Fokus Formation: En cellbaserad analys för att Bestäm onkogen potential av en gen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Focus Formation analys ger en enkel metod för att bedöma omvandla potential för en kandidat onkogen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Alvarez, A., Barisone, G. A., Diaz, E. Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene. J. Vis. Exp. (94), e51742, doi:10.3791/51742 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Tumörceller kan skiljas från deras normala motsvarigheter genom en rad olika förändringar, från mönstren för genuttryck till epigenomik till morfologiska och proliferativa förändringar. Bland de senare, minskat beroende av serum, förlust av kontakt (densitet) inhibition, förvärv av förankringsoberoende spridning och, i slutändan, förmågan att bilda tumörer när de injiceras i djur är användbara, mätbara indikatorer på malign transformation 3. Flera in vitro och in vivo har utvecklats för cellulär transformation. In vitro-analyser syftar till att identifiera och mäta förändringar i kultur morfologi (fokusbildningsanalys), kulturdynamik (tillväxt, mättnad densitet) och tillväxtfaktor (tillväxt i reducerad serum) eller ankar (tillväxt i mjuk agar) krav. Guldmyntfoten för att fastställa den maligna karaktären av en celltyp förblir tumörbildning (xenotransplantat) hos försöksdjur. Emellertid tHan kostade och längd in vivo-studier inte alltid göra dem motiveras som ett första valideringssteg eller screening av kandidat onkogener. Även om ingen in vitro-analys ger en definitiv bedömning av den onkogena potentialen hos en gen, de ge insikt i onkogen potential som kan begränsa framtida in vivo-studier. En av de mest använda systemen för utvärdering onkogen potential in vitro är Focus Formation analys 2. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på användning av NIH 3T3-mus-fibroblast, en icke-transformerad cellinje som uppvisar kraftig kontakthämning. Överuttryck av en onkogen resulterar i förlust av densitetsberoende tillväxt; transformerade celler kan sedan växa i flera lager, som bildar "härdar", lätt visualiseras mot bakgrund monolager av icke-transformerade celler. Focus Formation analys, då mäter förmågan hos en kandidat onkogen att inducera malign transformation, vilket framgår av förlusten av kontakt inhibition som en mätbar fenotyp. FFA har använts för att utvärdera transformation genom överuttryck av proteinkinaser (t.ex., Src 4, BRAF 5), transkriptionsfaktorer (t.ex., N-myc-6), G-proteinkopplade receptorer (t.ex. P2RY8 7) och GTPaser (t.ex. Ras 1), bland andra. Den relativa lätthet av denna analys gör det till ett bra val som kommer att ge en snabb och visuellt tydligt svar på om överuttryck av genen är tillräcklig för att omvandla NIH 3T3 musfibroblastceller in vitro.

Den FFA beskrivs i detta protokoll använder Plat-E packningscellinje 8, vilket ger virala förpackningsproteiner, och retrovirusvektorn pBaBepuro 9 (Addgene plasmid 1764) att producera retrovirus. Efter transfektion med pBabePuro konstruktion innehållande genen av intresse, kommer Plat-E-cellinjen producerar ekotropiska retrovirus som kan användas för att infektera NIH 3T3-celler. Thans viral metod genavgivning är effektivare än traditionella kemiska transfektionsmetoder och erbjuder ett sätt att på ett hållbart sätt uttrycka genen 10. När den väl införlivats i genomet av NIH 3T3-celler, är överuttryck av genen av intresse driven av den virala långa terminala upprepningar (LTR) promotom 11. Denna konstant uttryck kan användas för att bestämma om den intressanta genen har onkogen aktivitet, mätt genom bildandet av foci, på NIH 3T3-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Göra virala vektorer

De kodande sekvenser för genen av intresse, liksom de positiva och negativa kontroller, sätts in pBaBepuro med traditionella kloningsmetoder (PCR-amplifiering, restriktionsspjälkning och ligeringsprodukter). Det finns fyra restriktionsställen på vektorn där DNA kan införas: BamHI, SnaBI, EcoRI och Sall.

  1. Förbered transfektion kvalitet plasmid DNA från kompetenta celler med QIAGEN plasmid midi kit.
  2. Mät DNA-koncentrationen med användning av en NanoDrop2000 spektrofotometer.

2. Retrovirus Produktion

Plat-E packningscellinje kommer att användas för att producera ekotropiska retrovirus som kommer att leverera den cDNA av intresse till NIH 3T3-celler.

  1. Etablera Plat-E kulturer från frysta celler
    1. Snabbt tina Plat-E-celler i ett 37 ° C vattenbad och överför till en 15 ml koniska rör. Långsamt 9 ml Plat-E-medium (Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% fetalt bovint serum (FBS) + penicillin och streptomycin).
    2. Centrifugera röret vid 180 x g under 5 min och kasta bort supernatanten.
    3. Återuppslamma cellerna med 10 ml Plat-E medium och överföring till en 10 cm odlingsskål.
    4. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator tills de är 80-90% sammanflytande (ca 2 dagar).
  2. Celldelnings
    1. Aspirera medium och tvätta cellerna en gång med PBS.
    2. Tillsätt 2 ml av 0,05% trypsin-EDTA och inkubera i 1 min vid RT.
    3. Lossa cellerna genom finger tapping, tillsätt 10 ml Plat-E-medium, och överföra cellsuspensionen till en 15 ml tub.
    4. Centrifugera röret vid 180 x g under 5 min och kasta bort supernatanten.
    5. Resuspendera cellerna med 10 ml Plat-E medium och utsäde dem i nya rätter på 1: 4-1: 6 utspädningar.
  3. Plat-E sådd och transfektion
    1. Seed 2 x 10 6celler per 10 cm odlingsskål med hjälp Plat-E-medium utan antibiotika.
    2. Inkubera cellerna O / N i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
    3. Nästa dag, överför 300 pl av Opti-MEM till 1,5 ml mikrofugrör.
    4. Lägg 27 pl polyetylenimin (PEI), en kostnadseffektiv transfektionsreagens 12, till den förberedda röret med Opti-MEM. Blanda försiktigt genom finger tapping och inkubera i 5 min vid RT.
    5. Lägg 9 pg av transfektion-grade plasmid-DNA i Opti-MEM / PEI tub, blanda försiktigt genom att vortexa och inkubera i 15 min vid RT.
    6. Lägg DNA / PEI-komplex droppvis till Plat-E skålen, och inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
    7. Nästa dag, aspirera mediet innehållande transfektionsreagens och tillsätt 10 ml färsk Plat-E-medium (utan antibiotika).
    8. Återgå cellerna till inkubatorn.

3. NIH 3T3 Celler och Infektion

  1. Etablering NIH3T3 kulturer och sådd
    1. Snabbt tina NIH 3T3-celler i en 37 ° C vattenbad och överför till en 15 ml tub. Tillsätt långsamt 9 ml NIH 3T3-medium (DMEM + 10% FBS).
    2. Centrifugera röret vid 180 x g under 5 min och kasta bort supernatanten.
    3. Resuspendera cellerna med 10 ml NIH 3T3 medium och överföring till en 10 cm odlingsskål.
    4. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Det är mycket viktigt att NIH 3T3-celler hålls alltid underconfluent (50-60%), när frekvensen av spontan omvandling (och därför basala nivåer av foci bildning) ökar en gång per kulturen når konfluens.
    5. Seed 3 x 10 5 celler per 10 cm skål och inkubera O / N för infektion nästa dag.
  2. Infektion
    1. Skörda den retrovirala supernatanten från Plat-E skålen genom att använda en 10 ml engångsspruta, filtrera den genom ett 0,45 ^ m porstorlek nylonmembranfilter, och överföra den in i en 15 mlrör.
    2. Tillsätt 10 ml färsk Plat-E-medium till cellerna (utan antibiotika), och återlämna dem till inkubatorn.
    3. Sug mediet från NIH 3T3 cell skålen vara smittade, och tillsätt 5 ml regelbunden NIH 3T3 medium och 5 ml virusinnehållande filtrerat supernatant.
    4. Lägg polybren till skålen vid en koncentration av 6 ug / ml.
    5. Inkubera cellerna O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
    6. Nästa dag, upprepa steg 3.2.1 - 3.2.5 för en andra omgång av infektion.
    7. Byt virusinnehållande medium med regelbundna NIH 3T3-medium.
    8. Låt NIH 3T3-celler växa under 2-3 veckor, ersätta mediet vid behov. Kontrollera expression av proteinet av intresse genom konventionell proteinelektrofores och immunoblotting på helcellslysat från replika plattor.

4. Färgning och Kvantifiering

  1. Crystal Violet Färgning
    1. Sug NIH 3T3 medium och placera rätterpå is.
    2. Diska två gånger med iskall PBS.
    3. Fixera cellerna med iskall metanol för 10 minuter.
    4. Ta bort rätter från isen, aspirera metanol, och tillsätt 3 ml 0,5% kristallviolett lösning som gjorts i 25% metanol (RT).
    5. Inkubera skålarna i 5 min vid RT.
    6. Aspirera kristallviolettlösning och försiktigt skölja skålen med Milli-Q H2O tills ingen färg lossnar i sköljningen.
    7. Låt disken torka O / N på en bänk (avtäckt).
  2. Foci Kvantifiering
    1. När rätter är torr, använd en linjal för att mäta de mörkt färgade samlingar av celler på plattan. Endast räkna de som är större än 5 mm i diameter som "härdar". Anteckna antalet härdar och beräkna medelvärden och betydelsen jämfört med kontrollerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MXD3 är en grundläggande helix-loop-helix leucinzipper (bHLHZ) transkriptionsfaktor som är en medlem av MYC / MAX / MAD nätverk. Det är ett atypiskt medlem av MAD familjen 13-15, och det har rapporterats vara inblandad i carcinogenes 16,17. Vid jämförelse med pBaBepuro (negativ kontroll) och MYC (positiv kontroll), de NIH 3T3 rätter där MXD3 överuttrycktes hade signifikant färre foci (Figur 1A). Data i Figur 1B uppsamlades från flera experiment för att bestämma betydelse.

Det fanns initialt intresse i att bestämma MXD3 s onkogen potential eftersom det har liknande aktivitet till MYC (den kända onkogen). Men resultaten från denna analys antyder att MXD3 inte fungerar som en onkogen.

Figur 1
Figur 1. Fokusbildningsanalysresultat. Den onkogena potentialen hos MXD3 bestämdes genom fokusbildningsanalys (FFA) i NIH 3T3-celler. (A) Bilder av celler från ett enda experiment färgas med Hema 3. Obs: Crystal Violet kan användas som ett alternativ fläck. (B) Kombinerade resultat från tre försök. Alla experiment utfördes i duplikat. Fokus räknas för varje experiment är följande: Experiment # 1: pBaBepuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); Experiment # 2: pBaBepuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); Experiment # 3: pBaBepuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). Felstaplar representerar standardavvikelsen för antalet härdar över tre experiment. Betydelse: ** p <0,01; *** P <0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FFA erbjuder en snabb och enkel metod för att utvärdera malign transformation in vitro. Det är mottaglig för screening av ett relativt stort antal kandidatgener, och dess blygsamma tekniska krav gör det kostnadseffektivt. Vidare kan två eller flera gener samuttrycks (ibland hänvisad till som en "samarbete" -analys) för att utvärdera den tumorogena potentialen hos kombinationen. Fördelarna med denna analys förlita sig på sin enkla teknik, dess enkla kvantifiering och dess relativt korta turn-around tid. Det måste dock understrykas, att den inte utgör begränsningarna av alla in vitro-analyser. Analysen utvärderar onkogen transformation genom att mäta en fenotypisk egenskap hos cancerceller, nämligen deras förmåga att växa bortom ett monoskikt i en odlingsskål. Negativa resultat bör därför tolkas med försiktighet, eftersom en viss onkogen kan inducera omvandling utan att främja denna phenotype eller kan kräva koexpression med en annan gen (dvs. nämnt samarbetet ovan). I detta fall är det rekommenderat att bedöma omvandling av andra in vitro-metoder, såsom bestämning av spridningshastighet och krav serum och / eller förankringsoberoende tillväxt genom till exempel den mjuka agar-analysen.

Även om FFA tekniken är enkel, måste flera villkor iakttas. Viktigast är det viktigt att använda en subklon av 3T3-celler som visar mycket låg spontan transformation. Att vara pre-neoplastiska (en funktion som gör denna cellinje mycket känsliga för denna analys), kan vissa flaskor innehåller ett betydande antal redan transformerade celler, vilket resulterar i oacceptabelt höga basala nivåer för analysen. För att minimera spontan transformation är det mycket viktigt att startkulturen erhålls från en känd källa. Dessutom bör cellerna subodlas med jämna mellanrum och aldrig tilläts nå sammanflytning.Vi rekommenderar passerar kulturer när de når ca 50% sammanflytning. Av denna anledning är det viktigt att skapa ytterligare konstruktioner för att använda som kontroller. I våra experiment använde vi pBaBepuro innehåller MYC (en känd onkogen) 18 och tom pBaBepuro att fungera som positiva och negativa kontrollen, respektive.

Konstruktionen av intresse kan införas i 3T3-celler med användning av en mängd olika metoder; vanligast, har traditionella transfektion metoder använts. I protokollet presenteras här, användningen av viral transduktion ger en tillförlitlig, effektiv och konsekvent metod för gen leverans. Dessutom gör denna analys relativt säkra att använda ekotropiska retrovirus vid hantering potentiella onkogena konstruktioner; bör dock lämpliga biologiska säkerhetsrutiner naturligtvis följas.

Vid genomförande av ovanstående protokoll, bör replika plattförsök göras för att både bets och skörd celler från dem plates. De skördade cellerna kan sedan användas för att bekräfta överuttryck av genen av intresse genom immunoblot.

Även viral gen leverans innebär flera fördelar jämfört med transformation, bör det noteras att den gör presentera några nackdelar också, och många labb fortfarande använda standardtransformationsprotokoll. Viral transduktion kanske inte passar när starkt överuttryck behövs; å andra sidan kan den fysiologiska betydelsen av mycket höga nivåer av expression uppnås genom plasmidtransfektion vara diskutabelt.

Slutligen bör det understrykas att en andra analys krävs vanligtvis att kontrollera att de härdar beror på onkogen transformation. Fokus kan plockas (före färgning) och odlas i mjuk agar för att bekräfta förankringsoberoende spridning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH direktörens Nya Innovator Award Program (ED). AA stöddes delvis av grund utmärkelser från National Cancer Institute och National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pBABE-puro vector Addgene Plasmid 1764 cloning vector
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic Cell Biolabs, Inc. RV-101 cell line for viral production
NIH 3T3 Cell Line murine Sigma-Aldrich 93061524 cell line for focus formation assay
10 ml BD Luer-Lok tip syringe BD Biosciences 309604 viral production reagent
0.45 μm Puradisc Syringe Filter Whatman 6750-2504 viral production reagent
Polyethylenimine (PEI) Polysciences, Inc. 23966-2 cell transfection reagent
Polybrene Infection / Transfection Reagent EMD Millipore TR-1003-G cell transfection reagent
Crystal Violet Fisher Scientific C581-25 cell stain reagent
Plasmid Plus Midi Kit QIAGEN 12945 plasmid purification
BD Falcon Tissue Culture Dishes BD Biosciences 353003 cell culture supplies
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065 cell culture media
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 cell culture supplies
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985-062 cell culture media
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000-044 cell culture media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. 255-395 (1995).
  2. Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
  3. Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
  4. Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
  5. Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
  7. Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
  8. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
  9. Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  11. Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
  12. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
  13. Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
  14. Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
  15. Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
  16. Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
  17. Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
  18. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics