Ultrastrüktürel Analizler için Maya endozomal Sisteminin Nanogold Etiketleme

1Department of Cell Biology, University Medical Center Utrecht
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Maya, Saccharomyces cerevisiae, endozomal sistemin biogenezi ve fonksiyonlarını düzenleyen genleri tanımlamak ve incelemek için bir anahtar bir model organizma olmuştur. Burada ince yapı çalışmaları için endozomal bölmelere spesifik etiketlenmesi için detaylı bir protokol mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mari, M., Griffith, J., Reggiori, F. Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses. J. Vis. Exp. (89), e51752, doi:10.3791/51752 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Endosomlar ökaryotik hücrelerde kontrol noktaları sıralama önemli membran biri olan ve daha çok plazma zarı ve Golgi proteinlerin geri dönüştürülmesi ya da imha düzenler. Bunun bir sonucu olarak endozomal sistemi, hücre homeostazın sürdürülmesinde bir rol oynar ve veziküler taşıma araçları ile birbirine organel bu ağa ait olan genlerdeki mutasyonlar, kanser ve nörobiyolojik bozukluklar da dahil olmak üzere ciddi bir probleme yol açar. Bu endozomal sisteminin biogenezi ve organizasyon altında yatan mekanizmaları anlamak için bu nedenle asal öneme sahiptir. Maya Saccharomyces cerevisiae bu görevde önemli olmuştur. Özellikle etiket ve ultrastrüktürel düzeyde bu model organizmanın endozomal sistemi analiz etmek için, biz burada bir gümüş güçlendirme reaksiyonu ile bu parçacıkların görselleştirme ardından spheroplastlar tarafından pozitif yüklü nanogold alımı için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yöntem, aynı zamanda, bir çok değerli olduğuendozomal kaçakçılığı kusurları ile mutantların morfolojik inceleme için l. Ayrıca, sadece elektron mikroskobik inceleme için geçerlidir, ama aynı zamanda protein lokalizasyonu araştırmalar için immünolojik labelings ile kombine edilebilir.

Introduction

Endozomal Sistem 1,2 reseptörleri lizozomal enzim ayırma reseptörlerinin ticareti ve plazma membranı (PM) geri dönüşüm de dahil olmak üzere çok sayıda çok önemli hücresel rol oynayan önemli bir zar sıralama aletidir. Endosomlar üç farklı bölümlerinde, yani ayrılır. Erken endozomlar (EE), geç endozomlar (LE) ve geri dönüşüm endozomlar. Bu sınıflandırma da spesifik bir işaretleyici proteinler ve onların morfolojisi üzerine, onlara ulaşmak için endositeze malzeme için gereken zaman dayanmaktadır. PM den içselleştirilmiş membranlar, yani protein ve lipid çift, iki bozulması için Endozomlar yoluyla lızozomlara teslim edilebilir ya da geri dönüştürülebilir. Membranlar da lızozomlara devam veya geri Golgi'ye alınmak ya, benzer Golgi'ye gelen Endozomlar taşınan ve edilmektedir. Ayrıca, protein endozomal sınırlayıcı zarın oluşumuna yol açan bir işlem içeri doğru tomurcuklanma lümen vezikülleri içine sıralanabilirLE bir alt kategori, multiveziküler organları.

Maya endozomal sistemi göreceli olarak daha az karmaşık, yüksek ökaryotik hücrelerin olandan. Maya endozomlar EE ve LE ayrılır. Bu geri dönüşüm endozomları değil, aynı zamanda dokuya özel lizozom ilgili organellere içermeyen memeli hücrelerinin tersine. Dolayısıyla onlar endozomal kaçakçılık yollarının 3,4 daha az karmaşık bir ağ var. Bu nedenle, maya temsil hala endozomal sistemindeki temel ilkeler zar trafiğin bir çalışma için avantajlı bir deneysel sistem temsil vardır. Bu avantaj, endozomal yollarıyla ilgili çok sayıda gen başlangıçta 5 maya genetik ekranlar ile izole edilmiş gerçeği ile vurgulanmıştır. Vahşi tip ve mutant maya hücrelerinde endozomal sisteminin kapsamlı biyokimyasal ve floresan mikroskobu yaklaşımlar kullanılarak incelenmiştir da, ultra-yapı seviyesinde bu araştırma tek olmuşturminimal. Endozomal organellerin çoğunun kesin tanımlama 6 zorlaştırır floresan mikroskobu ile noktasal yapılar olarak tespit edilir, çünkü Şekil incelemesi maya içinde özellikle önemlidir. Ne yazık ki maya endozomal protein belirteçlerinin tanıma antiserumların sadece sınırlı sayıda (IEM) preparatları 7-10 immün elektron-mikroskopi çalışıyor. Bazı proteinleri için, bu sorun, ilgi konusu genin endojen etiketleme ve 7,11,12 tespit etmek için etiketi tanıyan bir antikorun kullanılması engellenebilecektir edilmiştir. Ancak genellikle, proteinler, bunların düşük sentezleme seviyeleri IEM ile tespit edilemez. Bu yaklaşım, morfoloji / fonksiyonları yanlış lokalizasyonu ve / veya değişiklik oluşturabileceği nedeniyle aşırı ifadesi bir çözüm değildir. Böylece elektron mikroskobu EM tarafından saptanabilen bir prob ile endositik bölmelerin etiketleme etkili bir seçenektir. Bu, özellikle eğer iyi bir çözüm değildir prObe belirli bir organelini 6 işaretlemek ne zaman bilmek sağlayan bir zamana bağlı bir şekilde endositik güzergahı giriyor.

Maya spheroplastlar (hücre duvarı enzimatik kaldırılmıştır, yani. Maya) ile pozitif yüklü nanogold alımı, başarılı bir şekilde, maya endozomal 10 bölmeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu partiküller biyolojik zarların oluşturan negatif yüklü lipidler bağlanır. Böylece AM ile pozitif yüklü nanogold ortakları, endositoz ile hücre nüfuz eder ve vakuol ulaşmadan önce EE ve LE geçer. Bu küçük altın partikülleri, ancak, EM tarafından görülecek uygun bir büyüklüğe sahip değildir. Onları görünür kılmak için, boyutları altın prob yaklaşık 13-15 gümüş ya da altın çökelmesi yol açan kimyasal reaksiyonlar ile büyütülebilir. Biz geliştirdik ve başarıyla subsellüler gerçekleştirmek için Tokuyasu yöntemine dayalı bir IEM yaklaşım uyguladıkyerelleştirme 8,16 çalışmalar. Bu yöntem, morfolojisi 8,17-24 mükemmel bir çözünürlüğe sahip maya hazırlıkları immunogold etiketleme performans sağlar. Biz de 6 bölmeleri maya endozomal sisteminin nanogold etiketleme ile bu IEM protokolü birleştirerek bir prosedür kurduk. Biz morfolojik kusur 6,25 bir endozomal kaçakçılığı ile mutantlar endozomların farklı alt sınıflarını karakterize ve ultrastruktural inceleyen bu yaklaşımı kullanarak. Ayrıca, bu nanogold etiketleme immünolojik etiketleri en farklı endozom alt grupları üzerinde ilgi konusu bir proteinin dağılımını keşfetmek için imkanı sağlayan kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Burada, pozitif yüklü nanogold ile maya endozomal sisteminin etiketleme pratikte nasıl gerçekleştirildiğini mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Sferoplast Hazırlık

  1. Deneyin tasarımı ile belirlenen uygun bir ortam, 10 ml, 30 ° C'de gece boyunca maya inkübe edin.
  2. Bir gün sonra, bir fotometre kullanılarak 600 nm (OD 600) de, kültürün optik yoğunluğu ölçmek bir OD 0,2-0,4 600 aynı kültür ortamı içinde seyreltilir ve hücrelere tasarımında sürece üstel büyüme fazına büyüyebilir deneyi farklı bir durum gerektirir. Kültür OD 1-2 600 olduğunda Hücreler üslü faza içindedir.
  3. 50 ml'lik bir tüp içinde 5 dakika boyunca 3500 x g'de santrifüj ile hücreler 10 OD 600 eşdeğer toplayın. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atın.
  4. 100 mM PIPES (pH 9.6), 5 ml, 10 mM ditiyotreitol ve 10 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe hücre pelletini.
  5. 5 dakika boyunca 3500 x g'de santrifüj ile tekrar hücreleri toplamak. Süpernatant atın.
  6. Hücrelerin tekrar in, 1 M sorbitol ve litik enzimin, 5 mg ihtiva eden (Deneyin tasarımı ile belirlenir) ve yumuşak 30 dakika boyunca çalkalama ile 30 ° C'de inkübe karışımı ortam 5 ml.
  7. Spheroplastlar karşılık gelen pelet fraksiyonu toplamak için 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant atın.
  8. Buz gibi soğuk 960 ul ortam içerisinde yeniden süspanse spheroplastlar, 1 M sorbitol ihtiva eden (ortam Deneyin tasarımı ile belirlenir) ve bir buz soğuk 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine karışımı aktarın.

2.. Nanogold Alımı

  1. Bir pipet kullanarak, yumuşak su 40 ul içinde yeniden süspansiyon haline getirildi pozitif yüklü parçacıkların nanogold 4 nmol ile sferoplast karıştırın. Karışımın nihai hacmi 1 ml olmak zorundadır.
  2. 15 dakika boyunca buz üzerinde, elde edilen hücre süspansiyonu yerleştirin.
  3. Oda sıcaklığında süspansiyonu aktarın ve e nanogold içselleştirilmesi izin gerekli süre boyunca inkübendocytosis.
    NOT: 15 dakika alımı (erken ve geç endozomları) tüm endozomal sistemi işaretlemek için izin verir ise bir 5 dk alımı başta, endositik kesecikler ve erken endozomal bölmeleri etiketlenmesine yol açacaktır. Daha uzun inkübasyon zamanları (en fazla 30 dakika) de vakuol etiket için izin verir.
    NOT: Darbe kovalayıcı etiketleme deneyleri, bu yöntem ile gerçekleştirilemez. LE analizinde etiketleme, bu nedenle, aynı zamanda nanogold AM ve INEE de tespit edilecektir.

3.. Fiksasyon ve Bölünmesi

  1. Çift gücü fiksatif 1 ml ilave etmek suretiyle nanogold alımını durdurma [% 4 paraformaldehit (PFA), 0.1 M PHEM tampon maddesi içinde% 0.4 glutaraldehid (GA) (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6.9, 20 mM EGTA, 4 mM MgC! 2)] hücre süspansiyonuna 1 M sorbitol ihtiva etmektedir. Oda sıcaklığında tüpü devam etti.
  2. Yavaşça (bu spheroplastlar tutmaya izin verir 30 dakika boyunca micocentrifuge Tüpleri el ile birkaç kez ters çevirinsüspansiyon) ve daha sonra 25 saniye boyunca 1700 xg iki kez santrifüj.
  3. Süpernatantı atarak ve taze standart gücü fiksatif 1 ml (% 2 PFA, 0.1 M PHEM tampon maddesi içinde% 0.2 GA) 1 M sorbitol ihtiva eden, yavaşça dönen bir tekerlek üzerinde, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe ekleyerek fiksatif değiştirin.
  4. Daha önce tarif edildiği gibi, 6 cryo-kesit için hücreleri işleyin. Not: nanogold alımı ve gümüş geliştirme prosedürleri için, belirtilen protokol açıklanan periyodik asit muamele yapılması için değil. Periyodik asit muamelesi daha hücre duvarı permeabilize 26, ancak bu yapı spheroplastlar üretimi sırasında elimine edilmiştir.
  5. Önce 8 açıklandığı gibi bir UCT'de ultramikrotom kullanılarak kuru elmas bıçak ile -120 ° C de 50 nm ince cryosections kesilmiş ve 50 nikel ızgaralarını hasır kaplı Formvar karbon üzerine koyun.

Nanogold Partikül Visua boyunca 4. Silver Cinsellization

Not: Reaksiyon karışımları hazırlamak için prosedür temelde, üretici tarafından belirtilen biridir. Bu protokolü kullanarak pratik uyarlamaları, cryosections üzerinde gümüş geliştirme prosedürü etkin ve güvenilir kılar.

  1. Dondurucu gümüş güçlendirme seti çıkarın ve bir 37 ° C kuluçka makinesi ya da su banyosu içinde eritin. Çözülmüş zaman, (4.7 bakınız) kullanıma kadar karanlık bir odaya yerleştirilen bir 24 ° C inkübatör kiti yerleştirin.
  2. Karanlık bir odada, ısıtma plakasını ve 24 ° C nihai sıcaklığa ısınmasına
  3. Yüzey koruyucu, parlak tarafı üste, ve bir bantla sabitleyin ısıtma plakasının üst kapağı.
  4. Benchkote üzerinde Parafilm koyun ve karanlıkta Parafilm kenarları görmek mümkün siyah işaretleyici ile kenarları işaretleyin.
  5. Isıtma plakasının sıcaklığını izlemek için Benchkote üstündeki bir termometre bantlayın. Yavaş yavaş sıcaklığını ayarlamak değilse 24 ° C.
  6. Plaiki kez damıtılmış su ve içinde gümüş güçlendirme seti ile 50 ml tüp ce.
  7. Iki kez damıtılmış su ile küçük bir Petri kapları doldurmak, 37 ° C'de önceden ısıtılmış Suda ızgaraları yerleştirin, 30 dakika boyunca, aşağı tarafı numune.
  8. Bu 4.7 adımı bir kez daha tekrarlayın.
  9. Saklama kutusunda ızgaraları aktarın ve karanlık odaya getirmek.
  10. Isıtma plakası üzerinde sabitlenmiş olan Parafilm yerleştirilen 24 ° C 'de iki kere damıtılmış su içinde birkaç damla on (aşağı numune yüzü) geçirilerek yeniden ızgaraları durulayın.
  11. 9 ek olarak çift distile su damlaları gümüş güçlendirme reaksiyondan sonra durulama için, Parafilm hazır olduğundan emin olun.
  12. Işığı kapatın ve tüm ışıklar kapalı olduğundan emin olun. Kırmızı ışık açın.
  13. 24 ° C inkübatör gümüş geliştirme kiti A ve B çözümler dışarı atın.
  14. Ilk olarak bir çözelti, 6 damla ve 1,5 m olarak B çözeltisi daha sonra 6 damla koymakl mikrosantrifüj tüp ve baloncuklar yapmak için kaçınarak bir cam Pasteur pipeti ile iyice karıştırın. Çözelti, oldukça kalın olup, son olarak el ile kısaca girdaplama önce bir pipet ile karıştırılmalıdır.
  15. Geri 24 ° C inkübatör A ve B çözümler koyun ve C çözüm çıkar.
  16. A / B karışımına C çözeltisi 6 damla ekleyin. Sonra bir Pasteur pipeti ile birinci tekrar karıştırın ve sonra vorteks tarafından, kabarcıkları yapmamak.
  17. Parafilm (~ 20 ul / damla) damla koyarak hemen nihai karışımı kullanın.
  18. Temiz, anti-manyetik cımbız ile, elde edilecek olan arzu donanıma (altın parçacıkları, yani. Boyutu) bağlı olarak 6 to15 dakika için karışımın (örneğin,., Gümüş artırılması reaksiyonu) ile ilgili en ızgaraları yerleştirin.
  19. Karışımdan ızgaraları çıkarın ve yıkama için 24 ° C 'de damla iki kez damıtılmış suyun üstüne onları geçmektedir. Birincisi, hızla arkaya 6 damla kullanmak ve daha sonra damla başına 7 dakikalık inkübasyon süresi ile 3 damla, Işıkları açmadan önce.
  20. Bir sonraki adım, bir EM soruşturma sonucu görselleştirmek için bağışıklık altın etiketleme veya zar boyama 27 ya geçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunulan protokole göre, maya endozom sisteminin morfolojisi iletim EM erişim olabilir. Şekil 1 ulaştı ve bu nedenle nanogold ile etiketlenmiş endozomal bölmelere farklı gösterir. Gümüş geliştirilmiş nanogold net elektron yoğun parçacıklar olarak görülebilir. Gümüş geliştirme reaksiyonu için kurulmuş uygun ayarlar maya hücresinin ultrastrüktürdeki müdahale etmez 5 ve 15 nm arasında, homojen bir boyut aralığı içinde parçacıklara sahip olan altın sağlar. Plazma membranı hem de LE, sunulan durumda multiveziküler organları, alımının en az 30 dakika (Şekil sonra bu parçacıklar tarafından ulaşılabilir ise erken endozomal bölmeler 24 ° C 'de, 5 dakika inkübasyondan (Şekil 1A) sonra nanogold erişilebilir 1 B). Nanogold / gümüş geliştirme protokolü ile IEM prosedürü 8 birleştirerek çözünürlüğü gücü un burada anlatılanmultiveziküler organları (Şekil 1 B) iç veziküller özellikle de gösterilen organellerin morfolojisi korunması ve kalitesi ile derlined.

Şekil 1
Nanogold etiketli maya olarak endozomal bölmelere Şekil 1.. Ultrastrüktürel analizi. Sunulan protokol açıklandığı gibi spheroplastlar yabani tip SEY6210 suşu (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 SUC2-GAL Δ9 mel) 'dan elde edilmiştir. Spheroplastlar, daha sonra 10 (panel A) veya 30 dakika (panel B), oda sıcaklığında transfer edilmeden önce, 15 dakika boyunca 4 ° C 'de pozitif yüklü nanogold 4 nmol ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra, sabit tarif edildiği gibi hazırlanması gümüş güçlendirme reaksiyonunun gerçekleştirilmesinden önce 8 cryosectioning için işlenmiştirSunulan protokol. Maya endozomal sisteminin A. Erken bölmeleri. Plazma zarına ek olarak, nanogold (5 dakika), kısa bir alım tek vesiküller (ok uçları) ve muhtemelen endositik kesecikler ve boru şeklindeki yapılar (ok) arasında çok büyük olasılıkla erken endozomların etiketleme sağlar. B. Maya multiveziküler vücut ultrastrüktür. Bir 30 dakika inkübasyon LE / multiveziküler organları (yıldız) etiketlenmesi değil, aynı zamanda, erken endozomlar yol açar ve bölüm vaküol (gösterilmemiştir). M, mitokondri; N, çekirdeği; PM, plazma zarı; V, vakuol. Bar = 200 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immuno-elektron-mikroskopisi, bu proteinlerin bulunan taşıyıcıları ve organellerin ultrastrüktürel çözünürlüğe sahip proteinlerin birleştirilmesi lokalizasyonu sağlayan bir tekniktir. Onun bölmeleri floresan mikroskobu olarak noktasal yapıları görünür, çünkü maya endozomal sistemini inceleyerek bu özellikle önemlidir. Bu, onları ayırmak için zordur. Bu nedenle EM tarafından algılanabilir ve bir zaman bağlı bir şekilde endositik yol giren için çok önemlidir bir probun kullanılması, özellikle farklı endozomları işaretleyin. Bu tür bir sonda endositoz 6 işlevselliğini değerlendirmek değerlidir ve antisera tespit protein markerlerinin eksikliği için bir alternatiftir.

Burada tarif edilen prosedür olumlu olarak endozomal bölmelere etiketlemek için bir prob olarak nanogold yüklü yararlanma. Cryosectioning özel ekipman ve beceri gerektirir iken, sunulan protokol teknik kolaydır ve tekrar etmezözel makineler quire. Bu nedenle araştırma için kullanmak istiyorum herhangi bir laboratuvara erişilebilir. Ancak, bazı önlemler gümüş geliştirme reaksiyonu, yani bu işlemin önemli bir adım sırasında alınması gerekir. Bu reaksiyon ışığa son derece duyarlıdır ve bu nedenle odasında (kırmızı biri dışında) tüm ışıklar kapalı ve / veya kapalı olması gerekir. Tüm kimyasal reaksiyonlar gibi, gümüş geliştirme reaksiyonunun hızı sıcaklığı etkilenir. Aynı parametreleri kullanarak, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, tüm çözümleri ve araçları özenle 24 ° C'de önceden kuluçkaya gerekir Bu doğru, bu reaksiyon rutin yapılacak odasında gümüş geliştirme için inkübasyon süresi kurmak için çok önemlidir. Nanogold genişleme görsel EM tarafından altın parçacığı tespit edebilmek için yeterince uzun olması ve morfolojik ayrıntıları kapak olabilir boyutlu parçacıkların nesil önlemek için yeterince kısa olmalıdır. Bu nedenle, sıcak laboratuvarda bu tekniği ayarlarken bir pilot deneyi gerçekleştirmek için önerilmektedir. Bu test sırasında nanogold partiküller reaksiyon için uygun zamanı belirlemek üzere, farklı zamanlarda için gelişmiş gümüş olması gerekir. Not olarak, elde edilen parçacıkların boyutları homojen boyutta olamaz; her zaman bir heterojen olabilir ama bu 5 arasında bir aralıkta, mümkün olduğu kadar az tutulması gereken doyurmaya - 15 nm. Nanogold alım prosedürü immün-altın labelings ile birlikte olacak, bu özellikle önemlidir. Sonuçları yorumlama göz önünde tutulması gereken başka bir yönü, darbe kovalayıcı etiketleme deneyleri, bu yöntemle mümkün olmamasıdır. Sonuç olarak PM ve EE de LE görselleştirmek için amaçlayan bir nanogold alımında etiketli olacaktır.

Burada sunulan protokolün ek uygulamaları de görmek mümkündür. Bir seçenek floresan miroskop ile nanogold alımı EM veri ilişkilendirmek için olabiliry. FM4-64 PM ve vakuol yolunda ortakları için, zamana bağlı bir şekilde endozomal bölmelere geçen bir lipofilik fluoresan işaretleyici boyadır. FM4-64 ve nanogold lipit ile birlikte hücreye girerek muhtemelen çok benzer içselleştirilmesi kinetik 28,29 var. Sonuç olarak her iki karşılıklı boyalar ışık EM aynı zamanda kullanılabilecek eş zamanlı olarak dinamik keşfetmek için yaklaşımlar ve endositik compartments.The ince yapısı yöntemi de endositik sistem 30 boyunca reseptör aracılı ticareti için kullanılabilir sundu. Nanogold of Monomaleido ve mono-sülfo-N-hidroksi-süksinimido türevleri kovalent protein 6'ya bu parçacıkların bağlamak için kullanılabilir. Örneğin, a-ya da α-faktörü ile bir çapraz bağlama bunların özel reseptörlerinin bu iki feromon endositoz aşağıdaki izin verebilir.

Hep birlikte, açıklanan protokol spec sağlarifically EM ile tespit yapılabilir bir endocytosed prob kullanılarak maya endozomal sisteminin organelleri etiket. Bu deneysel araç, ultra-yapı seviyesinde maya endozomal bölmelerin biyogenezi ve organizasyon incelemek için değerli bir yaklaşımdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Yazarlar, Şekil hazırlanması ile yardım için Rene Scriwanek ederiz. FR ALW Açık Programı (821.02.017 ve 822.02.014), DFG-NWO işbirliği (DN82-303) ve ZonMW VICI (016.130.606) hibeler, ECHO (700.59.003) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) Merck, Darmstadt, Germany 1,102,200,250
HEPES Merck, Darmstadt, Germany 391,340
EGTA Sigma, St louis, MO E4378
MgCl2·6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
DL-Dithiothreitol Sigma, St louis, MO D0632
Sorbitol Sigma, St louis, MO S1876
Positively charged Nanogold Nanoprobes, Yaphank, NY 2022 store at -20 °C
HQ-silver™ enhancement kit Nanoprobes, Yaphank, NY 2012 store at -20 °C
Paraformaldehyde (PFA) Sigma, St louis, MO 441244
Glutaraldehyde 8% EM grade Polyscience, Inc., Warrington, PA 216 store at -20 °C
Lytic enzyme MP Biomedicals, Santa Ana, CA 153526 store at -20 °C
Parafilm M Sigma, St louis, MO P7793
50 meshes nickel grids  Agar Scientific, Stansted, United Kingdom G209N
Cryo-immuno diamond knife 35° Diatome AG, Biel, Switzerland N.A.
UCT ultramicrotome  Leica, Solms, Germany N.A.
Formvar 15/95 resine Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15800
50 meshes nickel grids  Agar Scientific, Stansted, United Kingdom AGG2050N
Parafilm Sigma, St louis, MO P7793
Grids storage box Leica, Solms, Germany 162-50
Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish Corning, Corning, NY 351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands 10216234
1.5 ml microcentrifuge  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72690001
50 ml tube Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands 210296
Benchkote surface protector Whatman, Maidstone, United Kingdom  1159201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
  2. Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
  3. Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
  4. Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
  5. Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
  6. Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
  7. Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
  8. Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
  9. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
  10. Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
  11. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95, (3), 847-858 (1998).
  12. Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
  13. Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
  14. Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
  15. Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
  16. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
  17. Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
  18. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
  19. Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
  20. Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
  21. Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
  22. Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
  23. Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
  24. Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
  25. Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
  26. Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
  27. Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
  28. Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
  29. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
  30. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics