurely because the tumors will grow very quickly, so the mice will die from the large tumors.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 20, 2016 - 3:16 PM
  5. This is not my field of expertise so please excuse my ignorance. What is the purpose of using this hemisplenectomy injection technique instead of injecting into the entire spleen and leaving it intact? Is it due to the aggressiveness of these cancer cells? Do you think this surgery is necessary when injecting agents other than tumor cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 21, 2017 - 12:13 PM
  6. If the spleen is injected, left intact and in situ, tumor growth will then occur in the spleen instead of being limited to liver only disease. I can not speak to agents other than tumor cells. This model was designed as aa preclinical, murine tumor model of hepatic metastases.

    Reply
    Posted by: Kevin S.
    June 22, 2017 - 9:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics