Della media di Viral Busta Glicoproteina Spikes da Electron Cryotomography Ricostruzioni con Jsubtomo

Immunology and Infection
 

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Huiskonen, J. T., Parsy, M. L., Li, S., Bitto, D., Renner, M., Bowden, T. A. Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo. J. Vis. Exp. (92), e51714, doi:10.3791/51714 (2014).

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Abstract

Virus con involucro utilizzano glicoproteine ​​di membrana sulla superficie di mediare l'ingresso nelle cellule ospiti. Tridimensionale analisi strutturale di queste glicoproteina 'punte' è spesso tecnicamente impegnativo, ma importante per comprendere la patogenesi virale e nella progettazione di farmaci. Qui, un protocollo viene presentato per la determinazione della struttura virale picco attraverso media computazionale di elettroni dati crio-tomografia. Electron crio-tomografia è una tecnica di microscopia elettronica utilizzata per ricavare tridimensionali ricostruzioni tomografiche di volume, o tomografie, di campioni biologici pleomorfi come virus membrana in uno stato congelato-idratato quasi native. Queste tomografie rivelano strutture di interesse in tre dimensioni, anche se a bassa risoluzione. Media computazionale dei sotto-volumi, o sub-tomografie, è necessario per ottenere maggiore dettaglio la risoluzione di ripetere motivi strutturali, come ad esempio i picchi glicoproteina virale. Un approccio computazionale dettagliato per aligning e media sub-tomogrammi utilizzando il pacchetto software Jsubtomo è delineato. Questo approccio consente la visualizzazione della struttura di picchi glicoproteine ​​virali di risoluzione nell'intervallo 20-40 Å e studio dello studio di ordine superiore picco-a-picco interazioni sulla membrana virione. I risultati tipici sono presentati per Bunyamwera virus, un virus con involucro della famiglia Bunyaviridae. Questa famiglia è un gruppo strutturalmente eterogeneo di agenti patogeni che costituiscono una minaccia per la salute umana e animale.

Introduction

Electron crio-tomografia è una tecnica di imaging elettronico crio-microscopia che permette il calcolo di una tridimensionale (3D) ricostruzione di campioni biologici complessi. I campioni idonei vanno da complessi macromolecolari purificate 1, 2 filamenti, vescicole rivestite 3, e virus membrana pleomorfi 4 a intere cellule procariote 5 e anche le aree sottili di intere cellule eucariotiche 6. Dopo la raccolta dei dati di un tilt-serie, volumi tomografiche 3D, o tomografie, può essere calcolato utilizzando diversi pacchetti software affermati, tra cui Bsoft 7 e IMOD 8.

Due aspetti inerenti allo studio di campioni biologici dal limite elettroni tomografia crio-l'interpretazione biologica dei corrispondenti volumi tomografiche. In primo luogo, a causa della dose di elettroni limitata che può essere applicato a materiali biologici prima di introdurre significativi danni da radiazioni, signaL-to-noise ratio nei dati tomografici sono in genere molto bassi. In secondo luogo, a causa della geometria del campione limitato inclinazione durante la raccolta dei dati, alcune viste dell'oggetto rimangono assenti, portando ad un cosiddetto artefatto 'cuneo mancante' nel volume tomografica. Tuttavia, entrambi questi limiti possono essere superati se il volume tomografica contiene ripetendo strutture identiche, come i complessi macromolecolari, che possono essere correttamente mediate 9-12.

Prima di una media struttura di ricostruzioni tomogramma, oggetti di interesse devono essere trovate e allineati allo stesso orientamento. Individuazione tali strutture può essere raggiunto mediante cross-correlazione di una struttura modello nel volume tomografica utilizzando un approccio spesso indicato come modello di corrispondenza 13. Il modello utilizzato in questo processo di corrispondenza può essere derivata da elettroni crio-microscopia elettronica o crio-tomografia combinata con ricostruzione 3D, oppure può essere una mappa di densità simulato dauna struttura atomica. Alcuni pacchetti computazionali sono stati sviluppati per svolgere questi compiti 11.

Della media dei picchi glicoproteina di membrana di virus, come l'HIV-1, è stato un approccio particolarmente efficace per studiare la loro struttura 14-16. La comprensione della struttura è integrale per rivelare sia le basi molecolari delle interazioni virus-ospite e guidare lo sviluppo di design antivirali e di vaccini. Mentre la cristallografia macromolecolare è la tecnica di scelta per alta risoluzione (generalmente migliore di 4 Å) analisi strutturale delle singole glicoproteine ​​virali e loro complessi, le strutture raggi X risultanti da tale metodo di proteine ​​isolate dall'ambiente membranosa naturale sul virione . Così, dettagli importanti come l'architettura ordine superiore di glicoproteine ​​virali, nel contesto del virione, rimangono privi. D'altra parte, elettrone crio-microscopia e singola particella ricostruzionedi intere virus con involucro è limitato a virioni con simmetria icosaedrica 17,18. Electron cryotomography combinato con l'allineamento sub-volume è dunque emerso come tecnica complementare che permette lo studio dei picchi glicoproteina di forma irregolare, virus pleomorphic in situ.

Abbiamo sviluppato un software chiamato Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) per la rilevazione, l'allineamento e la media dei tomografiche sotto-volumi. Jsubtomo è stato utilizzato nella determinazione della struttura di un certo numero di strutture cellulari e virali 19-26. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato, che permette alle strutture di picco virale di superficie determinazione. Per aggirare over-raffinamento di strutture mediati correlando rumore, il regime di perfezionamento 'gold standard' è adottato 10,27. Infine, le strategie per la visualizzazione e l'interpretazione dei risultati tipici sono discussi.

Protocol

Un protocollo dettagliato per l'allineamento di calcolo e la successiva media dei picchi della glicoproteina virale è delineato. Il protocollo segue il flusso illustrato in figura 1 e combina una ricerca automatica delle punte utilizzando strutture template iniziali e una struttura raffinatezza gold standard.

Dati di ingresso per questo protocollo è un insieme di ricostruzioni tomografiche dei virioni. Un tomogramma contiene uno o più virioni. Inizialmente, un piccolo sottoinsieme di picchi viene raccolto manualmente e utilizzato a media e perfezionare due modelli indipendenti. Questi modelli sono utilizzati per individuare automaticamente picchi su tutti i virioni. Infine, due filtri indipendenti sono gestiti e le medie risultanti sono confrontati e combinati per produrre la struttura finale.

L'approccio raffinatezza è dimostrata utilizzando programmi dal pacchetto Jsubtomo. I programmi del pacchetto Bsoft 28 sono utilizzati per un'immagine generale pcompiti rocessing e grafica molecolare pacchetto UCSF Chimera 29 viene utilizzato per visualizzare i risultati. I nomi dei singoli programmi sono riportate in corsivo e formati di file sono indicati con le estensioni dei file in maiuscolo.

Figura 1
Figura 1:.. Strategia generale per la determinazione delle strutture di glicoproteina complessi spike da virus membrana pleomorfi I numeri corrispondono alle diverse sezioni del protocollo Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1 Estrazione Virus Sub-volumi da Full-size tomogrammi

  1. Scegli particelle virali manualmente nei tomogrammi.
    1. Aprire un file tomogramma in bshow. Definire la coordinata centro di una partic virusLe utilizzando lo strumento della particella raccolta. Ripetere questa operazione finché non sono stati elaborati tutti i virioni. Coordinate Salva virus in un file STAR.
    2. Ripetere il punto 1.1.1 fino a quando sono stati elaborati tutti tomogrammi. Prendere nota del diametro del virione in pixel.
      NOTA: se le punte sono difficili da vedere nelle tomografie, utilizzare bfilter per passa-basso filtrata del tomografie a 80-risoluzione (parametro "-bandpass 80,10000").
  2. Eseguire jsubtomo.py in modalità estratto (parametro "estratto --mode") per estrarre virione sub-volumi in file di volumi singoli. Utilizzare i file STAR salvati nel passaggio 1.1.1 come file di input.
    1. Dare una dimensione (parametro "--size") ~ 25% più grande della più grande virione nel set di dati. Ad esempio, se il virione è ~ 200 pixel di diametro, l'uso di dimensioni 250 x 250 x 250 pixel.
    2. I file di output dei volumi virione saranno in MAP formato. Inoltre, creare un accompagnamento STAR file per ogni volume virione (parater "--output").
  3. Normalizza volumi virione a BIMG (parametro "0,1 -rescale").

2 Generazione di due indipendenti modelli iniziali

  1. Scegli un sottoinsieme dei picchi nei sotto-volumi virione.
    1. Aprire un file MAP virione sub-volume in bshow. Definire la coordinata centro di un picco utilizzando lo strumento di particelle-picking, accessibile tramite la finestra Casella degli strumenti. Ripetere questa operazione finché non sono stati elaborati tutti i picchi nettamente distinte. Coordinate Salva picco in un file STAR.
    2. Se necessario, ripetere il passaggio 2.1.1 per altri virioni fino a circa 200 picchi glicoproteina sono stati elaborati. Nota dimensioni spike in pixel.
      NOTA: ~ 200 punte sono una guida di riferimento e più possono essere necessari per alcune applicazioni. Se possibile, mira a raccogliere picchi in diversi orientamenti. Evitare di raccogliere solo le viste migliori.
  2. Assegnare un vettore vista iniziale per le punte eseguendo jviews.py. Utilizzare i file STAR generati nel passaggio 2.1.1 come file di input.
    NOTA: Questo vettore vista approssima la direzione del picco con riferimento al virione.
    1. Utilizzare la centrale coordinata per assegnare il punto di vista di un virione sferico. Ad esempio, se il virione è centrato (dopo passo 1.2) in una scatola con una dimensione di 250 x 250 x 250 pixel, la centrale di coordinate è 125.125.125 pixel (opzione "--Radial 125.125.125").
    2. Per assegnare il punto di vista di un virione filamentosa, aprire ogni sotto-volumi virione in bshow utilizzando il file STAR definito al punto 2.1.1 del file di input. Definire i due punti estremi del filamento utilizzando lo strumento di raccolta filamento e salvare il file STAR. Ripetere questo passaggio finché tutti i file STAR sono stati aggiornati ed eseguire jviews.py utilizzando i file aggiornati STAR come file di input (--opzione Segment).
  3. Generare una maschera spazio reale usando jsubtomo_create_mask.py. Assicurarsi che la maschera lo spazio reale è delle stesse dimensioni come verrà utilizzato per la struttura media (vedi 2.6.2) ed è sufficientemente grande da contenere sia il picco e un cerotto della membrana sottostante.
  4. Generare una maschera spazio reciproco con jsubtomo_create_wedgemask.py. La maschera spazio reciproco è utilizzato per escludere regioni del 'cuneo mancante' regione risultante da asse singola raccolta di dati tomografici. Assicurarsi che sia delle stesse dimensioni come verrà utilizzato per la struttura media (vedi 2.6.2).
  5. Generare un file di selezione (file SEL) definendo virioni appartenenti ai gruppi "1" e "2" utilizzando jsubtomo_evenodd.py ei file STAR generati nel passaggio 2.2.
  6. Genera due medie iniziali utilizzando jsubtomo_create_averages.py.
    1. Utilizzare il file SEL generato nel passaggio 2.5 come file di input.
    2. Dare una dimensione (parametro "--size") almeno 32 pixel più grandi della dimensione maggiore del picco. Ad esempio, se il picco è lunga ~ 40 pixel, dimensioni uso 72 x 72 x 72 pixel.
    3. Applicare una simmetria elevato (ad esempio, C100) sulle medie (parametro "--symmetry C100"), per approssimare una media cilindrica attorno all'asse lungo del picco. Utilizzare simmetrizzazione per ridurre il rumore nelle medie iniziali.
    4. Fornire un nome univoco per i file di output del progetto (parametro "--suffix").
    5. Utilizzare la maschera di spazio reale generato nel passaggio da 2.3 a mascherare lontano sfondo (parametro "--mask"). Utilizzare la maschera spazio reciproco generato nel passaggio da 2.4 a spiegare la perdita di segnale introdotta dalla presenza di un cuneo mancante (parametro "--Mask").

Allineamento iterativo 3 Gold-standard della media dei due modelli Spike iniziali

Iterativamente allineare e la media dei due modelli iniziali generati nella sezione 2 con jsubtomo_iterate_gold.py.

  1. Fase I. L'obiettivo di questa fase è quello di affinare ladirezione di vista del vettore. Il file di input è il file SEL generato nel passaggio 2.5.
    1. Utilizzare un campionamento angolare di 8 gradi (parametro "--angles 8,8,8").
    2. Consenti modifiche 16 gradi nella direzione della vista spike vettore (parametro "--thetaphilimit 16"), ma mantengono l'angolo intorno all'asse lungo picco fisso (parametro "--alphalimit 0").
    3. Consenti piccoli spostamenti traslazionali (ad esempio, 5 pixel) per tenere conto di imprecisioni nella raccolta manuale dei picchi (parametro "--shiftlimit 5").
    4. Applicare una simmetria elevato (ad esempio, C100) sulle medie (parametro "--symmetry C100"), per approssimare una media cilindrica attorno all'asse lungo del picco.
      NOTA: simmetrizzazione viene usato per ridurre il rumore nelle medie.
    5. Utilizzare la maschera di spazio reale e la maschera di spazio reciproco generata in passi 2.3 e 2.4 per mascherare via picchi circostanti e per conto del cuneo mancante (parametri "--Mchiedere "e" --Mask ", rispettivamente).
    6. Utilizzare i due file mappa generata in 2,6 (indicato con tag "anche" e "dispari" nel nome del file) come modelli (parametri "--Template1" e "--Template2", rispettivamente).
    7. Applicare un filtro passa basso a 50-risoluzione (parametro "--resolution") per evitare pregiudizi allineamento.
    8. Applicare un fattore bidone di 2 per accelerare la raffinatezza (parametro "--bin 2").
    9. Eseguire 5 iterazioni di allineamento e media (parametri "--firstiter 1 --lastiter 5").
  2. Fase II. L'obiettivo di questa fase è quello di perfezionare l'angolo di vista intorno al vettore. Il file di input è il file di SEL in uscita dal passo 3.1.9.
    1. Misurare le dimensioni precise del picco aprendo il passa-basso file MAP filtrato generato nell'ultima iterazione nella fase 3.1.9 (indicata con tag "_lp" nel nome del file) in bshow. Generare un nuovo vero e proprioMaschera spazio in modo simile a passo 2.3 che definisce il picco, ma esclude la maggior parte delle punte di membrana e limitrofi.
      NOTA: La dimensione ottimale della maschera dipende dalle dimensioni e caratteristiche del picco.
    2. Utilizzare 8 gradi campionamento angolare (parametro "--angles 8,8,8") come prima.
    3. Consenti modifiche a 180 gradi dell'angolo attorno al vettore vista spike (parametro "- alphalimit 180"), ma mantenere il theta e angoli phi fissa (parametro "--thetaphilimit 0").
    4. Non permettere eventuali spostamenti traslazionali (parametro "--shiftlimit 0").
    5. Non applicare alcuna simmetria sulle medie (omettere il parametro "--symmetry").
    6. Utilizzare la maschera di spazio reciproco generato nel passo 2.4 per tenere conto del cuneo mancante.
    7. Utilizzare i due file mappa generata nell'ultima iterazione di punto 3.1.9, senza simmetria (indicato con tag "even_nosym" e "odd_nosym" nel nome del file) come modelli (parametri R20; - Template1 "e" --Template2 ", rispettivamente).
    8. Applicare un filtro passa basso a 50-risoluzione (parametro "--resolution") nella prima iterazione per evitare pregiudizi allineamento. Regolare i parametri del filtro nelle iterazioni successive automaticamente (parametro "--adaptivefilter") basato su gold-standard di Fourier Shell Correlazione (FSC) tra le due medie indipendenti. Utilizzare 0,143-criterio (parametro "--fsccrit 0,143"). Non permettere raffinatezza oltre il primo zero della funzione di trasferimento di contrasto (CTF) (parametro "--minhires"), a meno che la correzione CTF è stato applicato alle tomografie.
    9. Eseguire 5-10 iterazioni di allineamento e media (per esempio, i parametri "--firstiter 6 --lastiter 15"). Monitorare i cambiamenti nella risoluzione riportata. Quando si osservano cambiamenti significativi, il processo può essere fermato.
  3. Valutare il grado di simmetria nella struttura da examining la risultante passa-basso file MAP filtrato (indicata con tag "_lp" nel nome del file) in chimera. Ad esempio, se il picco è un complesso trimeric, 3 volte la simmetria dovrebbe essere evidente.
  4. Fase III. L'obiettivo di questa fase è quello di perfezionare l'angolo di vista intorno al vettore ulteriormente con la corretta simmetria. Il file di input è il file di SEL in uscita dal passo 3.2.9. I parametri sono gli stessi come nel passo 3.2 con alcune eccezioni:
    1. Consenti modifiche appropriate in angolo intorno la vista spike vettoriale. Ad esempio, se la struttura ha 3 volte simmetria, permettere variazioni di 60 gradi dell'angolo alfa (parametro "--alphalimit 60").
    2. Applicare la simmetria corretto (ad esempio, c3) sulle medie (parametro --symmetry c3 ").
    3. Utilizzare i due file mappa generata nell'ultima iterazione nella fase 3.2.9 (indicata con tag "anche" e "dispari" nel nome del file) come file di modello di input (parametri "--Template1" e --Template2).
    4. Eseguire 5-10 iterazioni di allineamento e media (per esempio, i parametri "--firstiter 16 --lastiter 25"). Monitorare i cambiamenti nella risoluzione riportata. Quando si osservano cambiamenti significativi, il processo può essere fermato.
  5. Stadio IV. L'obiettivo di questa fase è quello di definire con precisione simultaneamente tutti e tre gli angoli. Il file di input è il file di SEL in uscita dal passo 3.4.4. I parametri sono gli stessi come nel passo 3.4 con alcune eccezioni:
    1. Consenti modifiche 8 gradi dell'angolo giro la vista spike vettore (parametro "- alphalimit 8") e le modifiche 8 gradi nella direzione della vista spike vettore (parametro "--thetaphilimit 8"). Affinare gli orientamenti per la precisione a 4 gradi (parametri "--angles 8,8,8 --iterate 2").
    2. Consenti piccoli spostamenti (ad esempio, 5 pixel) per tenere conto di imprecisioni nelle fasi di allineamento precedenti (parametro "--shiftlimit 5").
    3. USE i due file mappa generata nell'ultima iterazione nella fase 3.4.4 (indicati da tag "pari" e "dispari" nel nome del file) come file di modello di input (parametri "--Template1" e --Template2).
    4. Eseguire 5-10 iterazioni di allineamento e media (per esempio, i parametri "--firstiter 26 --lastiter 35"). Monitorare i cambiamenti nella risoluzione riportata. Quando si osservano cambiamenti significativi, il processo può essere fermato.

4 Generazione e allineamento dei semi al virus di superficie per il modello di Corrispondenza

  1. Generare semi situati in modo uniforme sulla superficie del virione per il modello corrispondente e assegnare un vettore vista iniziale per i semi eseguendo jviews.py. Utilizzare i file STAR generati nel passaggio 1.2.2 come file di input. Genera circa 1,5 volte più semi che il numero atteso di punte.
    NOTA: Questo vettore vista approssima la direzione del picco più vicino a ciascun punto seme.
    1. Per generare semi uniformemente distribuite su un virione approssimativamente sferica (parametro "--anche"), dà il raggio (parametro "--radius"), separazione angolare (ad esempio, 20 gradi) dei semi (parametro "--angle 20" ) e la centrale coordinata del virione. Ad esempio, se il virione è centrato (dopo il punto 1.2) in una scatola con una dimensione di 250 x 250 x 250 pixel, la coordinata centrale è 125.125.125 pixel (opzione "--origin 125.125.125") .
    2. Per generare i semi uniformemente distribuite su una particella filamentosa, utilizzare il parametro "--Filament" e specificare sia il raggio e parametri di simmetria elicoidale (aumento e torsione).
      NOTA: I parametri di simmetria elicoidali sono usati qui solo come un modo conveniente di definire posizioni di semi distribuiti in modo uniforme e non hanno bisogno di riflettere l'ordine reale delle punte sul filamento.
  2. Genera due medie indipendenti della superficie del virus come explained nella sezione 2.
    1. Generare un file di SEL che definisce virioni appartenenti alla serie "1" e "2" utilizzando jsubtomo_evenodd.py ei file STAR generati nel passaggio 4.1.
      NOTA: Per garantire l'indipendenza del set di dati, qualsiasi incarico precedente di virioni in gruppi "1" e "2" deve rimanere lo stesso.
  3. Filtra la posizione dei semi.
    1. Seguire le istruzioni al punto 3.1, salvo diversa indicazione. Utilizzare il file SEL generato nel passaggio 4.2.1 come il file di input.
    2. Lasciare i semi di spostare solo lungo la normale alla membrana (parametro "--zshiftlimit"). Regolare la quantità consentita di spostamento a seconda di quanto i virioni si discostano dalla geometria sferica ideale (ad esempio, il parametro --zshiftlimit 25 ").
    3. Utilizzare i due file mappa generata nel passaggio 4.2 (indicato con tag "pari" e "dispari" nel nome del file) come file di modello di input (parametri "--TemPlate1 "e --Template2).
    4. Utilizzare un suffisso unico per evitare di sovrascrivere i file di input originale STAR (ad esempio, il parametro "--suffix _seeds").
    5. Utilizzare la discretizzazione del 4 per velocizzare il calcolo (parametro "--bin 4") e un filtro passa-basso (ad esempio, il parametro "--resolution 50").
  4. Generare file marcatori Chimera (CMM) dei file raffinati seme STAR utilizzando jviews.py (parametro "--cmm"). Esaminare i semi aprendo i file CMM (ei file associati virione MAP) in chimera. Assicurarsi che i semi raffinati siano allineati correttamente rispetto alla membrana del virus.
    NOTA: I colori differenti possono essere utilizzati per differenziare gruppi separati di marcatori (parametro "--color"). In alternativa, i marcatori raffinati possono essere colorati in base al loro coefficiente di correlazione incrociata (ad esempio, il parametro "--fomcolor 0.1,0.3").

5 Gold-supportoard iterativo Allineamento e della media della struttura Spike

Localizzare automaticamente tutte le punte delle sub-volumi virione utilizzando corrispondente modello locale intorno i semi raffinati e allineare e la media dei picchi localizzati. Utilizzare le medie generati da un sottoinsieme di punte raccolte manualmente come modelli iniziali.

  1. Eseguire corrispondente modello locale intorno i semi in media tutte le punte utilizzando il programma jsubtomo_iterate_gold.py. Seguire le istruzioni al punto 3.5, salvo diversa indicazione.
    1. Il file di input è il file di SEL per i semi raffinati generati nel passaggio 4.3.
    2. Utilizzare un sufficientemente grande limite per l'angolo di visualizzazione vettoriale. Esempio, se i semi sono stati generati ogni 20 gradi (passo 4.1), utilizzare un angolo leggermente più grande della metà di questo valore (parametro "--thetaphilimit 12"). Consenti modifiche appropriate in angolo intorno la vista spike vettoriale.
    3. Consentire semi di spostare nel piano della membrana (parametro"--xyshiftlimit"). Ad esempio, se la distanza di semi-to-seme è 25 pixel, utilizzare spostamento totale poco più della metà di questa (ad esempio, i parametri "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      NOTA: Ulteriori spostamenti di traslazione può essere richiesto se i file MAP generati nel passaggio 3.5 sono centrate ad una distanza diversa dal centro virione che i semi.
    4. Utilizzare i due file mappa generata nel passaggio 3.5 (indicato con tag "anche" e "dispari" nel nome del file) come file di modello di input (parametri "--Template1" e --Template2).
    5. Utilizzare la risoluzione corrente dei file MAP generati nella fase 3.5 (parametro --resolution).
    6. Eseguire 5-10 iterazioni di template matching, allineamento e media (per esempio, i parametri "--firstiter 1 --lastiter 10"). Monitorare i cambiamenti nella risoluzione riportata. Quando si osservano cambiamenti significativi, il processo può essere fermato.
    7. Dopo ogni iterazione, Escludere colpi sovrapposti. Ad esempio, se la larghezza del picco è di 30 pixel, esclude colpi che sono più vicini di 30 pixel ad altri successi (parametro "--mindist 30").
    8. Escludi colpisce con un cross basso correlazione co-efficiente. Ad esempio, includere i migliori 75% picchi per ogni virione (parametro "--topp 75").
      NOTA: colpisce con una bassa correlazione incrociata coefficiente sono suscettibili di rappresentare falsi colpi positivi.

6. visualizzazione dei risultati

  1. Aprire la struttura raffinata del picco di chimera per la visualizzazione e montaggio di strutture atomiche.
    1. Utilizzare il passa-basso file MAP filtrato (indicata con tag "lp"), creato nel iterazione finale al punto 5.1.6 del file di input.
    2. Utilizzare la risoluzione indicata al punto 5.1.6 per il cross-correlazione basata montaggio in chimera "Fit Mappa" strumento.
  2. Creare un modello composito del Virion utilizzando jsubtomo_create_model.py.
    1. Utilizzare il passa-basso file MAP filtrato (indicata con tag "lp"), creato nel iterazione finale al punto 5.1.6 in quanto il file di input MAP a (parametro "--template").
    2. Utilizzare un file STAR generato nella iterazione finale al punto 5.1.6 del file di input STAR.
    3. Utilizzare il file maschera generato nel passaggio 3.2.1 per tenere conto di densità di sovrapposizione del modello composito (parametro "--mask").
    4. Indicare le dimensioni del file virione MAP per generare un modello composito della stessa dimensione (parametro "--size").
  3. Aprire il modello composito per visualizzazione in chimera.

Representative Results

Dimostriamo l'applicazione del flusso di lavoro media sub-tomogramma sopra descritta per il complesso busta glicoproteina del virus Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) utilizzando un set di dati precedentemente pubblicati 24. Parametri di raccolta dei dati e la raffinatezza sono elencate nella Tabella 1. Una tomogram rappresentativo è mostrato nella Figura 2.

Parametri (unità) Valore
La raccolta dei dati
Tensione (kV) 300
Ingrandimento calibrato (X) 111.000
Dimensione del pixel (Å) 5.4
Dose stimata (e - / A 2) 100
Underfocus (micron) 4,0-4,5
Prima di zero CTF (Å) un 26-30
Intervallo inclinazione (°) -60-60
Campionamento Tilt (°) 3
Dati e raffinatezza
Tomogrammi 11
Virioni 29
Semi per virione 106
Numero totale di semi 3.074
Spikes rilevati 1.346
Spikes dopo la rimozione di sovrapposizioni 1.401
Spikes dopo selezione basata cross-correlazione 1.022
Spikes inclusi nella media finale 1.022
Simmetria C3
Campionamento angolare (°) 8
Risoluzioneintervallo utilizzato nella raffinatezza (Å) 42-334
Stima risoluzione finale (A) B 35

Tabella 1: raccolta di dati e statistiche Bunyamwera raffinatezza.
un CTF, funzione di trasferimento di contrasto.
b Calcolato utilizzando Fourier shell correlazione tra due strutture indipendenti raffinati ad una soglia di 0.143.

Figura 2
Figura 2:. Fetta attraverso una tomografia di virioni Bunyamwera Diverse viste laterali picco evidenti nella periferia di ogni virione sono indicati con frecce. Il tomogramma è stato filtrato passa-basso a 60 Å. Barra di scala 100 nm.

In primo luogo, abbiamo perfezionato un modello iniziale con 205 punte raccolte manualmente ( (Figura 3B) ed è stato imposto nei successivi cicli di perfezionamento (Figura 3C). Per rilevare automaticamente tutte le punte sulle superfici virione, abbiamo generato 106 semi per ogni virione al raggio di 43 nm e la spaziatura di 20 gradi (Figura 4A) e iterativamente perfezionato le loro posizioni rispetto alla membrana (Figura 4B).

Figura 3
Figura 3: affinamento della struttura iniziale del modello. (A) cilindrica media (C100) modello costruito da posizioni definite manualmente di picchi. (B) In media densità dopo cinque turni di raffinatezza senza alcuna simmetria (C1) ha imposto mostra un picco con triplicecaratteristiche simmetriche. La risoluzione del modello è di 48 Å. (C) media del picco è stato risolto a 41 Å dopo cinque turni di raffinatezza con triplice simmetria.

Figura 4
Figura 4:. Affinamento dei semi AB) Un sottoinsieme di semi prima (A) e dopo B) affinamento (sono mostrate su una densità virione dalla figura 2 Semi in (B) sono stati codice colore in base ai rispettivi incrociata. coefficienti di correlazione (blu, bassa correlazione, rosso, alta correlazione).

Le migliori patch correlando glicoproteina picco (superiore al 75% dopo la rimozione di sovrapposizioni; ~ 1.000 picchi) sono stati utilizzati per calcolare la media finale. La media è stato risolto a 35-risoluzione (Figura 5). Ha rivelato una struttura picco trimeric nel mezzo, inOltre a qualche contributo da sei picchi vicini. Modelli compositi dei virioni, calcolato ponendo la struttura nelle posizioni note, rivelato posizionamento dei picchi sulla superficie del virione (Figura 6A). Di tanto in tanto, le patch in ordine localmente di picchi erano evidenti (Figura 6B).

Figura 5
Figura 5: struttura raffinata di una patch dello strato glicoproteina picco dopo il modello corrispondente. (AB) Due mappe 'anche' e 'strano', ricostruiti da due metà dei dati vengono visualizzati. Le due mappe mostrano un notevole grado di somiglianza, verificare la Validità dell'approccio. L'orientamento intorno all'asse lungo picco è diversa in quanto le due mappe sono state ricostruite completamente indipendente l'uno dall'altro. (C) media delle due mappe è mostrato inla risoluzione finale di 35 Å.

Figura 6
Figura 6: Posizionamento delle punte sul virione Bunyamwera. (A) modello composito di un virione. Vedi vettori (bastoni) indicano gli orientamenti delle punte. I colori indicano la cross-correlazione tra ogni picco e la struttura del modello (blu, bassa correlazione, rosso, alta correlazione). (B) A close-up di una patch ordinata di picchi.

Discussion

La conoscenza della struttura glicoproteina virale punta sulla membrana virione è essenziale per comprendere la replicazione del virus e lo sviluppo di terapie per trattare e prevenire le infezioni. Electron crio-microscopia combinata con un'unica media delle particelle è emerso come il metodo più utilizzato per risolvere le strutture di particelle del virus con involucro, comprese le punte glicoproteina. Tuttavia, questo metodo è limitato a icosahedrally virus simmetrici. Qui, attraverso l'applicazione di elettroni tomografia crio-e subtomogram media in Jsubtomo, abbiamo delineato un protocollo generale per determinare picchi glicoproteina su pleomorfo avvolto virus che non sono suscettibili di altre correnti metodi di biologia strutturale. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che la risoluzione di questo metodo è sufficiente a rivelare intuizioni architettura di dominio, oligomerizzazione, e l'organizzazione di ordine superiore di punte glicoproteina su virioni intatti.

jove_content "> La fase più critica all'interno di questo protocollo sta costruendo due modelli di partenza affidabili che sono statisticamente indipendenti gli uni dagli altri. esecuzione di questa operazione presuppone che picchi glicoproteina sono sufficientemente grandi e non ammassata contro l'altro troppo stretto, in modo che i singoli picchi può essere riconosciute visivamente e manualmente raccolte nel tomogrammi, e due modelli indipendenti media. Se ciò non è fattibile, due modifiche al protocollo possono essere tentate. Innanzitutto, due modelli casuali indipendenti possono essere costruiti in primo luogo la definizione di due sottoinsiemi casuali di subtomograms e poi media dei subtomograms all'interno di questi sottoinsiemi 30. secondo luogo, se una struttura del picco isolato è stato ricavato con altri mezzi, ad esempio cristallografia a raggi X, può essere utilizzato come modello di partenza. Tuttavia, la cura deve essere presa per bassa filtro passa questo modello utilizzando un cut-off a bassa risoluzione (50-70 Å), come i due modelli risultanti nel prossimo turno di raffinatezza volontàessere statisticamente indipendenti solo oltre questa risoluzione. A causa di questo avvertimento, si raccomanda il primo approccio.

La risoluzione ottenibile da questo protocollo dipende da quattro fattori principali: i. strategia di raccolta dei dati e la qualità dei dati in ingresso, ii. numero di subtomograms, iii. precisione di allineamento dei subtomograms, e iv. eterogeneità delle strutture. Mentre il primo e il secondo limite può essere ampiamente superato utilizzando rivelatori elevati segnale-rumore scalo elettroni combinati con CTF corretto tomografia e raccolta dati automatizzata, la precisione di allineamento è ulteriormente influenzata dalla dimensione e la forma della struttura di interesse stesso. Quando si applica questo protocollo sulle piccole punte prive di caratteristiche di spicco, può essere vantaggioso per legare i frammenti Fab per il picco di migliorare la precisione di allineamento e, quindi, la risoluzione 31. Infine, se le strutture siano in media presentano molteplici conformazioni, sub-TomogrMetodi di classificazione am possono essere utilizzati a media differenti conformazioni separatamente. A tal fine, Jsubtomo si integra con il pacchetto Dynamo, offrendo classificazione potente subtomogram 9.

Il protocollo di cui sopra è complementare alla cristallografia a raggi X di glicoproteine ​​virali isolati. Strutture cristallografiche possono essere inseriti nelle medie sub-tomogramma per ottenere l'orientamento preciso della glicoproteina rispetto alla membrana virione. L'applicazione di questa metodologia sarà senza dubbio continuerà a far luce sulla struttura del virus avvolto e patobiologia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Jsubtomo (ver 1.3.1) University of Oxford n/a www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7) NIAMS, NIH n/a bsoft.ws
UCSF Chimera UCSF n/a www.cgl.ucsf.edu/chimera

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