Усреднение вирусного гликопротеина оболочки Шипы от Electron Cryotomography реконструкциями с помощью Jsubtomo

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Huiskonen, J. T., Parsy, M. L., Li, S., Bitto, D., Renner, M., Bowden, T. A. Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo. J. Vis. Exp. (92), e51714, doi:10.3791/51714 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Оболочечных вирусов используют мембранные гликопротеины на их поверхности в качестве посредника вступление в клетках-хозяевах. Трехмерная структурный анализ этих гликопротеин шипов, часто технически сложным, но важным для понимания вирусной патогенез и в разработке лекарственных препаратов. Вот, протокол представлен для определения вирусной структуры шип с помощью компьютерного усреднения данных электронных крио-томографии. Электрон крио-томография является методом в электронной микроскопии используется для получения трехмерных томографических реконструкций громкости или томограммы, плеоморфных биологических образцов, таких как мембранные вирусов в ближайшем родной, замороженных гидратированных государства. Эти томограммы раскрыть структуры, представляющие интерес в трех измерениях, хотя и с низким разрешением. Вычислительная усреднение субобъемов, или суб-томограмм, необходимо получить более высокое разрешение деталь повторяя структурные мотивы, такие как вирусные шипами гликопротеинов. Подробное вычислительный подход для Алиgning и среднем суб-томограммы, используя программный пакет Jsubtomo изложена. Этот подход позволяет визуализировать структуры вирусных шипами гликопротеинов с разрешением в диапазоне 20-40 Å и изучения изучения высших порядков шип-до-шип взаимодействий на вириона мембраны. Типичные результаты представлены на вирус Bunyamwera, оболочечным вируса из семейства буньявирусов. Эта семья структурно разнообразная группа возбудителей, создающих угрозу для здоровья человека и животных.

Introduction

Электрон крио-томография является методом визуализации электронно крио-микроскопии позволяет рассчитывать трехмерное (3D) реконструкции сложных биологических образцов. Подходящие образцы варьируются от очищенных макромолекулярных комплексов 1, нитей 2, покрытых пузырьков 3 и плеоморфных вирусов мембранных 4 до целых клетках прокариот 5 и даже тонких областях целых эукариотических клеток 6. После сбора данных о наклона серии, объемов 3D томографических, или томограмм, можно рассчитать, используя несколько установленных программных пакетов, в том числе Bsoft 7 и УПМ 8.

Два аспекта, присущие изучению биологических образцов с помощью электронного крио-томографии предела биологическая интерпретация соответствующих объемов томографических. Прежде всего, по причине ограниченного дозы электронов, которые могут быть применены к биологическим материалам перед введением значительного ущерба излучения, SignaL-к шуму в томографических данных, как правило, очень низка. Во-вторых, в результате геометрии наклона ограничен образца во время сбора данных, некоторые виды объекта остаются отсутствует, что приводит к так называемому отсутствует клина 'артефакта в объеме томографического. Тем не менее, оба этих ограничений могут быть преодолены, если объем томографическое содержит повторяющиеся идентичные структуры, такие как макромолекулярных комплексов, которые могут быть успешно усредненные 9-12.

До среднем структуры из томограмме реконструкций, объекты заинтересованности должны быть найдены и приведены в соответствие с той же ориентацией. Расположение таких структур может быть достигнута с использованием подхода, который часто называют шаблона согласования 13 по кросс-корреляции структуры шаблона в объеме томографического. Шаблон, используемый в этом процессе согласования могут быть получены из электронного крио-электронного микроскопа или крио-томографии в сочетании с 3D-реконструкции, или это может быть плотности карту моделируется сатомная структура. Несколько вычислительные пакеты были разработаны для выполнения этих задач 11.

Усреднение гликопротеинов шипов мембранных вирусов, таких как ВИЧ-1, был особенно успешным подходом для изучения их структуры 14-16. Понимание структуры является неотъемлемой для выявления как молекулярную основу вирус-хозяин взаимодействий и направляя развитие противовирусной и разработкой вакцин. В то время как кристаллографии макромолекул является методом выбора для высокого разрешения (как правило, лучше, чем 4 а) структурного анализа индивидуальных вирусных гликопротеинов и их комплексов, рентгеновские структуры, возникающие в результате этого метода белков, выделенных из природного мембранной среды на вириона . Таким образом, важные детали, такие как высшего архитектуру порядка вирусных гликопротеинов, в контексте вириона, по-прежнему отсутствует. С другой стороны, электрон крио-микроскопии и реконструкция одной частицыцелых оболочечных вирусов ограничивается вирионов с икосаэдрической симметрией 17,18. Электрон cryotomography сочетании с выравниванием суб-объема, таким образом, появились в качестве дополнительного метода, позволяющего изучение гликопротеинов шипов неправильной формы, плеоморфных вирусов в месте.

Мы разработали программное обеспечение с именем Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) для обнаружения, выравнивания и усреднения томографических субобъемов. Jsubtomo была использована в определении структуры ряда клеточных и вирусных структур 19-26. Здесь мы приводим подробный протокол, который позволяет определять вирусную-поверхностные шипованные структур. Чтобы обойти более-уточнение усредненных структур путем сопоставления шум, схема «золотым стандартом» уточнение принимается 10,27. Наконец, обсуждаются стратегии для визуализации и интерпретации типичных результатов.

Protocol

Подробный протокол вычислительного выравнивания и последующим усреднением вирусных гликопротеинов шипов изложена. Протокол следующим рабочий процесс, показанный на рисунке 1 и сочетает автоматизированный поиск шипами, используя исходные структуры шаблона и измельчение структуры золотого стандарта.

Входные данные для этого протокола представляет собой набор томографических реконструкций вирионов. Один томограмма содержит один или несколько вирионов. Первоначально небольшое подмножество шипами вручную собирали и использовали в среднем и переработки двух независимых моделей. Эти модели используются для автоматического обнаружения шипы на все вирионов. Наконец, два независимых уточнения запускаются и полученные средние по сравнению и объединены, чтобы произвести окончательный структуру.

Подход уточнение демонстрируется с помощью программы из пакета Jsubtomo. Программы от Bsoft пакета 28 используются для общего изображения рrocessing задачи и молекулярные графический пакет UCSF Химера 29 используется для визуализации результатов. Имена отдельных программ, выделенные курсивом и форматов обозначаются заглавными расширениями.

Рисунок 1
Рисунок 1:.. Общая стратегия для определения структуры гликопротеина шипованные комплексы от плеоморфных вирусов мембранных Цифры соответствуют различным разделам Протокола Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1 Извлечение Касперского субобъемов от Полноразмерная томограмм

  1. Подберите вирусные частицы вручную в томограмм.
    1. Откройте файл томограмма в bshow. Определите центр координации вирусной учале помощи функции частиц-сбора. Повторите этот шаг, пока все вирионы не были обработаны. Сохранить вирус координаты в файле STAR.
    2. Повторите шаг 1.1.1 пока все томограммы не были обработаны. Обратите внимание на диаметр вириона в пикселях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если шипы трудно увидеть в томограмм, использовать bfilter для фильтра низких частот томограмм до 80-разрешением (параметр "-bandpass 80,10000").
  2. Запустите jsubtomo.py в режиме экстракта (параметр "--mode экстракт") для извлечения вириона субобъемов к отдельным файлам объема. Используйте звезда файлы, сохраненные в шаге 1.1.1 в качестве входных файлов.
    1. Дайте размер (параметр "--размер") ~ 25% больше, чем самый большой вириона в наборе данных. Например, если Вирион ~ 200 пикселей в диаметре, использование размер 250 х 250 х 250 пикселей.
    2. Выходные файлы из объемов вириона будет в MAP-формате. Кроме того, создать сопутствующую STAR-файл для каждого объема вириона (параметер "--output").
  3. Нормализовать объемы вириона в bimg (параметр "-rescale 0,1").

