लेजर कैद Microdissection के साथ नाक बायोप्सी संयुक्त माध्यम से प्राप्त की घ्राण न्यूरॉन्स: मानसिक विकार में उपचार प्रतिक्रिया का अध्ययन के लिए एक संभावित दृष्टिकोण

Neuroscience

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Summary

इस अध्ययन में, एक उपन्यास प्लेटफार्म विकसित और मान्य किया गया था द्विध्रुवी विकार (बी) में इलाज प्रतिक्रिया की intraneuronal आणविक हस्ताक्षरों की जांच करने के लिए। बी.डी. रोगियों से घ्राण उपकला नाक बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त हुई थी। तो लेजर कब्जा microdissection के बी.डी. में लिथियम प्रतिक्रिया की आणविक हस्ताक्षर की जांच के लिए रियल टाइम आरटी पीसीआर के साथ जोड़ दिया गया था।

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Narayan, S., McLean, C., Sawa, A., Lin, S. Y., Rai, N., Hipolito, M. S., Cascella, N., Nurnberger, Jr., J. J., Ishizuka, K., Nwulia, E. A. Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders. J. Vis. Exp. (94), e51853, doi:10.3791/51853 (2014).

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Abstract

द्विध्रुवी विकार (बी) खराब समझ pathophysiology के साथ एक गंभीर neuropsychiatric विकार है और आम तौर पर मूड स्टेबलाइजर, लिथियम कार्बोनेट के साथ इलाज किया। जानवरों के अध्ययन के साथ-साथ मानव आनुवंशिक अध्ययन लिथियम न्यूरोनल विकास, अस्तित्व और परिपक्वता, और Wnt संकेतन में शामिल विशेष रूप से अणुओं में शामिल कर रहे हैं कि आणविक लक्ष्य को प्रभावित करता है कि संकेत मिलता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में लिथियम-प्रतिक्रिया के साथ जुड़े गतिशील आणविक परिवर्तन की जांच के लिए मस्तिष्क की बायोप्सी प्राप्त करने के लिए नैतिक चुनौती को देखते हुए, एक इस goal.The घ्राण उपकला घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स होते प्राप्त करने के लिए घ्राण ऊतकों से प्राप्त न्यूरॉन्स के उपयोग पर विचार कर सकते विकास और glial कोशिकाओं की तरह का समर्थन करने में विभिन्न चरणों में। यह सुरक्षित रूप से नाक बायोप्सी से प्राप्त घ्राण ऊतक का उपयोग कर, neuropsychiatric रोगों के साथ रोगियों के सीएनएस में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। Subst से उत्पन्न दोष को दूर करने केगैर neuronal कोशिकाओं के साथ biopsied घ्राण ऊतक के antial संदूषण, समृद्ध neuronal सेल आबादी प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण लेजर कब्जा microdissection के साथ नाक बायोप्सी के संयोजन के द्वारा विकसित किया गया था। इस अध्ययन में, न्यूरोनल ऊतक में उपचार जुड़े गतिशील आणविक परिवर्तन की जांच के लिए एक प्रणाली लिथियम उपचार प्रतिक्रिया के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए भर्ती बी.डी. रोगियों के एक छोटे से पायलट नमूना का उपयोग करते हुए, विकसित और मान्य किया गया था।

Introduction

द्विध्रुवी विकार (बी) के मूड में रोग परिवर्तन की विशेषता गंभीर neuropsychiatric विकार है, ड्राइव और अनुभूति 1। बी.डी. के इलाज के लिए इस्तेमाल किया लिथियम जानवरों के अध्ययन में 2 जीन की एक बड़ी संख्या के स्थिर राज्य mRNA के स्तर को बदलने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इन अणुओं के किसी भी मनुष्य 2 में नैदानिक ​​प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है अगर यह अनजान बनी हुई है। लिथियम प्रतिक्रिया के तंत्र को समझना न्यूरोनल ऊतकों में लिथियम प्रेरित आणविक परिवर्तन की जांच की आवश्यकता होगी। दुर्भाग्य से, यह बी.डी. रोगियों के मस्तिष्क बायोप्सी पूर्व और बाद लिथियम चिकित्सा लिथियम प्रतिक्रिया की आणविक हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए प्राप्त करने के लिए व्यावहारिक नहीं है। पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों बी.डी. में बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हालांकि, वे भावनाओं, अनुभूति और ड्राइव में गतिशील परिवर्तन के साथ जुड़े आणविक मार्कर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है; और पूर्वव्यापी निधारित लिथियम उपचार प्रतिक्रिया की वैधता समस्याग्रस्त किया जा सकता है 4। लिम्फोसाइटों और अन्य रक्त कोशिकाओं के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन रक्त कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन न्यूरोनल परिवर्तन 3-5 प्रतिबिंबित नहीं कर सकते। मस्तिष्कमेरु द्रव रोग से जुड़े और दवा-प्रतिवर्ती आंतरिक बदलाव को प्रतिबिंबित हो सकता है कि इंट्रासेल्युलर अणुओं के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त हो सकती है।

घ्राण उपकला (ँ) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक अनूठा हिस्सा है, लिम्बिक संरचनाओं से 6 embryologically से संबंधित; और यह नाक बायोप्सी के माध्यम से आसानी से पहुँचा जा सकता है। यह होते हैं glial-जैसे विकास 7-9 के विभिन्न चरणों में (यानी, sustentacular) कोशिकाओं, बेसल proliferating कोशिकाओं, और घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स का समर्थन। इसलिए, ँ accessibly neuropsychiatric रोगों 7 के साथ रोगियों के सीएनएस में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। अध्ययन उन ओसीसी को प्रतिबिंबित कि रोग जुड़ी घटनाओं की जांच के लिए एक किराए के ऊतकों के रूप में ँ की उपयोगिता का प्रदर्शन कर रहे हैंमस्तिष्क के न्यूरॉन्स 8,9 में urring। उदाहरण के लिए, पढ़ाई मनोरोग शर्तों 10-14 के साथ जुड़े आणविक प्रोफाइल को जांच करने के लिए ँ उपयोग किया है। घ्राण प्रणाली को भी इस तरह के एक प्रकार का पागलपन 15 के नकारात्मक लक्षण के साथ जुड़े रहे हैं कि गंध घाटे के रूप में नैदानिक ​​endophenoytpes की पहचान करने के लिए कार्य करता है। इसके अतिरिक्त, neurodevelopmental प्रक्रियाओं मनोरोग शर्तों 8,9 की अंतर्निहित pathophysiology मॉडल करने के लिए एक उपयोगी एवेन्यू प्रदान करने, जीवन भर ँ में जारी है।

हालांकि, इस ऊतक के उपयोग के लिए एक दोष यह है कि गैर neuronal कोशिकाओं 16 के साथ घ्राण बायोप्सी की पर्याप्त संदूषण है। उदाहरण के लिए, पिछले ँ अध्ययन में जीन की अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता कुल शाही सेना गैर neuronal कोशिकाओं 17 से शाही सेना सहित पूरे नाक biopsied ऊतकों से निकाली गई शाही सेना निहित। इसलिए, पिछले दृष्टिकोण कोशिकाओं की गुणवत्ता द्वारा सीमित किया गया है। इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, एक उपन्यास दृष्टिकोण प्राप्त करने के लिए लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम) के साथ नाक बायोप्सी के संयोजन से समृद्ध neuronal सेल आबादी 18 विकसित किया गया है।

एलसीएम बुनियादी लाल लेजर 19-21 के साथ संयुक्त यूवी लेजर काटने का उपयोग कोशिकाओं की चयनात्मक अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक तकनीक है। ँ दृष्टिकोण के साथ संयोजन एलसीएम जिससे neuronal कोशिकाओं 18 के संवर्धन बढ़ाने, गैर neuronal कोशिकाओं द्वारा ँ की पर्याप्त संदूषण को कम करता है। इसके अलावा, neuronal परत जिससे धुंधला के लिए दूर करने की जरूरत है, एक खुर्दबीन के नीचे submucosa परत से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। Neuronal सेल प्रकार आगे ब्याज 7 की सेल प्रकार से व्यक्त कर रहे हैं, जो प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग अन्य सेल आबादी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसलिए, इस प्रक्रिया जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन, immunohistochemistry और अन्य शब्द के भागों जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लगभग पूरी तरह neuronal सेल आबादी के संवर्धन के लिए एक आसान विधि स्थापित करता है।

ve_content "> इस अध्ययन रोग राज्यों और उपचार की प्रतिक्रिया से जुड़े घ्राण न्यूरॉन्स में आणविक परिवर्तन की जांच के लिए एक प्रयोगात्मक मंच स्थापित करना है। यह पता करने के लिए, बी.डी. के लिए डीएसएम-चार नैदानिक ​​मानदंडों से मुलाकात की, जो गैर धूम्रपान रोगियों के एक छोटे से सेट पर आधारित आनुवंशिक अध्ययन के लिए नैदानिक ​​साक्षात्कार (डीआईजी) 22 दो नाक बायोप्सी से गुजरना करने के लिए भर्ती किया गया था: लिथियम और दूसरे बायोप्सी के साथ एक बायोप्सी पूर्व उपचार, दैनिक मौखिक लिथियम चिकित्सा के छह सप्ताह के बाद इसके अलावा, पात्र बी.डी. रोगियों होना चाहिए:। अवसाद के लिए प्रतीक मोंटगोमरी-Asberg रेटिंग स्केल (MADRS) 23 प्रशासित चिकित्सक में 60 से बाहर ≥10 स्कोरिंग के आधार पर, (YMRS) hypomania या उन्माद के लिए प्रतीक, युवा उन्माद रेटिंग स्केल प्रशासित चिकित्सक पर 56 से बाहर एक स्कोर ≥10 पर आधारित । 24;। MADRS और दोनों तराजू के लिए चिकित्सकों के बीच समझौते की YMRS रेटर-इंटर रेटर गुणांक दोनों पर या ≥10 बायोप्सी के बाद, न्यूरॉन्स enri 0.96 थे> हैएलसीएम द्वारा ँ से CHEd। ऊतक और neuronal संवर्धन से उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना की निकासी सुनिश्चित करने के लिए, अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के बाद, रीयल टाइम आरटी पीसीआर ब्याज की जीन के पूर्व और बाद के उपचार अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए आयोजित किया गया था। आगामी वर्गों एक इस दृष्टिकोण के सत्यापन का विवरण, प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर प्रकाश डाला और परेशानी की शूटिंग के प्रोटोकॉल के लिए लागू किया गया है कि रणनीतियों होते हैं।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में सभी शोध स्वयंसेवकों हावर्ड विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित सूचित सहमति दस्तावेजों दिलाई गई। सूचित सहमति दस्तावेजों पर हस्ताक्षर करने से सहमति दे दी है जो केवल प्रतिभागियों को अध्ययन में दाखिला लिया गया। इस विश्लेषण के लिए अध्ययन के आधार के शामिल: 20 विषयों (12 बी और 10 नियंत्रण; 30% पुरुषों) और 38.2 (14.1) वर्ष की उम्र (एसडी) मतलब है।
नोट: कांच और प्लास्टिक की सतहों से RNase संदूषण को दूर करने के RNase जैप के साथ सभी सतहों स्प्रे।

1. बायोप्सी प्रक्रिया

  1. अध्ययन भागीदार की नाक गुहा में सामयिक lidocaine (xylocaine) तरल 4% और oxymetazoline एचसीएल 0.05% स्प्रे और समय स्तब्ध के 15 मिनट के लिए अनुमति देते हैं।
  2. Lidocaine और oxymetazoline का एक मिश्रण में साढ़े एक्स 3 इंच शल्य cottonoids भिगोएँ और नाक पट के बेहतर भाग के साथ नाक गुहा में डालने और 15 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. एक 30 डिग्री कठोर का प्रयोगनाक एंडोस्कोप, नाक गुहा के ऊपरी खंड का पता लगाने के लिए कई छोटे नमूनों ले रही है, नाक पट के बेहतर भाग से ऊपर से काट नाक संदंश का उपयोग नाक mucosa दूर करने के लिए।

ऊतक ब्लॉक की 2. तैयारी

  1. तुरंत पहले बायोप्सी करने के लिए, ऊतक मध्यम ठंड के साथ मानक आकार cryomolds भरें।
  2. Autoclaved चिमटी का प्रयोग, ठंड मध्यम में ताजा ऊतक माउंट और सूखी बर्फ पर फ्रीज। ठंड माध्यम के साथ cryoblock के शेष भरें सूखी बर्फ पर cryoblock फ्रीज, और -80ºC पर दुकान ब्लॉकों।

3. Cryosectioning

  1. Cryosectioning करने के तुरंत पहले पॉलीथीन naphthalate (पेन) झिल्ली गिलास स्लाइड तैयार करें। 5 मिनट के लिए RNase जैप समाधान के साथ स्लाइड्स स्प्रे। तब diethylpyrocarbonate (DEPC) पानी में स्लाइड्स कुल्ला और 30 मिनट के लिए शुष्क हवा हैं। 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत सूखे स्लाइड्स को सक्रिय करें।
  2. Cryosection प्रत्येक 30 माइक्रोन पर पूरी तरह से ब्लॉक। शुष्क मैं पर स्लाइड रखेंसीई और वर्गों जितना संभव हो उतना जमे हुए। पूरा होने पर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्लाइड।

4. लेजर कैद Microdissection

  1. तुरंत पहले microdissection के लिए स्लाइड dehydrating द्वारा शुरू करो। 60% (2 मिलीलीटर, 15 सेकंड), 80% (2 मिलीलीटर, 15 सेकंड), 95% (3 मिलीग्राम, 25 सेकंड), 100: प्रत्येक स्लाइड के लिए निम्न इथेनॉल श्रृंखला लागू तो जमे हुए स्लाइड चलो 10 सेकंड के लिए पिघलना, और % (7 मिलीलीटर, 60 सेकंड)।
  2. पर photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) माइक्रोस्कोप मुड़ें और सेट निम्न स्थितियों के लिए: 82 के लिए ऊर्जा सेट 10x बढ़ाई के लिए, 74 के लिए ध्यान केंद्रित है, और गति से 25 - 30 20X बढ़ाई के लिए, 63 को ऊर्जा सेट, 67 के लिए ध्यान केंद्रित, और गति के लिए 5 - 6. इष्टतम काटने परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करें।
  3. नेत्रहीन 20X या 10x बढ़ाई का उपयोग कर न्यूरॉन्स की पहचान। धुंधला प्रक्रिया के उपयोग के बिना एक खुर्दबीन के नीचे अंतर्निहित उप म्यूकोसा से पतली सतह घ्राण न्यूरॉन परत भेद। एक घने स्तंभ उपस्थिति के रूप में 18 न्यूरॉन्स का निरीक्षण करें।
  4. 4.2 कदम में आगे उल्लेख माइक्रोस्कोप में पेंसिल समारोह का उपयोग करना, neuronal परत के आसपास का पता लगा। लेजर से न्यूरॉन्स के जल को रोकने के लिए थोड़ा दूर न्यूरॉन्स से ट्रेस। यह उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। फिर लेजर गाइडेड काटने आरंभ करें।
  5. ठीक टिप microdissection के संदंश का उपयोग विच्छेदित वर्गों उठाओ और बर्फ पर 100 μl lysis बफर युक्त microtube में ऊतक डाल दिया। एक भी नमूना से प्राप्त सभी न्यूरोनल वर्गों के लिए दोहराएँ। 50 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए नमूना प्रति कुल विच्छेदन का समय है।
  6. विच्छेदन पूरा तुरंत भंवर नमूना lysates है और सूखी बर्फ पर रख एक बार। कुल शाही सेना अलगाव के लिए -80ºC पर स्टोर नमूने हैं।

कुल शाही सेना और गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण 5. अलगाव

  1. बर्फ पर पिघलना नमूना lysates। देखना (कोई संशोधनों के साथ निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करके DNase-मैं निष्क्रियता के साथ RNAqueous माइक्रो किट के साथ कुल शाही सेना अलगाव से बाहर ले जाने <मजबूत> चित्रा 1)। कुल क्षालन मात्रा लगभग 20 μl है।
  2. शाही सेना एकाग्रता उपाय और Bioanalyzer का उपयोग करते हुए शाही सेना वफ़ादारी संख्या (Rin) के साथ शाही सेना की गुणवत्ता का मूल्यांकन। चित्रा 2 में गुणवत्ता नियंत्रण मानदंडों को पूरा नमूने है कि सीडीएनए संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

6. सीडीएनए संश्लेषण

  1. एक मान्य वाणिज्यिक किट का उपयोग सीडीएनए synthesize (अभिकर्मकों की तालिका देखें)। ट्यूब प्रति 8 μl की कुल मात्रा को शाही सेना (उपलब्धता पर निर्भर करता है) और RNase मुक्त पानी की 1.0 एनजी - 0.1 संयोजन से annealing के कदम प्रदर्शन करते हैं। फिर 10 μl की कुल मात्रा के लिए, ट्यूब प्रति मिश्रण oligo डी (टी) 20 प्राइमर की एक μl और 10 मिमी dNTP की एक μl जोड़ें।
  2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर धीरे भंवर और अपकेंद्रित्र के नमूने और पानी रखना नमूने हैं। बर्फ पर प्रतिक्रिया पूरा हो गया है, के बाद तुरंत शांत नमूने हैं।
  3. तालिका 1 में विनिर्देशों के अनुसार मास्टर मिश्रण समाधान तैयार है। तो फिर 9.5 μ जोड़नेप्रत्येक ट्यूब एल मास्टर मिश्रण और व्यावसायिक तौर पर तैयार रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) के 0.5 μl। बजाय आरटी की ट्यूब को नियंत्रित करने के लिए 0.5 μl RNase मुक्त पानी जोड़ें।
  4. कोई साइकिल चालन के साथ, 50 मिनट, 5 मिनट और एक अंतिम चार डिग्री सेल्सियस पकड़ के लिए फिर 85 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर पहले ऊष्मायन के साथ एक आर टी प्रतिक्रिया चलाएँ।
  5. पानी और विभाज्य साथ 5x द्वारा सभी नमूनों पतला। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने हैं।

7. रीयल टाइम पीसीआर - Neuronal संवर्धन की पुष्टि करें

  1. तालिका 2 में विनिर्देशों के अनुसार मास्टर मिश्रण समाधान तैयार ऐसे GAPDH के रूप में एक आंतरिक नियंत्रण का प्रयोग करें। न्यूरोनल संवर्धन निर्धारित करने के लिए undissected ऊतक में OMP अभिव्यक्ति के साथ microdissected ऊतक में घ्राण मार्कर प्रोटीन (OMP) अभिव्यक्ति की तुलना करें।
    नोट: OMP घ्राण न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर है।
    OMP अनुक्रम: आगे, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
    रिवर्स 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
    GAPDH अनुक्रम: आगे, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
    रिवर्स, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '।
  2. सीडीएनए के प्रत्येक अच्छी तरह से और 3 μl में मास्टर मिश्रण के 7 μl जोड़कर पीसीआर थाली सेट करें।
  3. 300 XG (1300 आरपीएम) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र थाली। ऐसे SYBR हरियाली qPCR के रूप में वाणिज्यिक Supermix के लिए निर्दिष्ट डिफ़ॉल्ट थर्मल साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग कर चला रीयल टाइम पीसीआर प्रतिक्रिया।
  4. डेटा (विनिर्देशों के लिए चित्र 2 देखें) का विश्लेषण।

8. रीयल टाइम पीसीआर - ब्याज के जीनों की अभिव्यक्ति

  1. दो गुना या अधिक की न्यूरोनल संवर्धन बताते हैं कि नमूनों पर प्रदर्शन करते हैं।
  2. हर जांच तालिका 3 में विनिर्देशों के अनुसार अलग ट्यूबों में (ब्याज और विक लेबल GAPDH के परिवार लेबल जांच) के लिए बर्फ पर मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  3. सीडीएनए के प्रत्येक अच्छी तरह से और 2 μl में 8 μl मास्टर मिश्रण के साथ एक पीसीआर थाली सेट करें।
  4. 300 XG (1300 आरपीएम) पर 5 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र। डीईएफ़ का उपयोग कर रीयल टाइम पीसीआर प्रतिक्रिया भागोनिर्माता द्वारा प्रदान की जीन अभिव्यक्ति मास्टर मिश्रण प्रोटोकॉल के अनुसार Ault थर्मल साइकिल चालन की स्थिति। अभिव्यक्ति परिणाम (विनिर्देशों के लिए चित्र 2 देखें) का विश्लेषण।

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Representative Results

आणविक हस्ताक्षरों के अध्ययन में प्रोटोकॉल और समस्या निवारण रणनीति को सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया। नमूने के लिए शाही सेना गुणवत्ता और neuronal संवर्धन मापदंड आगे बहाव के रीयल टाइम पीसीआर विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा के लिए मानकीकृत किया गया। RIN और आरएनए एकाग्रता का पता चला अभिव्यक्ति के स्तर को कारकों के रूप में जांच की गई। 1 से लेकर RINs के साथ कई नमूनों के विश्लेषण के आधार पर - 10, यह ऊपर ~ 3.0 और की एक न्यूनतम RIN के इस अध्ययन में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए पर्याप्त है कि निर्धारित किया गया था। नतीजतन, सीडीएनए संश्लेषण के लिए आरएनए मात्रा 1.0 एनजी के लिए मानकीकृत किया गया था। इस प्रकार, ऊपर एक Rin के साथ उच्च गुणवत्ता के नमूने ~ 1.0 एनजी के 3.0 और आरएनए राशि सीडीएनए में परिवर्तित किया गया। 0.1 के साथ नमूने - एक पर्याप्त नमूना आकार को प्राप्त करना कठिन है कि अगर शाही सेना के 1.0 एनजी इस्तेमाल किया जा सकता है।

Neuronal संवर्धन रीयल टाइम पीसीआर विश्लेषण का उपयोग करने की पुष्टि की थी। Microdissected नमूनों में OMP जीन अभिव्यक्ति के स्तर undissected नमूने में उन लोगों के साथ तुलना की गईneuronal परत समृद्ध था अगर एस निर्धारित करने के लिए। गैर-विच्छेदित ऊतक की तुलना में दो गुना या अधिक से अधिक OMP अभिव्यक्ति के साथ microdissected नमूनों का इस्तेमाल कर रहे हैं।

इसलिए, इन मानदंडों को लागू करने से, मान्य किया गया था ँ न्यूरॉन्स में आणविक परिवर्तन के अध्ययन के लिए इस प्रस्तावित दृष्टिकोण की व्यवहार्यता। 3 इस पद्धति का संकेत है कि जीएसके-3β की अभिव्यक्ति के स्तर लिथियम द्वारा बजाय गैर विशिष्ट बहिर्जात कारकों से प्रभावित होते हैं दिखाता है कि चित्रा पहले और लिथियम उपचार के बाद विशिष्ट आणविक परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। अधिक विशेष रूप से, बी.डी. में लिथियम उपचार की प्रतिक्रिया से जुड़े आणविक हस्ताक्षरों में से परिवर्तन क्लीनिकल डाटा के साथ इस आणविक डेटा के संयोजन से संबोधित किया जा सकता है।

चित्रा 1
चित्रा 1. शाही सेना निष्कर्षण और DNase निष्क्रियता प्रोटोकॉल। Flowcharटी एलसीएम के बाद नमूनों से शाही सेना को निकालने के लिए प्रक्रिया को दिखाता है। कुल शाही सेना के लगभग 20 μl की एक अधिकतम आरएनए मात्रा उपज के लिए दो बार eluted है। Eluted नमूने तो DNase निष्क्रियता के लिए DNase मैं इलाज से गुजरना। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रोटोकॉल सारांश। यह आंकड़ा अध्ययन प्रयोगों के लिए पूरे प्रोटोकॉल का सार। नाक ऊतक पहले biopsied और cryoblocks के रूप में जमे हुए है। ऊतक के सेक्शनिंग के बाद, न्यूरोनल परतों एलसीएम का उपयोग कर विच्छेदित कर रहे हैं। शाही सेना निकासी और DNase निष्क्रियता निर्माता के दिशा निर्देशों (चित्रा 1 देखें) का उपयोग किया जाता है। गुणवत्ता नियंत्रण के मानदंडों को पूरा नमूने है कि (Rin और आरएनए मात्रा) सीडीएनए और हमें synthesize करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंन्यूरोनल संवर्धन के विश्लेषण के लिए एड। समृद्ध नमूने वांछित लक्ष्य के साथ रीयल टाइम पीसीआर विश्लेषण में उपयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
बी.डी. और नियंत्रण के नमूने में चित्रा 3. जीएसके-3β अभिव्यक्ति। यह आंकड़ा पहले और दूसरे बायोप्सी के बीच नियंत्रण नमूनों में जीएसके-3β अभिव्यक्ति के स्तर में बी.डी. नमूनों में जीएसके-3β अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन के पहले और बाद में लिथियम उपचार और स्थिरता को दिखाता है। साथ में ले ली, इन आंकड़ों जीएसके-3β अभिव्यक्ति लिथियम के बजाय गैर विशिष्ट बहिर्जात कारकों से प्रभावित होता है कि प्रदर्शित करता है।

अभिकर्मकों आयतन
10 एक्स आर टी बफर 2 μl
25 मिमी MgCl 4 μl
0.1 एम डीडीटी 2 μl
RNase आउट 0.5 μl
सुपरस्क्रिप्ट III 0.5 μl
RNase मुक्त पानी 1 μl

तालिका 1. सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिक्स समाधान।

अभिकर्मकों X1 एक्स (नमूनों की #)
टेम्पलेट डीएनए 3 μl -
SYBR ग्रीन 5 μl
प्राइमर मिक्स 0.8 μl
वाटर 1.2 μl
टोटल 10 μl -

तालिका 2. Neuronal संवर्धन पीसीआर मास्टर मिक्स समाधान।

अभिकर्मकों X1 एक्स (नमूने / प्राइमर का #)
dWater 2 μl
मास्टर मिक्स 5 μl
परिवार लेबल जांच 0.1 μl
विक लेबल जांच 0.5 μl
सीडीएनए 2 μl -

तालिका 3. लक्ष्य पीसीआर मास्टर मिक्स।

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Discussion

नाक बायोप्सी और एलसीएम के संयोजन से समृद्ध घ्राण न्यूरोनल परतों प्राप्त करने के लिए एक नया मंच प्रस्तुत किया है और इस अध्ययन में मान्य किया गया है। इस तकनीक को बड़े पैमाने पर प्रभाव पड़ सकता है। यह क्षेत्र में एक व्यापक प्रभाव है, जिससे उपचार प्रतिक्रिया के लिए उन सहित biomarker के अध्ययन, और अन्य neuropsychiatric स्थितियों के लिए दवाओं की खोज के प्रयासों की दिशा में लागू किया जा सकता है।

बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी उच्च गुणवत्ता न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण और समस्या निवारण चरणों ध्यान दिया जाना चाहिए। एक पर्याप्त नमूना आकार के लिए रोगी के प्रति घ्राण ऊतक के 6 टुकड़े - सबसे पहले, 4 प्राप्त करते हैं। नमूने शाही सेना क्षरण करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, क्योंकि दूसरे, उचित तापमान पर ऊतक रखने RNase मुक्त उपकरण और सतहों, उपयोग के दस्ताने के साथ काम करते हैं, और नमूने पर सीधे साँस लेने से बचें। शाही सेना की गुणवत्ता अभी भी कम है, तो 50 मिनट के भीतर microdissection के पूरा करने पर विचार करें और तुरंत विच्छेदन या vort के बाद शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शनपूर्व नमूने तुरंत और -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण तक सूखी बर्फ पर रहते हैं। शाही सेना की उपज बढ़ाने के लिए, एलसीएम दौरान विच्छेदित वर्गों की संख्या में वृद्धि।

Neuropsychiatric विकारों में मस्तिष्क जुड़े आणविक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक चुनौती की वजह से मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए पहुंच की कमी के लिए मौजूद है। वैकल्पिक तरीकों परिधीय रक्त कोशिकाओं, autopsied दिमाग के अध्ययन, और प्रेरित स्टेम (आईपीएस) की कोशिकाओं में शामिल हैं। रक्त कोशिकाओं की बीमारी से जुड़े न्यूरोनल परिवर्तन का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। Autopsied दिमाग रोग प्रगति और दवा की प्रतिक्रिया के साथ जुड़े गतिशील और राज्य में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए संसाधन नहीं किया जा सकता। इस तरह के निशान reprogramming और कोशिकाओं के रखरखाव के दौरान बाहर मिट जाने की संभावना है क्योंकि आईपीएस कोशिकाओं सीधे, राज्य में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। इसलिए, ँ ऊतकों उपयोग कर के लाभ न्यूरोनल संदर्भ में दोनों राज्य और गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने की क्षमता है। विशेष रूप से, आईपीएस न्यूरोनल स्टेम व्युत्पन्नकोशिकाओं को पर्याप्त रूप से संवर्धन और reprogramming के चरणों की वजह से लिथियम उपचार के 6 सप्ताह के प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। इस अखबार में प्रस्तुत कार्यप्रणाली हमें उपचार जुड़े आणविक परिवर्तन का अध्ययन करने और उन्हें चिकित्सीय लक्षण में बदलाव के लिए संबंधित करने के लिए अनुमति देता है। यह कम से कम वर्तमान में, ँ ऊतकों से प्राप्त न्यूरॉन्स की राशि आण्विक स्तर पर अध्ययन के लिए पर्याप्त है, लेकिन immunohistochemistry के अनुप्रयोगों के माध्यम से प्रोटीन के लक्षण वर्णन करने के लिए सीमित नहीं किया जा सकता है, कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस प्रकार, आगे तकनीकी सुधार भी उम्मीद कर रहे हैं।

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Disclosures

लेखकों व्यावसायिक हितों के साथ कोई वित्तीय रिश्तों की रिपोर्ट।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds Sakura Finetek 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D) Carl Zeiss Microscopy 415190-9041-000
Rnase Zap Ambion AM9780
DEPC Treated Water Quality Biological 351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System Carl Zeiss Microscopy Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No. 5 Dumont Microdissction Forceps Roboz RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit Ambion AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit Invitrogen 18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix Invitrogen 11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes Applied Biosystems Various
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016

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References

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