Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène

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Summary

Le dosage Focus Formation fournit une méthode simple pour évaluer le potentiel de transformation d'un oncogène candidat.

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Alvarez, A., Barisone, G. A., Diaz, E. Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene. J. Vis. Exp. (94), e51742, doi:10.3791/51742 (2014).

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Abstract

Introduction

Les cellules tumorales peuvent être distingués de leurs homologues normales par un large éventail de modifications, de profils d'expression génique pour Epigenomics à des changements morphologiques et proliferatives. Parmi ces derniers, réduction de la dépendance sur le sérum, la perte de contact (densité) l'inhibition, l'acquisition de la prolifération indépendante de l'ancrage et, finalement, la capacité de former des tumeurs lorsqu'elles sont injectées dans les animaux sont des indicateurs utiles, mesurables de transformation maligne 3. Plusieurs in vitro et in vivo ont été développés pour une transformation cellulaire. Les essais in vitro pour but d'identifier et de mesurer des changements dans la morphologie de culture (test de formation de mise au point), la dynamique de culture (taux de croissance, la densité de saturation) et le facteur de croissance (croissance en sérum réduite) ou un mouillage (croissance dans la gélose molle) exigences. La méthode de référence pour la détermination de la nature maligne d'un type de cellule reste la formation de tumeurs (les xénogreffes) chez les animaux expérimentaux. Cependant, til a coûté et la longueur des études in vivo ne font pas toujours les justifier comme une première étape de validation ou de dépistage des oncogènes candidats. Bien qu'aucun essai in vitro fournit une évaluation précise du potentiel oncogène d'un gène, ils ne donnent un aperçu de potentiel oncogène qui peuvent affiner l'avenir des études in vivo. L'un des systèmes les plus utilisés pour l'évaluation du potentiel oncogénique in vitro est la Focus Formation Assay 2. Cette approche repose sur l'utilisation de fibroblastes de souris NIH 3T3, une lignée cellulaire non transformée qui montre une forte inhibition de contact. Surexpression d'un oncogène résultats en perte de croissance dépendante de la densité; les cellules transformées peuvent ensuite se développer dans des couches multiples, formant "foyers", facilement visualisés contre la monocouche de cellules non transformées fond. La mise au point Formation Assay, puis, mesure la capacité d'un oncogène candidat à induire une transformation maligne, comme le montre la perte de contact inhibition comme un phénotype mesurable. La FFA a été utilisée pour évaluer la transformation par la surexpression de protéines kinases (par exemple Src 4, BRAF 5), des facteurs de transcription (par exemple, N-myc 6) récepteurs, G couplés à la protéine (par exemple, P2RY8 7) et GTPases (par exemple, , Ras 1), entre autres. La relative facilité de ce test, il est un bon choix qui fournira une réponse rapide et visuellement évident de savoir si la surexpression du gène est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes de souris NIH 3T3 in vitro.

La FFA décrit dans le présent protocole utilise la lignée cellulaire d'encapsidation Plat-E 8, qui fournit les protéines virales d'emballage, et le vecteur rétroviral 9 pBabePuro (Addgene plasmidique 1764) pour produire des retrovirus. Après la transfection avec la construction d'pBabePuro contenant le gène d'intérêt, la lignée cellulaire Plat-E produira retrovirus écotrope qui peut être utilisé pour infecter des cellules NIH 3T3. Tsa méthode virale de la livraison de gènes est plus efficace que les méthodes de transfection chimique traditionnels et offre un moyen d'exprimer le gène 10 durable. Une fois incorporé dans le génome de cellules NIH 3T3, la surexpression du gène d'intérêt est entraîné par le virus de longues répétitions terminales (LTR), le promoteur 11. Cette expression constante peut être utilisée pour déterminer si le gène d'intérêt a une activité oncogène, tel que mesuré par la formation de foyers sur les cellules NIH 3T3.

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Protocol

1. Faire les vecteurs viraux

Les séquences codant pour le gène d'intérêt, ainsi que des contrôles positifs et négatifs, sont insérés dans pBabePuro par des méthodes traditionnelles de clonage (amplification par PCR, digestion par restriction et ligature). Il ya quatre sites de restriction sur le vecteur où l'ADN peut être inséré: BamHI, SnaBI, EcoRI et Sali.

  1. Préparer transfection qualité plasmide ADN provenant de cellules compétentes en utilisant le kit de plasmide QIAGEN midi.
  2. Mesurer la concentration de l'ADN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop2000.

2. rétrovirus production

La lignée cellulaire d'encapsidation Plat-E est utilisé pour produire des retrovirus écotrope qui fournira l'ADNc d'intérêt à des cellules NIH 3T3.

  1. Établir Plat-E cultures de cellules congelées
    1. Dégeler rapidement les cellules Plat-E dans une ° C bain d'eau 37 et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter lentement 9 ml de milieu Plat-E (Dumilieu de Eagle modifié lbecco (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) + pénicilline et streptomycine).
    2. Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
    3. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu et de transfert Plat-E pour une boîte de culture de 10 cm.
    4. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à 80-90% (environ 2 jours).
  2. Fractionnement cellulaire
    1. Aspirer le milieu et laver les cellules une fois avec PBS.
    2. Ajouter 2 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incuber pendant 1 min à température ambiante.
    3. Détacher les cellules par tapotement des doigts, ajouter 10 ml de milieu Plat-E, et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml.
    4. Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
    5. Reprendre les cellules avec 10 ml de milieu Plat-E et semences dans de nouveaux plats au 1: 4-1: 6 dilutions.
  3. Plat-E semis et transfection
    1. Graine 2 x 10 6cellules par boîte de culture de 10 cm en utilisant un milieu Plat-E sans antibiotiques.
    2. Incuber les cellules O / N dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
    3. Le lendemain, transférer 300 pi d'Opti-MEM dans 1,5 ml tube de centrifugeuse.
    4. Ajouter 27 ul de polyéthylènimine (PEI), un réactif de transfection rentable 12, au tube préparé avec Opti-MEM. Mélanger doucement par tapotement des doigts et incuber pendant 5 min à température ambiante.
    5. Ajouter 9 pg d'ADN plasmidique transfection de qualité dans le tube Opti-MEM / PEI, mélanger doucement au vortex et incuber pendant 15 min à température ambiante.
    6. Ajouter l'ADN / PEI goutte à goutte complexe dans le plat Plat-E, et incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO 2.
    7. Le lendemain, aspirer le milieu contenant le réactif de transfection et ajouter 10 ml de milieu Plat-E frais (sans antibiotiques).
    8. Remettre les cellules dans l'incubateur.

3. Les cellules NIH 3T3 et les infections

  1. Établir NIHCultures et Semis 3T3
    1. Décongeler rapidement des cellules NIH 3T3 ° C dans un bain d'eau 37 et les transférer à un tube de 15 ml. Ajouter lentement 9 ml de milieu NIH 3T3 (DMEM + 10% de FBS).
    2. Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
    3. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu et NIH 3T3 transfert à une boîte de culture de 10 cm.
    4. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Il est très important que les cellules NIH 3T3 sont toujours maintenus underconfluent (50-60%), comme la fréquence de transformation spontanée (et donc les niveaux basaux de formation de foyers) augmente une fois par culture atteint la confluence.
    5. Seed 3 x 10 5 cellules par boîte de 10 cm et incuber O / N de l'infection le lendemain.
  2. Infection
    1. Récolter le surnageant retroviral de la boîte Plat-E en utilisant une seringue jetable de 10 ml, en le filtrant à travers un filtre en nylon de taille de la membrane de 0,45 um de pores, et en le transférant dans un 15 mltube.
    2. Ajouter 10 ml de milieu Plat-E frais aux cellules (sans antibiotiques), et les retourner à l'incubateur.
    3. Aspirer le milieu de l'antenne cellulaire NIH 3T3 d'être infectés, et ajouter 5 ml de milieu régulière NIH 3T3 et 5 ml de surnageant filtré contenant le virus.
    4. Ajouter à la boîte de polybrène à une concentration de 6 ug / ml.
    5. Incuber les cellules O / N à 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Le jour suivant, répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.5 pour un second tour de l'infection.
    7. Remplacez le support contenant le virus avec un milieu régulière NIH 3T3.
    8. Laisser les cellules NIH 3T3 à croître pendant 2-3 semaines, en remplaçant le milieu, si nécessaire. Vérifier expression de la protéine d'intérêt par électrophorèse des protéines classique et immunoblot des lysats de cellules entières de plaques de réplique.

4. coloration et quantification

  1. Coloration au cristal violet
    1. Aspirer le milieu NIH 3T3 et placez les platssur la glace.
    2. Laver les plats deux fois avec PBS glacé.
    3. Fixer les cellules avec du méthanol glacé pendant 10 min.
    4. Retirez les plats de la glace, aspirer le méthanol, et ajouter 3 ml de solution de cristal violet à 0,5% réalisés dans 25% de méthanol (RT).
    5. Incuber les boîtes pendant 5 min à température ambiante.
    6. Aspirer la solution de cristal violet et rincer soigneusement le plat avec Milli-Q H 2 O jusqu'au pas de couleur se détache dans le rinçage.
    7. Les laisser sécher O / N sur une paillasse (découverts).
  2. Foci Quantification
    1. Une fois les plats sont à sec, utiliser une règle pour mesurer les collections de couleur sombre de cellules sur la plaque. Ne compter que ceux qui sont plus de 5 mm de diamètre comme «foyers». Notez le nombre de foyers et de calculer des moyennes et de l'importance par rapport aux contrôles.

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Representative Results

MXD3 est une base hélice-boucle-hélice leucine fermeture à glissière (bHLHZ) facteur de transcription qui est un membre de la MYC / MAX / MAD réseau. Ce est un membre de la famille atypique de MAD 13 à 15, et il a été rapporté d'être impliqués dans la carcinogenèse 16,17. Par rapport à pBabePuro (contrôle négatif) et MYC (contrôle positif), les plats NIH 3T3 où MXD3 a été surexprimé avaient significativement moins foyers (figure 1A). Les données de la figure 1B ont été recueillies à partir de plusieurs expériences pour déterminer la signification.

Il y avait intérêt initial pour déterminer le potentiel oncogène de MXD3 parce qu'il a une activité similaire à MYC (l'oncogène connu). Cependant, les résultats de cet essai suggèrent que MXD3 ne fonctionne pas comme un oncogène.

Figure 1
Figure 1. Concentrez-test de formationRésultats. Le potentiel oncogénique de MXD3 a été déterminée par essai de formation de focalisation (FFA) dans des cellules NIH 3T3. (A) Les images de cellules provenant d'une seule expérience colorées avec Hema 3. Note: Cristal Violet peuvent être utilisés comme une tache alternative. (B) Les résultats combinés des trois expériences. Toutes les expériences ont été réalisées en double. Concentrer compte pour chaque expérience sont les suivants: Expérience n ° 1: pBabePuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); Expérience n ° 2: pBabePuro (8, 7), MXD3 (1, 0), N-MYC (22, 20); Expérience n ° 3: pBabePuro (9, 20), MXD3 (3, 0), N-MYC (21, 12). Les barres d'erreur représentent l'écart type de nombre de foyers dans les trois expériences. Signification: ** p <0,01; *** P <0,001. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La FFA fournit une méthode rapide et facile pour évaluer la transformation maligne in vitro. Il se prête à la projection d'un nombre relativement important de gènes candidats, et ses exigences techniques modestes rendre rentable. En outre, deux ou plusieurs gènes peuvent être co-exprimés (parfois appelé un dosage "coopération") pour évaluer le potentiel tumorigène de la combinaison. Les avantages de ce test se appuient sur sa technique simple, sa facilité de quantification et de sa relativement courte demi-tour fois. Il faut souligner, cependant, qu'il ne pose les limites de tous les tests in vitro. Le test évalue la transformation oncogénique en mesurant une caractéristique phénotypique des cellules cancéreuses, à savoir leur capacité à croître au-delà d'une monocouche dans une boîte de culture. Les résultats négatifs, doivent donc être interprétés avec prudence, comme un oncogène particulier peut induire une transformation sans la promotion de ce phenotyp particuliere ou peut nécessiter la co-expression avec un autre gène (par exemple, la coopération mentionné ci-dessus). Dans ce cas, il est recommandé d'évaluer la transformation par d'autres méthodes in vitro, telles que la détermination de la vitesse de prolifération et les exigences du sérum et / ou la croissance indépendante d'ancrage, par exemple, le dosage de la gélose molle.

Bien que la technique de la FFA est simple, plusieurs conditions doivent être respectées. Surtout, il est essentiel d'utiliser un sous-clone de cellules 3T3 qui montre une très faible transformation spontanée. Étant pré-néoplasique (une caractéristique qui rend cette lignée cellulaire très sensible pour ce test), certains flacons peuvent contenir un grand nombre de cellules déjà transformées, résultant en des niveaux de base élevés inacceptables pour le dosage. Pour minimiser transformation spontanée, il est très important que la culture de départ est obtenu à partir d'une source fiable. En outre, les cellules doivent être repiquées à intervalles réguliers et ne ont jamais permis d'atteindre la confluence.Nous vous recommandons de passer cultures quand ils atteignent environ 50% de confluence. Pour cette raison, il est important de créer des constructions supplémentaires à utiliser comme témoins. Dans nos expériences, nous avons utilisé pBabePuro contenant MYC (un oncogène connu) 18 et vide pBabePuro pour servir de contrôle positif et négatif, respectivement.

Le produit d'assemblage d'intérêt peut être introduit dans les cellules 3T3 en utilisant une variété de procédés; le plus souvent, les procédés de transfection classiques ont été utilisées. Dans le protocole présenté ici, l'utilisation de transduction virale fournit un procédé fiable, efficace et uniforme de délivrance de gène. En outre, l'utilisation de rétrovirus écotrope rend ce test relativement sûr lors de la manipulation des constructions oncogènes potentiels; Cependant, des précautions de biosécurité appropriées doivent bien entendu être respectées.

Lors de la réalisation du protocole ci-dessus, des expériences de plaques répliques doivent être effectuées pour les deux cellules de taches et de récolte de celles plAtes. Les cellules récoltées peuvent ensuite être utilisées pour confirmer la surexpression du gène d'intérêt par immunoblot.

Bien que la délivrance de gènes viral présente plusieurs avantages par rapport à la transformation, il convient de noter qu'elle ne présente des inconvénients aussi bien, et de nombreux laboratoires utilisent encore des protocoles de transformation standard. Transduction virale peut ne pas être adapté lorsque une forte surexpression est nécessaire; d'autre part, la pertinence physiologique des niveaux très élevés d'expression obtenue par transfection du plasmide pourrait être sujette à caution.

Enfin, il convient de souligner qu'un second essai est généralement nécessaire de vérifier que les foyers sont dus à la transformation oncogénique. Les foyers peuvent être ramassés (avant la coloration) et cultivées en gélose molle pour confirmer prolifération indépendante de l'ancrage.

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Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par une subvention du Programme de bourse de nouveau Innovateur du directeur des NIH (ED). AA a été financé en partie par des prix de premier cycle de l'Institut national du cancer et la Fondation nationale des sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pBABE-puro vector Addgene Plasmid 1764 cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic Cell Biolabs, Inc. RV-101 cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine Sigma-Aldrich 93061524 cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe BD Biosciences 309604 viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter Whatman 6750-2504 viral production reagent
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc. 23966-2 cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent EMD Millipore TR-1003-G cell transfection reagent
Crystal Violet Fisher Scientific C581-25 cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit QIAGEN 12945 plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes BD Biosciences 353003 cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065 cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985-062 cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000-044 cell culture media

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References

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