2 Генерация двух независимых начальных моделей

  1. Выберите подмножество шипами в вириона субобъемов.
    1. Откройте файл вириона суб-громкости MAP в bshow. Определите центр координации спайка с использованием частиц комплектования инструмент, доступный через окно Toolbox. Повторите этот шаг, пока все четко выраженные пики не были обработаны. Сохранить всплеск координаты в файле STAR.
    2. При необходимости повторите шаг 2.1.1 для других вирионов до примерно 200 гликопротеин шипы были обработаны. Примечание размеры шипованные в пикселях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ~ 200 шипы приблизительных и более может потребоваться для некоторых приложений. Если это возможно, стремиться подобрать шипы в различных ориентациях. Избегайте выбором только виды сверху.
  2. Связать начальную вид вектор к шипами, запустив jviews.pу. Используйте звезда файлы, созданные в шаге 2.1.1 в качестве входных файлов.
    Примечание: Этот вид вектора приблизительно направление шипа со ссылкой на вириона.
    1. Используйте центральную координату назначить взгляды для сферической вириона. Например, если вириона по центру (после шага 1.2) в коробке с размерами 250 х 250 х 250 пикселей, центральный координат 125125125 пикселей (вариант "--Radial 125125125").
    2. Чтобы назначить представления для нитчатого вириона, открывать каждый вириона суб-объем в bshow с помощью файла ЗВЕЗДА, определенный в шаге 2.1.1 в качестве входного файла. Определите две конечные точки нити с помощью нити инструмент комплектования и сохраните файл STAR. Повторите этот шаг, пока все файлы звезда не были обновлены и запустить jviews.py использовать обновленные файлы STAR в качестве входных файлов (--option Сегмент).
  3. Создайте реальном пространстве маску с помощью jsubtomo_create_mask.py. Убедитесь, что реальное пространство маска из тех же размеры весионы, как будет использоваться для усредненной структуры (см 2.6.2) и достаточно большой, чтобы содержать и шип и участок основной мембраны.
  4. Создайте обратном пространстве маску с помощью jsubtomo_create_wedgemask.py. Взаимное пространство маска используется для исключения регионы в «пропавшего клина" области в результате сбора томографическое данных одной оси. Убедитесь, что это такие же размеры, как будет использоваться для усредненного структуры (см 2.6.2).
  5. Создать файл выбора (SEL-файл), определяющий вирионов, принадлежащие множеств "1" и "2" с помощью jsubtomo_evenodd.py и звезда файлы, созданные в шаге 2.2.
  6. Генерация два начальных средних помощью jsubtomo_create_averages.py.
    1. Используйте файл SEL сгенерированный на шаге 2.5 в качестве входного файла.
    2. Дайте размер (параметр "--размер") по меньшей мере 32 пикселей больше, чем наибольший размер шипа. Например, если Спайк ~ длиной 40 пикселей, использование размер 72 х 72 х 72 пикселей.
    3. Нанесите высокой симметрией (например, C100) на средних (параметр "--symmetry C100"), чтобы приблизить цилиндрическую среднем вокруг длинной оси колоса. Используйте симметризацию для снижения шума в начальных средних.
    4. Введите уникальное имя для выходных файлов проекта (параметр "--suffix").
    5. Используйте реальное пространство маску сгенерированный на шаге 2.3, чтобы замаскировать от фона (параметр "--mask"). Использование обратного пространства маски, полученной на этапе 2,4 для учета потери сигнала, введенного в присутствии отсутствующего клина (параметр "--Mask").

3 Золото-стандарт Итерационное Выравнивание и Усреднение двух начальных Spike моделей

Итеративно выровнять и усреднить два первоначальных моделей, созданных в разделе 2 с jsubtomo_iterate_gold.py.

  1. Этап I. Цель этого этапа является уточнениеНаправление обзора вектора. Входной файл файл SEL генерируется на этапе 2.5.
    1. Используйте 8-градусный угловой выборки (параметр "--angles 8,8,8").
    2. Разрешить изменения 16 градусов в направлении вектора вид шип (параметр "--thetaphilimit 16"), но сохранить угол вокруг (параметр "--alphalimit 0") шип длинной оси фиксированной.
    3. Разрешить небольшие сдвиги трансляционные (например, 5 пикселей) для учета неточностей в ручном комплектации шипов (параметр "--shiftlimit 5").
    4. Нанесите высокой симметрией (например, C100) на средних (параметр "--symmetry C100"), чтобы приблизить цилиндрическую среднем вокруг длинной оси колоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Симметризация используется для снижения шума в среднем.
    5. Используйте реальное пространство маску и обратном пространстве маску сгенерированный с шагом 2,3 и 2,4 для маскировки от прилегающих шипы и счет для пропавшего клина (параметры "--mспросите "и" --Mask ", соответственно).
    6. Используйте две MAP файлы, созданные в 2,6 (обозначается тегами "даже" и "странным" в имени файла) в качестве шаблонов (параметры "--Template1" и "--Template2", соответственно).
    7. Применить фильтр нижних частот на 50-разрешением (параметр "--resolution") для предотвращения смещения центровки.
    8. Нанесите фактор бен из 2 ускорить (параметр "--bin 2") уточнения.
    9. Запуск 5 итераций согласования и среднем (параметры "--firstiter 1 --lastiter 5").
  2. II этап. Цель этого этапа является уточнение угол вокруг вид вектора. Входной файл является выход SEL файл с шага 3.1.9.
    1. Измерьте точные размеры колоса, открыв нижних файл фильтруется MAP сгенерированный в последней итерации в шаге 3.1.9 (обозначается тегом "_lp» в имени файла) в bshow. Создать новую реальнуюАналогично пространство маска на шаг 2,3, определяющий шип, но исключает большинство мембранных и соседних шипами.
      Примечание: Оптимальный размер маски зависит от размера и особенностей шипа.
    2. Используйте 8-градусный угловой выборки (параметр "--angles 8,8,8"), как и раньше.
    3. Разрешить изменения с 180-градусным в угол вокруг с видом на шип вектора (параметр "- alphalimit 180"), но держать тета и фи углы фиксированной (параметр "--thetaphilimit 0").
    4. Не допускайте трансляционные сдвиги (параметр "--shiftlimit 0").
    5. Не применяйте симметрию на средних (опустить параметр "--symmetry").
    6. Используйте обратном пространстве маску сгенерированный на шаге 2.4 для учета отсутствующего клина.
    7. Используйте две MAP файлы, созданные в последней итерации шага 3.1.9 без симметрии (обозначается тэгов "even_nosym" и "odd_nosym" в имени файла), как шаблоны (параметры R20; - template1 "и" --Template2 ", соответственно).
    8. Применить фильтр нижних частот на 50-разрешением (параметр "--resolution") в первой итерации, чтобы предотвратить смещение центровки. Отрегулируйте параметры фильтра в последующих итераций автоматически (параметр "--adaptivefilter"), основанный на золотой стандарт Фурье Shell корреляции (FSC) между двумя независимыми средних. Используйте 0,143-критерий (параметр "--fsccrit 0,143"). Не допускайте изысканность мимо первого нуля функции передачи контраста (CTF) (параметр "--minhires"), если коррекция CTF не был применен к томограмм.
    9. Запустите 5-10 итераций выравнивания и усреднения (например, параметры "--firstiter 6 --lastiter 15"). Монитор изменения в отчетном резолюции. При значительных изменений не наблюдается, процесс может быть остановлен.
  3. Оценивать степень симметрии в структуре по examiniнг полученного нижних файл фильтруется MAP (обозначается тегом "_lp" в имени файла) в химерой. Например, если спайка тримерного комплекс, 3-кратный симметрии должно быть очевидно.
  4. III этап. Цель этого этапа является уточнение угол вокруг вид вектора далее с правильной симметрии. Входной файл является выход SEL файл с шага 3.2.9. Параметры такие же, как в шаге 3.2 с некоторыми исключениями:
    1. Разрешить соответствующие изменения в угол вокруг с видом на шип вектора. Например, если структура имеет 3-кратный симметрию, позволяют изменения в 60 градусов в угол альфа (параметр "--alphalimit 60").
    2. Применить правильный симметрию (например, C3) на средних (параметр --symmetry c3 ").
    3. Используйте две MAP файлы, созданные в последней итерации на шаге 3.2.9 (обозначается по тегам "даже" и "нечетного" в имени файла) в качестве файлы шаблонов ввода (параметры "--Template1" и --Template2).
    4. Запустите 5-10 итераций выравнивания и усреднения (например, параметры "--firstiter 16 --lastiter 25"). Монитор изменения в отчетном резолюции. При значительных изменений не наблюдается, процесс может быть остановлен.
  5. Стадия IV. Целью этого этапа является точно уточнить все три угла одновременно. Входной файл является выход SEL файл с шага 3.4.4. Параметры такие же, как в шаге 3.4 с некоторыми исключениями:
    1. Разрешить изменения 8 градусов в угол вокруг с видом на шип вектора (параметр "- alphalimit 8") и изменения 8 градусов в направлении вида всплеск вектора (параметр "--thetaphilimit 8"). Уточните ориентации в точности 4 градусов (параметры "--angles 8,8,8 --iterate 2").
    2. Разрешить небольшие сдвиги (например, 5 пикселей) для учета неточностей в предыдущих шагах выравнивания (параметр "--shiftlimit 5").
    3. Uсе эти два MAP-файлы, созданные в последней итерации в шаге 3.4.4 (обозначается тегами "даже" и "странным" в имени файла) в виде шаблонных файлов вход (параметры "--Template1" и --Template2).
    4. Запустите 5-10 итераций выравнивания и усреднения (например, параметры "--firstiter 26 --lastiter 35"). Монитор изменения в отчетном резолюции. При значительных изменений не наблюдается, процесс может быть остановлен.

4 поколение и Выравнивание Семена до поверхности вируса для шаблона Matching

  1. Генерация семена, расположенные равномерно по поверхности вириона для согласования шаблона и назначить начальную вид вектор к семенам, запустив jviews.py. Используйте звезда файлы, созданные в шаге 1.2.2 в качестве входных файлов. Генерация примерно в 1,5 раза больше семян, чем ожидаемое число шипов.
    Примечание: Этот вид вектора приблизительно направление шипа, ближайшей к каждой точке семян.
    1. Для генерации равномерно распределенных семена на примерно сферической вириона (параметр "--Но"), дать радиус (параметр "--radius"), угловое расстояние (например, 20 градусов) из семян (параметр "--angle 20" ) и центральную координату вириона. Например, если вириона центру (после шага 1.2) в коробке с размером 250 х 250 х 250 пикселей, центральный координат 125125125 пикселей (опция "--origin 125125125") .
    2. Для генерации равномерно распределенных семена на нитчатого частицы, используйте параметр "--Filament" и указать как радиус и спиральные параметры симметрии (нарастание и твист).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спиральные параметры симметрии используются здесь только в качестве удобного способа определения равномерно распределенных семян позиции, и они не должны отражать фактическое упорядочение шипами на нити.
  2. Создания двух независимых средние поверхности вируса как explaineд в разделе 2.
    1. Создайте SEL файл, определяющий вирионов, принадлежащие множеств "1" и "2" с помощью jsubtomo_evenodd.py и звезда файлы, созданные в шаге 4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения независимости наборов данных, все предыдущие назначения вирионов на группы "1" и "2" должен остаться тем же.
  3. Уточните позицию семян.
    1. Следуйте инструкциям в шаге 3.1, если не указано иное. Используйте файл SEL сгенерированный на шаге 4.2.1 в качестве входного файла.
    2. Разрешить семена, чтобы сдвинуть только вдоль нормали к мембране (параметр "--zshiftlimit"). Отрегулируйте позволило величину смещения в зависимости от того, сколько вирионы отклоняться от идеальной сферической геометрии (например, параметр --zshiftlimit 25 ").
    3. Используйте две MAP файлы, созданные в шаге 4.2 (обозначается тегов "четных" и "странным" в имени файла), как файлы шаблонов ввода (параметры "--TemPlate1 "и --Template2).
    4. Используйте уникальный суффикс чтобы избежать перезаписи звезда файлы оригинальный входные (например, параметр "--suffix _seeds").
    5. Используйте биннинга от 4 до ускорить (параметр "--bin 4") расчета и фильтр низких частот (например, параметр "--resolution 50").
  4. Генерация маркеров файлы Химера (CMM) из изысканных файлов семян STAR, используя jviews.py (параметр "--cmm"). Изучите семена от открытия файлов ШМ (и связанные с ними файлы вириона карте) в химеру. Убедитесь, что изысканные семена совмещены правильно по отношению к вирусной оболочки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные цвета могут быть использованы для дифференциации отдельных наборов маркеров (параметр "--color"). В качестве альтернативы изысканные маркеры могут быть окрашены в зависимости от их поперечного коэффициента корреляции (например, параметра "--fomcolor 0.1,0.3").

5 Gold-стендВоронежский Итерационное Выравнивание и Усреднение Spike структуры

Автоматически найти все всплески вириона субобъемов использованием местного соответствия шаблона вокруг изысканных семян и выровнять и усреднить, расположенные шипы. Используйте средние генерируемые из подмножества вручную подобранных шипами как начальных шаблонов.

  1. Выполните локальную соответствия шаблона вокруг семян в среднем все шипы с помощью программного jsubtomo_iterate_gold.py. Следуйте инструкциям в шаге 3,5, если не указано иное.
    1. Входной файл файл SEL для утонченных семян, полученных в шаге 4.3.
    2. Используйте достаточно большой предел для угла зрения вектора. Например, если семена были получены каждые 20 градусов (шаг 4.1), использовать угол немного больше, чем половины этого значения (параметр "--thetaphilimit 12"). Разрешить соответствующие изменения в угол вокруг с видом на шип вектора.
    3. Разрешить семена, чтобы перейти в плоскости мембраны (параметр"--xyshiftlimit"). Например, если расстояние семян с семенами составляет 25 пикселей, использовать общий сдвиг чуть больше половины этого (например, параметры "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная трансляционные сдвиги могут потребоваться, если карте файлы, созданные в шаге 3,5 сосредоточены на различном расстоянии от вириона центре, чем семян.
    4. Используйте две MAP файлы, созданные в шаге 3,5 (обозначается тегами "даже" и "странным" в имени файла), как файлы шаблонов ввода (параметры "--Template1" и --Template2).
    5. Используйте текущее разрешение карты файлов, сформированных на этапе 3,5 (параметр --resolution).
    6. Запустите 5-10 итераций согласования шаблона, выравнивания и усреднения (например, параметров "--firstiter 1 --lastiter 10"). Монитор изменения в отчетном резолюции. При значительных изменений не наблюдается, процесс может быть остановлен.
    7. После каждой итерации, Исключить перекрывающиеся хиты. Например, если ширина шипа составляет 30 пикселей, исключить хиты, которые ближе, чем 30 пикселей в других хитов (параметр "--mindist 30").
    8. Исключить хиты с низкой взаимной корреляции со-эффективной. Например, включают лучшие 75% шипы для каждого вириона (параметр "--topp 75").
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хиты с низким взаимной корреляции со-эффективным, скорее всего, представляют ложные положительные хиты.

6 Визуализация результатов

  1. Откройте изысканный структуры колоса в химеры для визуализации и установка атомных структур.
    1. Используйте нижних файл фильтруется MAP (обозначается тегом "LP"), созданный в последней итерации на шаге 5.1.6 в качестве входного файла.
    2. Используйте разрешение, указанное в пункте 5.1.6 для кросс-корреляции, основанной Место в химеру "Fit в карте" инструмент.
  2. Создание составного модель VIRIOн помощью jsubtomo_create_model.py.
    1. Используйте нижних файл фильтруется MAP (обозначается тегом "LP"), созданный в последней итерации на шаге 5.1.6 в качестве входного файла MAP к (параметр "--template").
    2. Используйте файл ЗВЕЗДА сгенерированный в последней итерации на шаге 5.1.6 в качестве входного файла STAR.
    3. Используйте файл маски сгенерированный на шаге 3.2.1 для учета перекрытия плотностей в составной модели (параметр "--mask").
    4. Укажите размер файла вириона MAP для создания композитного модель того же размера (параметр "--размер").
  3. Откройте составной модели для визуализации в химеру.

Representative Results

Мы демонстрируем применение усреднения процесса суб-томограммы, описанной выше для гликопротеина оболочки комплекса вируса Bunyamwera (Orthobunyavirus, буньявирусов) с использованием ранее опубликованных данных набор 24. Сбор и уточнение данных параметры приведены в таблице 1. Один представитель томограмма показана на рисунке 2.

Параметр (блок) Значение
Сбор данных
Напряжение (кВ) 300
Калибровка увеличение (X) 111000
Размер пикселя (Å) 5.4
Ориентировочная доза (е - / Å 2) 100
Дефокусировки (мкм) 4,0-4,5
Первый ЦФК нулю (а) 26-30
Угол наклона (°) -60-60
Выборки наклона (°) 3
Данные и уточнение
Томограммы 11
Вирионы 29
Семена в вириона 106
Общее количество семян 3074
Шипы обнаружено 1346
Шипы после удаления дублирования 1401
Шипы после выбора кросс-корреляции, основанной 1022
Шипы включены в окончательный среднем 1022
Симметрия C3
Угловой выборки (°) 8
Разрешениедиапазон, используемый в уточнении (Å) 42-334
Оценка Окончательное решение (а) б 35

Таблица 1: сбор данных Bunyamwera и статистика уточнения.
CTF, контраст передаточная функция.
б Рассчитано Фурье оболочки корреляцию между двумя независимо изысканных структур у порога 0,143.

Рисунок 2
Рисунок 2:. Фрагмент через томограмму Bunyamwera вирионов Несколько шипованные виды сбоку видно на периферии каждого вириона указаны стрелками с. Томограмма была низкочастотной фильтрации до 60 Å. Шкала бар 100 нм.

Во-первых, мы переработали первоначальный модель, используя 205 вручную определена шипы ( (Рисунок 3B) и был введен в последующих раундах уточнения (Рисунок 3C). Для обнаружения все шипы автоматически на поверхности вирионов, мы генерируется 106 семян для каждого вириона в радиусе 43 нм и расстоянием от 20 градусов (фиг.4А) и итеративно рафинированное свои позиции по отношению к мембране (фиг.4В).

Рисунок 3
Рисунок 3: Уточнение исходной структуры шаблона. () Цилиндрической среднем (C100) шаблон, созданный из определенных вручную позиций шипами. (B) средней плотности после пяти раундов уточнения без симметрии (C1) ввел отображает всплеск с в три разасимметричные черты. Разрешение модели составляет 48 Å. (C) Средний спайка была решена в 41 Å после пяти туров изысканности с тройной симметрией.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Уточнение семян АВ) подмножество семян до (а) и после (б) измельчение приведены на одной плотности вирионов из фиг.2 семена в (B) были цветом на основе соответствующего Кресте. коэффициенты корреляции (синие, низкая корреляция; красный, высокая корреляция).

Коррелируется лучше гликопротеин шипованные патчи (верхняя 75% после удаления дублирования; ~ 1000 шипы) были использованы для расчета окончательной среднем. Средняя был решен до 35-разрешением (рисунок 5). Это показал тримерную структуру шип в середине, вдополнение к некоторым вкладом шести соседних шипами. Композитные модели вирионов, рассчитанных путем размещения структуры в известных положениях, показало размещение шипами на вириона поверхности (Рисунок 6а). Иногда, локально упорядоченные участки шипами были очевидны (6В).

Рисунок 5
Рисунок 5: Тонкая структура пластыря гликопротеина шип слоя после согласования шаблона. (AB) Два карты 'даже' и 'странным', реконструированные из двух половинок данных показаны. Два карты показывают значительную степень сходства, проверки validness подхода. Ориентация вокруг продольной оси шипа отличается также две карты были восстановлены полностью независимо друг от друга. (C) Средний из двух карт отображается вОкончательное решение 35 Å.

Рисунок 6
Рисунок 6: Размещение шипами на вириона Bunyamwera. (А) Композитный модель вириона. Просмотреть векторы (палочки) указывают ориентации шипов. Цвета указывают на взаимную корреляцию между каждым шипом и структуры шаблона (синий, низкая корреляция; красный, высокая корреляция). (Б) крупный план упорядоченной пятачке шипами.

Discussion

Знание вирусной структуре гликопротеин спайка на вириона мембраны имеет важное значение для понимания репликации вируса и разработке терапевтических средств для лечения и профилактики инфекции. Электрон крио-микроскопии в сочетании с одной усреднения частиц стала самой используемой метод ее решения структуры оболочечных вирусных частиц, в том числе гликопротеина шипами. Однако этот способ ограничен icosahedrally симметричные вирусов. Здесь, за счет применения электронного крио-томографии и subtomogram усреднения в Jsubtomo, мы наметили общий протокол для определения гликопротеидных шипы на плеоморфными оболочечных вирусов, которые не поддаются другим текущим структурных методов биологии. Наши представительства результаты показывают, что разрешение этого метода является достаточной для выявления понимание архитектуры домена, олигомеризации, и вышестоящей организацией порядка гликопротеинов шипами на неповрежденных вирионов.

jove_content "> Наиболее важным шагом в этом протоколе строит два надежный запуск модели, которые являются статистически независимы друг от друга. Успешное выполнение этой стадии предполагает, что гликопротеин шипы являются достаточно большими, и не упакован друг против друга слишком плотно, так что отдельные пики могут быть визуально распознаваемых и вручную поднял в томограмм, и два независимых моделей в среднем. Если это не представляется возможным, две модификации протокола можно попытаться. первых, два независимых случайных модели могут быть построены, определив сначала два случайных подмножеств subtomograms а затем усреднения subtomograms в этих подмножествах 30. вторых, если структура изолированной шипа была получена с помощью других средств, например, с помощью рентгеновской кристаллографии, он может быть использован в качестве исходного модели. Тем не менее, следует соблюдать осторожность с низким Pass Filter эту модель с помощью отсечку низкого разрешения (50-70 А), как две результате моделей в следующем раунде изысканности волистатистически независимыми только за эту резолюцию. В связи с этой оговоркой первый подход рекомендуется.

Получить разрешение от этого протокола зависит от четырех основных факторов: я. Стратегия сбора данных и качество входных данных, II. количество subtomograms, III. точность выравнивания из subtomograms, и IV. Неоднородность структуры. В то время как первая и вторая ограничение может быть в значительной степени преодолены с помощью высоких прямых детекторов сигнал-шум электронов в сочетании с ЦФК исправлены томографии и автоматизированного сбора данных, точность выравнивания дополнительно зависит от размера и формы самой структуре интерес. При применении данного протокола о малых шипами, не имеющих характерные особенности, это может быть выгодно, чтобы связать Fab фрагменты на шип для повышения точности выравнивания и, следовательно, разрешение 31. Наконец, если структуры, которые будут усредненные проявляют несколько конформации, суб-Томографыметоды классификации утра могут быть использованы в среднем различные конформации отдельно. С этой целью, Jsubtomo интегрируется с пакетом Динамо, предлагая мощный subtomogram классификацию 9.

Выше протокол является дополнением к рентгеновской кристаллографии изолированных вирусных гликопротеинов. Кристаллографических структур, могут быть установлены в суб-томограмме в среднем, чтобы получить точную ориентацию гликопротеина по отношению к мембране вириона. Применение этой методики, несомненно, будет продолжать, чтобы пролить свет на охватившего структуры вируса и патобиологии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jsubtomo (ver 1.3.1) University of Oxford n/a www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7) NIAMS, NIH n/a bsoft.ws
UCSF Chimera UCSF n/a www.cgl.ucsf.edu/chimera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353, (1), 115-120 (2007).
  2. Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158, (3), 378-385 (2007).
  3. Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365, (3), (2007).
  4. Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302, (5649), 1396-1398 (2003).
  5. Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442, (7106), 1062-1064 (2006).
  6. Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, (5596), 1209-1213 (2002).
  7. Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161, (3), 232-242 (2008).
  8. Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, (1), 71-76 (1996).
  9. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178, (2), 139-151 (2012).
  10. Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178, (2), 177-188 (2012).
  11. Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43, (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
  12. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23, (2), 261-267 (2013).
  13. Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (22), 14153-14158 (2002).
  14. Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2, (8), (2006).
  15. Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, (7209), (2008).
  16. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
  17. Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63, (4), 862-922 (1999).
  18. Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17, (2), 229-236 (2007).
  19. Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (44), (2011).
  20. Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338, (6114), 1634-1637 (2012).
  21. Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195, (5), 889-902 (2011).
  22. Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86, (9), 5067-5079 (2012).
  23. Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84, (10), 4889-4897 (2010).
  24. Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9, (5), (2013).
  25. Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21, (8), London, England. 1396-1405 (1993).
  26. Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122, (5), 377-386 (2013).
  27. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9, (9), 853-854 (2012).
  28. Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, (1), 3-18 (2007).
  29. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, (1), 281-287 (2007).
  30. Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336, (6087), 1451-1454 (2012).
  31. Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20, (4), London, England. 582-592 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics