Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

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Summary

Un modèle murin de métastases hépatiques préclinique réalisée par une technique d'injection de hemispleen.

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Soares, K. C., Foley, K., Olino, K., Leubner, A., Mayo, S. C., Jain, A., Jaffee, E., Schulick, R. D., Yoshimura, K., Edil, B., Zheng, L. A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases. J. Vis. Exp. (91), e51677, doi:10.3791/51677 (2014).

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Abstract

De nombreux modèles murins ont été développées pour étudier les cancers humains et de faire progresser la compréhension du traitement du cancer et le développement. Ici, un modèle préclinique murin pancréas tumeur des métastases hépatiques par une injection de cellules syngéniques de hemispleen tumorales pancréatiques de souris est décrit. Ce modèle imite un grand nombre de conditions cliniques chez les patients ayant une maladie métastatique au foie. Souris développent constamment des métastases dans le foie qui permet d'observer le processus métastatique, les essais de thérapie expérimentale, et la recherche en immunologie tumorale.

Introduction

Canalaire pancréatique adénocarcinome (PDA) est la quatrième cause de décès liés au cancer aux États-Unis 1. La survie à cinq ans pour les patients atteints de PDA métastatique est 2-12% 1. Bien que la chimiothérapie adjuvante et néoadjuvante pour cancer du pancréas est plus efficace que jamais, il reste encore un besoin désespéré de nouvelles thérapies.

Le développement de nouveaux produits thérapeutiques requiert des modèles animaux précliniques fiables. Bien que les modèles de tumeurs sous-cutanées sont simples à utiliser, les inconvénients comprennent l'incapacité de ces tumeurs et de métastases imiter la progression de la tumeur et des microenvironnements vu dans les cancers humains. Des modèles génétiquement modifiés, tels que la souris transgénique contenant Kras et p53 knock-in mutations oncogéniques (le modèle KPC) 2 et le modèle KPC avec une lignée traceur YFP (le modèle de PKCY) 3 permettent l'étude des tumeurs d'origine naturelle dans immunocompetesouris NT. En outre, le micro-environnement de la tumeur n'est pas modifiée et ressemble plus étroitement à celle observée dans la progression tumorale humaine. Malheureusement, le calendrier de développement de la tumeur est variable dans ces modèles, ce qui rend difficile l'étude de thérapies expérimentales. En outre, le rétrocroisement de ces souris nécessite une quantité importante de temps et d'engagement financier, qui n'est pas toujours possible. Enfin, les modèles de xénogreffe de souris implantées PDA nécessitent du souris, qui ont modifié ou micro-environnements tumoraux absents immunodéprimés. Par conséquent, l'efficacité des thérapies expérimentales démontré dans plusieurs modèles précliniques sont souvent pas reproductible dans quatre essais cliniques humains.

Ce modèle de souris de hemisplenectomy utilise des cellules tumorales qui sont Panc02, une lignée cellulaire de tumeur hautement tumorigène induit par le méthylcholanthrène pancréatique provenant de souris C57BL / 6 5, 6. En outre, d'autres lignées cellulaires murines PDA dérivées de la micro KPCe peut être utilisé dans ce modèle. Schulick et al. Ont déjà mis au point une technique de hemisplenectomy et créé un modèle de souris syngéniques de métastases du cancer du côlon 7. Ce modèle de hemisplenectomy (figure 1) offre inoculation de la tumeur cohérent et égal chez les souris immunocompétentes se prêtant à la recherche de nouveaux agents thérapeutiques 7-10.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lignes directrices du soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université Johns Hopkins, et les animaux ont été maintenus en conformité avec les directives de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins de laboratoire (AAALAC). La procédure chirurgicale est effectuée dans des conditions stériles dans une salle d'opération qui est soumis à un minimum de quinze renouvellements d'air par heure. Tous les instruments sont stérilisés par autoclavage avant la procédure et à nouveau avec de l'éthanol à 70% entre chacune des souris au cours de la procédure. Toutes les souris qui ne devraient pas survivre à l'intervention chirurgicale sont euthanasiés sous CO 2 pendant 3 min puis par dislocation cervicale tout en restant sous anesthésie.

1 Préparation des cellules

  1. Remettre en suspension les cellules cultivées Panc02 dans un tampon phosphate salin à 2 x10 7 cellules / ml, et garder sur la glace.

2 Préparation de la souris

  1. Administrer la kétaminee (100 mg / kg) en mélange avec la xylazine (10 mg / kg) par voie intrapéritonéale à 8-12 semaines les souris C57BL / 6 de souris femelles en doses fractionnées.
  2. Vérifiez que la pointe retrait de pincement réflexe est aboli afin de s'assurer que la souris est totalement anesthésié.
  3. Administrer des doses supplémentaires de kétamine (100 mg / kg) en mélange avec xylazine (10 mg / kg) comme nécessaire pour anesthésier les souris complètement.
  4. Appliquer Puralube Vet onguent pour les yeux des souris pour éviter le dessèchement tandis que les souris sont sous anesthésie.
  5. Raser la région chirurgicale de la souris afin d'éviter la contamination de la plaie.
  6. Prep la région sous-costale gauche de l'incision avec 70% d'éthanol et de l'iode.
  7. Placez un drap chirurgical autour de l'abdomen pour maintenir la stérilité.

3. laparotomie

  1. Faire une incision sous-costale gauche en ligne avec l'oreille gauche à travers la peau et à travers le péritoine à l'aide d'un scalpel.
  2. Exprimez la rate à travers l'incision en appliquant p numérique simultanéeression long des aspects crânienne et caudale de l'incision.
  3. Localiser les vaisseaux sanguins de la rate, à la fin inférieure de la rate.
  4. Divisez la rate en plaçant deux Horizon taille moyenne clips ligature dans le centre de la rate en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins spléniques aux pôles de la rate.
  5. Placer le pôle supérieur de la rate de nouveau dans le péritoine pour éviter la contamination.

4. tumorale par injection

  1. Dresser 150 pi de tampon phosphate salin dans un 26 G x 5/8 "seringue.
  2. Dresser 100 pi de Panc02 (2 x 10 6 cellules) dans la même seringue en maintenant la seringue en position verticale pendant toute la durée de l'injection.
  3. Tremper l'aiguille dans une solution d'éthanol à 70%. L'aiguille est immergée dans de l'éthanol à 70% pour assurer la stérilité.
  4. Injecter les cellules lentement dans le hemispleen exposée étant que la seringue est maintenu en position verticale en tout temps. Le biseau de la Syringe doit être respecté en toutes circonstances par la capsule splénique pour éviter d'injecter les cellules dans la rate. Un blanchiment de la rate et les vaisseaux sanguins doit être observée lors de l'injection.
  5. Élever la rate et d'appliquer un milieu Horizon pince sous la rate pour obturer les vaisseaux sanguins spléniques.
  6. Appliquer une petite pince Horizon à l'aspect le plus distale du pancréas et vaisseaux spléniques.
  7. Ligaturer le pancréas et les vaisseaux spléniques de la hemispleen en coupant au-dessus des clips Horizon.
  8. Placez la souris sur son «côté, et irriguer l'incision avec de l'eau distillée.

5. abdominale fermeture et récupération de l'anesthésie

  1. Fermez le péritoine avec un point 4-0 de course.
  2. Appliquer deux à trois clips de la peau pour fermer l'incision de la peau.
  3. Administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine ou 5-10 mg / kg par voie sous cutanée Carprofen pour soulager la douleur post-opératoire.
  4. Placez la souris sur un coussin chauffant pour recovery jusqu'à mobile et la souris montre les modes de respiration réguliers. Animaux ne sont retournés à la compagnie d'autres animaux après avoir récupéré complètement de l'intervention chirurgicale.

6 L'autopsie examen et récolte du foie

  1. Entre 30 à 60 jours après l'opération, les souris vont commencer à montrer des symptômes cliniques de métastases et nécessiteront l'euthanasie. Les signes de la maladie métastatique nécessitant euthanasie comprennent abdomen élargie et le développement de l'ascite. Euthanasier les souris par inhalation de CO 2.
  2. En cas d'inhalation, effectuer dislocation cervicale.
  3. Après que l'animal a été déterminée comme étant non recevable, faire une incision à travers le péritoine d'exposer l'abdomen avec des ciseaux.
  4. En utilisant des pinces et ciseaux, couper délicatement le foie de l'abdomen.
  5. Placer le foie dans le composé PTOM, et le flash geler l'aide d'azote liquide. Conservez le foie à -80 ° C. Alternativement, le directr peut être fixé à 16% du formol tamponné neutre à la température ambiante pendant 24 heures et inclus en paraffine.

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Representative Results

Cellules tumorales Panc02 injectés dans le hemispleen (figure 1) des métastases hépatiques en forme 100% des souris, alors que pulmonaires et péritonéales métastases ne sont pas respectées, même si la technique est réalisée correctement. Cette technique a été effectuée sur plus d'une centaine de souris en utilisant des cellules Panc02 dans plusieurs expériences indépendantes, et reproductible, toutes les souris non traitées meurent de métastases hépatiques entre 30 et 60 jours après la procédure de hemisplenectomy (figure 2). Pour obtenir une signification statistique entre les groupes traités et non traités, dix souris par groupe sont nécessaires. Toutefois, ce nombre peut varier par rapport à la lignée cellulaire et le schéma de traitement utilisé. Lorsque les cellules Panc02 sont utilisés dans ce modèle, de multiples métastases hépatiques peuvent être observées à l'autopsie (figure 3).

Cellules tumorales CPK, qui sont une lignée cellulaire tumorale pancréatique dérivée syngénique de souris transgéniques ayant Kras et p53 spécifique d'un tissu knock-inmutations 11, peuvent également être utilisés dans ce modèle. A partir de ces résultats dans des cellules de métastases hépatiques similaires (figure 4). Cependant, lors de l'évaluation de la formation de métastases du foie à l'aide d'une lignée cellulaire différente, le nombre de cellules injectées doit être augmentée jusqu'à ce que toutes les souris non traitées développent des métastases hépatiques. Panc02 cellules peuvent être utilisées comme témoin positif pour s'assurer que l'opération a été effectuée correctement. Fait important, alors que la mesure de la formation de métastases du foie et de la survie peut varier en fonction de la lignée cellulaire utilisée, dans une expérience, les souris non traitées développent des métastases hépatiques à une charge semblable et meurent de ces métastases reproductible dans un court laps de temps. Par conséquent, la normalisation de la masse tumorale par l'échographie n'est pas nécessaire lors de l'utilisation de cette technique.

Le défaut d'induire des résultats de métastases hépatiques dans le foie d'apparence normale à l'autopsie, ce qui pourrait indiquer que la procédure n'a pas été effectuée correctement. Cependant, échoué ou delayed formation de métastases peut entraîner après un traitement avec des thérapies qui suppriment ou inhibent la croissance métastatique (figure 5), résultant en une survie prolongée. Par conséquent, ce modèle peut être utilisé pour évaluer les effets de divers agents thérapeutiques sur la croissance tumorale et la formation de métastases.

Comme il est techniquement possible d'évaluer le foie par ultrasons, un petit animal ultrasons (Figure 6) 12 peut être utilisée pour évaluer la formation in vivo de métastases dans le foie. En outre, la formation de métastases peut être examinée plus en détail ci-dessous par l'histopathologie nécropsie (figure 7).

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique du modèle de hemisplenectomy, qui est utiliséà créer des métastases hépatiques pancréatiques avec des cellules tumorales Panc02.

Figure 2
Figure 2: survie représentant de souris C57BL / 6 après avoir subi Panc02 hemisplenectomy au jour 0 est montré dans la courbe Kaplan-Meier (n = 10). Souris injectées avec des cellules tumorales Panc02 dans ce modèle tous mourir entre 30 et 60 jours après la procédure si thérapies anti-néoplasiques ne sont pas administrés.

Figure 3
Figure 3 L'examen macroscopique du foie suite à l'injection de cellules Panc02 dans le hemispleen révèle des métastases hépatiques (indicated par des flèches). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 L'examen macroscopique du foie suite à l'injection de hemispleen des cellules tumorales du CPK dans le hemispleen révèle des métastases hépatiques (flèches noires) qui remplacent le parenchyme hépatique normale (flèche blanche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 >
Figure 5 L'examen macroscopique du foie suite à une intervention thérapeutique efficace. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6 de l'échographie du foie à l'aide d'une échographie Vevo 660 petits animaux sur une souris avec une grande lésion métastatique dans le foie (flèche noire) en suivant la procédure de hemisplenectomy. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 7 coloration H & E de paraffine métastases hépatiques formés par des cellules Panc02 dans le modèle de hemisplenectomy. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ce modèle murin préclinique de la métastase du cancer du pancréas dans le foie via une technique d'injection de hemispleen est le premier modèle qui reflète décrit un grand nombre de conditions cliniques et immunologiques de patients ayant une maladie métastatique au foie. Ce modèle offre plusieurs avantages par rapport à d'autres modèles murins. Tout d'abord, à la différence des modèles transgéniques de cancer du pancréas, dans lequel seulement 30% des souris développent des métastases vers le foie et le moment de la formation de métastases est très variable, ce modèle offre l'avantage d'une métastase d'obtenir constamment vers le foie chez 100% des souris à une temps uniforme, qui permet aux chercheurs d'étudier la maladie métastatique dans ce cadre. En outre, ce modèle conserve une hemispleen naïf pour permettre une analyse à l'abri de sang périphérique dans un modèle reproductible. En outre, en l'absence de thérapies anti-néoplasiques, les souris meurent de la progression de la tumeur à un point dans le temps cohérent en fonction de la charge initiale de la tumeur et la survie sont cohérentesd'une expérience à l'autre. Enfin, ce modèle a une variété d'applications, y compris l'étude des 13 métastases du foie, de l'immunologie des tumeurs 10 et les essais de traitement expérimental 9.

Les étapes essentielles de cette technique sont la préparation de la suspension de cellules, l'injection des cellules tumorales, la mise en place des clips horizon, et la mise en place des clips de la peau. Pour assurer un succès de la chirurgie et éviter de biaiser potentiel des résultats, les modifications suivantes des étapes critiques peuvent être nécessaires. Tout d'abord, lors de la préparation de la suspension de cellules, il est impératif que d'une seule suspension de cellules est obtenue et injecté dans le hemispleen. Minor agglutination des cellules tumorales se occlure les vaisseaux spléniques et entraîner la mort prématurée pendant la chirurgie. Ceci peut être évité en remettant en suspension les cellules dans un agent de désatroquage et en préparant chaque seringue pour injection, immédiatement avant l'injection. En outre, lors de la préparation de l'seringue, il est impératif que les cellules se mélangent pas avec le tampon phosphate salin chasse. Ceci peut être réalisé par l'établissement de la première solution saline tamponnée au phosphate, puis en tirant lentement les cellules pour éviter un mélange, en maintenant la seringue dans une position verticale en tout temps. Ensuite, au cours de l'étape d'injection de cellules tumorales, le biseau de la seringue doit être observée à tout moment à travers la capsule de la rate afin d'éviter l'injection des cellules dans la rate. Un blanchiment de la rate et les vaisseaux sanguins doit être observée lors de l'injection, ce qui indique que les cellules tumorales ont été injectées avec succès dans la rate. De jeunes souris avec de petites rates, il peut être nécessaire d'injecter un volume plus petit que le risque de rincer les cellules de la rate des fuites. Si une fuite est suspectée, jeter les souris de leur côté et laver la rate avec de l'eau distillée avant de suturer la souris pour aider à éliminer les cellules qui peuvent avoir des fuites lors de l'étape d'injection. Ne pas retirer ces cellules se traduirala croissance de la tumeur au niveau du site d'injection, ce qui peut entraîner la mort avant d'atteindre les métastases adéquates. Troisièmement, la mise en place des clips Horizon sous le hemispleen est important de s'assurer qu'il n'y a pas de saignement après l'enlèvement du hemispleen. Horizon séquences supplémentaires peuvent être utilisés pour occlure les vaisseaux comme nécessaire. L'étape finale critique de cette technique est la mise en place des clips de la peau. Si les souris sont en cours pour la survie suivantes, il peut être nécessaire de suturer la peau de souris plutôt que d'utiliser des clips de la peau. Parfois, les clips de la peau vont tomber avant la guérison complète de la plaie de la peau, ce qui pourrait rendre les souris sensibles à l'infection. La suture de la peau, de séparer le péritoine, permettra d'éviter ce problème.

Bien que cette technique est inestimable pour l'étude du processus métastatique et la maladie métastatique, ce modèle a quelques limitations. Premièrement, la nature reproductible de ce modèle, il est préférable à transgénique et orthotopic modèles pour l'étude du processus métastatique, et le micro-environnement de la tumeur dans les sites métastatiques. Toutefois, en raison de la nature du modèle, seules les dernières étapes du processus métastatique, et la colonisation extravasation, peuvent être étudiés. Cela limite l'utilité de ce modèle pour l'étude du processus métastatique plein et ne permet pas d'enquête sur les signaux qui stimulent intravasculaire de cellules tumorales. Deuxièmement, même si il est important de conserver la fonction immunitaire complète chez ces souris par de retenue de la moitié de la hemispleen, l'analyse des lymphocytes dans le foie comprennent à la fois les lymphocytes provenant de foie normal, ainsi que des lymphocytes provenant du micro-environnement de la tumeur, ce qui pourrait conduire à une représentation biaisée de l'état vrai à l'abri à l'intérieur du micro-environnement de la tumeur. L'utilisation de lignées cellulaires de tumeurs plus agressives qui conduisent à plus étendues métastases au foie pourrait aider à surmonter cette limitation du modèle. En outre, si les métastases sont visualisés à l'autopsie, il peut être possible de disséquer les métastases du foie normal et d'analyser uniquement les lymphocytes trouvés dans les métastases de contourner plus ce problème. En résumé, alors que ce modèle présente plusieurs inconvénients, il offre également de nombreux avantages par rapport à d'autres modèles et doit donc être utilisé compléter ces modèles lors de l'étude des métastases au foie.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt pertinent de divulguer.

Acknowledgements

KF et KO sont co premiers auteurs avec KS

Ce travail a été financé en partie par le AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Bourse de recherche clinique scientifique (LZ), Fondation Viragh et Cancer Center Passer Viragh pancréas à l'Université Johns Hopkins (EMJ et LZ), le pancréas Fondation nationale (LZ), la Fondation de la famille Lefkofsky (LZ), la SPORE NCI dans Gastrointestinal Cancers CA062924 P50 (EMJ, LZ), la Fondation Lustgarten (LZ), et les subventions Sol Goldman pancréas Cancer Center (KS , BHE, LZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture media and components will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline Gibco by Life Technologies 10010-023
15 ml centrifuge tubes Corning 430052
Curved Operating Scissor Roboz Surgical Store RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps Roboz Surgical Store RS-5130
Needle holder (regular) World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled Teleflex 137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled Teleflex 237115
Weck Horizon medium ligating clips Teleflex 002200
Weck Horizon small ligating clips Teleflex 001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip Becton Dickinson 309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip Becton Dickinson 309597
9 mm Autoclip Applier Mikron 427630
9 mm Autoclip Becton Dickinson 427631
Heating pad Sunbeam CAT93
70% Ethanol sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride  Hospira 22395DD
Xylazine hydrochloride Sigma X1251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. Atlanta. (2013).
  2. Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
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Comments

6 Comments

  1. Thank you for your video and method. A small confusion, we draw up PBS first and then draw up tumor cells slowly to avoid mixing , but why mixing is needed to be avoided? What is the purpose of this step? If tumor cells mix with PBS in the syringe, what will happen? First PBS second tumor cells, so when we inject into the spleen, tumor cells will be sent into the spleen first, why we need to inject 150ul PBS?(This time the tumor cells have already been injected). Look forward to hearing from you! Regards!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 18, 2016 - 4:28 PM
  2. The purpose of the PBS flush is to push the cells that were injected into the spleen into the liver by way of the splenic vasculature. If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few, if any, hepatic metastases will develop. If the PBS flush is performed correctly, all of the tumor cells will be flushed into the liver, which will also help reduce mouse-to-mouse variability and ensure that roughly the same number of cells make it to the liver to develop hepatic metastases. I hope this helps to clarify.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 18, 2016 - 4:58 PM
  3. It's very useful! And one more thing pls, "If the flush is omitted, the injected cells will primarily colonize in the spleen, which will result in the mice dying prematurely and very few", why do mice die when tumor cells colonize? Thank you for replying!

    Reply
    Posted by: Mo C.
    October 19, 2016 - 9:32 AM
  4. The mice will die prematurely because the tumors will grow very quickly, so the mice will die from the large tumors.

    Reply
    Posted by: Kelly F.
    October 20, 2016 - 3:16 PM
  5. This is not my field of expertise so please excuse my ignorance. What is the purpose of using this hemisplenectomy injection technique instead of injecting into the entire spleen and leaving it intact? Is it due to the aggressiveness of these cancer cells? Do you think this surgery is necessary when injecting agents other than tumor cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 21, 2017 - 12:13 PM
  6. If the spleen is injected, left intact and in situ, tumor growth will then occur in the spleen instead of being limited to liver only disease. I can not speak to agents other than tumor cells. This model was designed as aa preclinical, murine tumor model of hepatic metastases.

    Reply
    Posted by: Kevin S.
    June 22, 2017 - 9:25 AM

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