נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

במחקר זה, פלטפורמה חדשנית לחקור חתימות מולקולריות intraneuronal של תגובה לטיפול בהפרעה דו-קוטבית (BD) פותחה ומאומת. אפיתל ריח מחולי BD הושג באמצעות ביופסיות האף. אז microdissection לייזר ללכוד היה בשילוב עם זמן אמת RT PCR לחקור את החתימה המולקולרית של תגובה ליתיום בBD.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Narayan, S., McLean, C., Sawa, A., Lin, S. Y., Rai, N., Hipolito, M. S., Cascella, N., Nurnberger, Jr., J. J., Ishizuka, K., Nwulia, E. A. Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders. J. Vis. Exp. (94), e51853, doi:10.3791/51853 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הפרעה דו-קוטבית (BD) היא הפרעת נוירו-פסיכיאטרית חמורה עם הפתופיזיולוגיה הבינה היטב ובדרך כלל מטופלים עם מייצב מצב הרוח, ליתיום קרבונט. מחקרים בבעלי חיים, כמו גם מחקרים גנטיים מצביעים על כך שאדם ליתיום משפיע מטרות מולקולריות המעורבים בצמיחה עצבית, הישרדות והתבגרות, ובעיקר מולקולות מעורבות באיתות Wnt. בהתחשב באתגר האתי לקבלת ביופסיות מוח לחקר שינויים מולקולריים דינמיים הקשורים ליתיום-תגובה במערכת העצבים המרכזית (CNS), ניתן לשקול את השימוש בתאי עצב המתקבלים מרקמות חוש הריח כדי להשיג אפיתל ריח goal.The זה מכיל תאי עצב קולטני ריח בשלבים שונים של פיתוח ותמיכה בתאים כמו גליה. זה מספק הזדמנות ייחודית ללמוד שינויים דינמיים במערכת העצבים המרכזית של חולים במחלות נוירו-פסיכיאטריות, תוך שימוש ברקמת הרחה ליטול ללא חשש מביופסיות האף. כדי להתגבר על החסרון שמציב substזיהום antial של רקמת הרחה ביופסיה עם תאים לא-עצביים, גישה חדשנית להשגת אוכלוסיות תאים עצביים מועשרות פותחה על ידי שילוב של ביופסיות האף עם microdissection לייזר ללכוד. במחקר זה, מערכת לחקירת שינויים מולקולריים דינמיים הקשורים לטיפול ברקמה עצבית פותחה וקבלה תוקף, באמצעות מדגם טייס קטן של חולי BD גויסו למחקר של המנגנונים המולקולריים של תגובה לטיפול ליתיום.

Introduction

הפרעה דו-קוטבית (BD) היא הפרעת נוירו-פסיכיאטרית חמורה, המתאפיינת בשינויים פתולוגיים במצב רוח, לנהוג וקוגניציה 1. ליתיום משמש לטיפול בBD הוכח לשנות את רמות ה- mRNA המדינה יציבה של מספר רב של גנים במחקרים בבעלי החיים 2, אבל זה עדיין לא ידוע אם כל מולקולות אלה קשורים בתגובה קלינית בבני האדם 2. הבנת המנגנון של תגובת ליתיום תדרוש חוקרת שינויים מולקולריים הנוצר על-ליתיום ברקמות עצביות. למרבה הצער, זה לא מעשי להשיג ביופסיות מוח של חולי BD מראש וטיפול בפוסט ליתיום לזהות חתימות מולקולריות של תגובה ליתיום. רקמות מוח פוסט-מורטם נעשו שימוש כדי ללמוד סמנים ביולוגיים בBD, עם זאת, הם לא יכולים לשמש כדי להעריך סמנים מולקולריים הקשורים לשינויים דינמיים ברגשות, קוגניציה ולנהוג; ואת תוקפו של תגובה לטיפול ליתיום הובררה למפרע יכול להיות בעייתי 4. לימפוציטים ותאי דם אחרים יכולים להיות שימושיים, אבל שינויים מולקולריים בתאי דם עלולים שלא לשקף שינויים עצביים 3-5. נוזל השדרתי עשוי להיות מספיק כדי לקבל מידע על מולקולות תאיות שעשויים לשקף שינויים מהותיים הקשורים למחלות והתרופות-הפיכה.

אפיתל הריח (OE) הוא חלק ייחודי של מערכת העצבים המרכזית (CNS), הקשורות למבני embryologically הלימבית 6; והוא נגיש בקלות באמצעות ביופסיות האף. זה מורכב של גליה-כמו תמיכה בתאי תאים (כלומר, sustentacular), בסיס מתרבים, ותאי עצב קולטני ריח בשלבים שונים של פיתוח 7-9. לכן, OE מספק הזדמנות ייחודית ללמוד accessibly שינויים דינמיים במערכת העצבים המרכזית של חולים במחלות נוירו-פסיכיאטריות 7. מחקרים מדגימים את התועלת של OE כרקמה פונדקאית לחקירת אירועי מחלה קשורה המשקפים OCC אלהurring בתאי עצב במוח 8,9. לדוגמא, מחקרים מנוצלים OE לחקור פרופילים מולקולריים הקשורים במצבים פסיכיאטריים 10-14. מערכת חוש הריח משמשת גם לזיהוי endophenoytpes הקליני כגון גירעונות ריח הקשורים לסימפטומים שליליים של סכיזופרניה 15. בנוסף, תהליכי התפתחות נוירולוגית להמשיך בOE לאורך כל חיים, מתן השדרה שימושית למודל הפתופיזיולוגיה הבסיסית של 8,9 מצבים פסיכיאטריים.

עם זאת, חסרון לשימוש ברקמה זו הוא הזיהום המשמעותי של ביופסיות חוש הריח עם תאים שאינם עצביים 16. לדוגמא, RNA הכולל המשמש למחקרי ביטוי גנים במחקרים קודמים OE הכיל RNA שחולץ מן רקמות האף כל ביופסיה כוללים RNA מהתאים שאינם עצביים 17. לכן, גישות קודמות היו מוגבלות על ידי האיכות של תאים. כדי להתגבר על בעיה זו, גישה חדשנית להשגה אוכלוסיות תאים עצביות מועשרות על ידי שילוב של ביופסיות האף עם microdissection לייזר ללכוד (LCM) פותחו 18.

LCM הוא טכניקה המאפשרת לבידוד סלקטיבי של תאים באמצעות חיתוך לייזר UV בשילוב עם לייזר אינפרא-אדום 19-21. LCM שילוב עם גישת OE ממזער זיהום משמעותי של OE על ידי תאים שאינם עצביים, ובכך משפר את ההעשרה של תאים עצביים 18. יתר על כן, השכבה העצבית ניתן להבחין בין שכבת submucosa תחת מיקרוסקופ, ובכך מבטלת את הצורך בצביעה. עוד ניתן להבחין בין אוכלוסיות תאים אחרות סוגים עצביים תא באמצעות נוגדנים ראשוניים אשר באו לידי ביטוי בסוג התא של עניין 7. לכן, הליך זה קובע שיטה קלה יותר להעשרת אוכלוסיית תאים כמעט אך ורק עצבית שיכול לשמש למחקרי ביטוי גנים, אימונוהיסטוכימיה וחקירות מורפולוגיים אחרות.

ve_content "> מחקר זה נועד להקמת פלטפורמה ניסיונית לחקור שינויים מולקולריים בתאי עצב הרחה הקשורים במצבי מחלה ותגובה לטיפול. כדי לטפל בזה, קבוצה קטנה של חולים ללא עישון שעמדה בקריטריונים לאבחון DSM-IV לBD המבוססת על ראיון האבחון למחקרים גנטיים (DIG) 22 גויס לעבור שתי ביופסיות האף: ביופסיה אחד מראש טיפול בליתיום והביופסיה השנייה, לאחר 6 שבועות של טיפול אוראלי יומי ליתיום יתר על כן, חולי BD זכאים חייבים להיות:. סימפטומטי לדיכאון , המבוסס על ניקוד ≥10 מתוך 60 במטפל מנוהל מונטגומרי-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; סימפטומטי להיפומאניה או מאניה, המבוסס על ציון ≥10 מתוך 56 על המטפל מנוהל יאנג-מאניה Rating Scale (YMRS) 24;. או ≥10 בשני MADRS וYMRS מקדם מדרג-Inter-מדרג של ההסכם בין רופאים לשני הסולמות הוא> 0.96 לאחר ביופסיות, נוירונים היו enri.CHED מOE ידי LCM. בעקבות אמצעי בקרת איכות נוספת, כדי להבטיח מיצוי של RNA באיכות גבוהה מהרקמה וההעשרה עצבית, Real Time PCR RT נערך לחקור רמות של לפני וביטוי שלאחר הטיפול של הגנים של עניין. הסעיפים שלאחר מכן מכילים תיאור של האימות של גישה זו, המדגישה את אופטימיזציה של הפרוטוקול והאסטרטגיות שיושמו לפרוטוקול ירי-צרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל המתנדבים למחקר במחקר זה ניתנו מסמכי הסכמה מדעת שאושרו על ידי מועצת המנהלים המוסדית הסקירה של אוניברסיטת הווארד ואוניברסיטת ג'ונס הופקינס. משתתפים היחידים שהסכימו על ידי חתימה על מסמכי ההסכמה מהדעת נרשמו למחקר. בסיס המחקר לניתוח זה מורכב מ: 20 נבדקים (12 BD ו -10 בקרות; 30 זכרים%) וגיל ממוצע (SD) של 38.2 (14.1) שנים.
הערה: תרסיס כל המשטחים עם RNase זאפ להסיר זיהום RNase ממשטחי זכוכית ופלסטיק.

1. ביופסיה נוהל

  1. תרסיס 0.05% נוזל% ואוקסימטזולין 4 HCl אקטואליים לידוקאין (Xylocaine) בחלל האף של משתתף המחקר ולאפשר 15 דקות של זמן משתק.
  2. משרים cottonoids כירורגית ½ x 3 אינץ 'בתערובת של לידוקאין ואוקסימטזולין ולהכניס בחלל האף לאורך חלק עליון של מחיצת האף ולאפשר לשבת במשך 15 דקות.
  3. באמצעות 30 ° נוקשהאנדוסקופ האף כדי לאתר את חלקו העליון של חלל האף, להסיר רירית האף באמצעות מלקחיים האף למעלה נשיכה מהחלק העליון של מחיצת האף, לוקח כמה דגימות קטנות.

2. הכנת בלוקים רקמות

  1. מייד לפני הביופסיה, למלא cryomolds בגודל סטנדרטי עם רקמת ההקפאה בינונית.
  2. באמצעות פינצטה autoclaved, הר רקמה טרי במדיום ההקפאה ולהקפיא בקרח יבש. מלא שארית cryoblock עם מדיום ההקפאה, להקפיא cryoblock על קרח יבש, וחוסם את החנות ב-80ºC.

3. Cryosectioning

  1. הכן naphthalate פוליאתילן (PEN) שקופיות זכוכית קרום מייד לפני cryosectioning. תרסיס שקופיות עם פתרון RNase זאפ במשך 5 דקות. לאחר מכן לשטוף שקופיות בdiethylpyrocarbonate מים (DEPC) ולתת אוויר יבש למשך 30 דקות. הפעל שקופיות מיובשות תחת אור UV במשך 30 דקות.
  2. Cryosection כל לחסום לחלוטין ליום 30 במיקרומטר. שמור שקופיות על i היבשהce, וחתכים קפואים עד כמה שניתן. שקופיות חנות ב -80 ºC עם השלמתו.

Microdissection 4. בלייזר לכידת

  1. בגין על ידי התייבשות שקופיות מייד לפני microdissection. בוא שקופיות קפוא להפשיר במשך 10 שניות, ולאחר מכן להחיל את סדרת אתנול הבאה לכל שקופית: 60% (2 מיליליטר, 15 שניות), 80% (2 מיליליטר, 15 שניות), 95% (3 מיליליטר, 25 שניות), 100 % (7 מיליליטר, 60 שניות).
  2. הפעל מיקרוסקופ לוקליזציה photoactivated מיקרוסקופ (PALM) וכוון לתנאים הבאים: להגדלה 10X להגדיר את האנרגיה ל -82, ל -74 להתמקד, ומהירות 25 - 30. להגדלה 20X, להגדיר את האנרגיה עד 63, להתמקד ל -67, ומהירות - 5, 6. התאימו כנדרשים כדי להשיג תוצאות חיתוך אופטימליות.
  3. מבחינה ויזואלית לזהות תאי עצב באמצעות 20X או 10X הגדלה. להבדיל את שכבת תא עצב הרחה הדק משטח מתת רירית בסיסית תחת מיקרוסקופ ללא שימוש בהליך מכתים. שים לב נוירונים כמראה עמודים צפוף 18.
  4. באמצעות פונקצית העיפרון במיקרוסקופ האמור לעיל בשלב 4.2, להתחקות סביב השכבה העצבית. עקוב אחר מעט מתאי עצב כדי למנוע שריפה של נוירונים מליזר. זה חיוני לקבלת RNA באיכות גבוהה. לאחר מכן ליזום חיתוך לייזר מודרך.
  5. להרים חלקים גזורים באמצעות מלקחיים microdissection טיפ נאה ולשים רקמות בmicrotube המכיל 100 חיץ תמוגה μl על קרח. חזור לכל חלקים עצביים המתקבלים ממדגם יחיד. סה"כ זמן נתיחה לדגימה לא יעלה על 50 דקות.
  6. ברגע שהנתיחה היא מייד lysates מדגם מלא, מערבולת ולשמור על קרח יבש. דגימות חנות ב -80ºC לסך בידוד RNA.

5. בידוד של סה"כ RNA ובקרת איכות ניתוח

  1. lysates מדגם הפשרה על קרח. לבצע בידוד RNA מוחלט עם ערכת RNAqueous מיקרו עם DNase-אני איון על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן ללא שינויים (ראה <strong> איור 1). סך elution הנפח הוא כ 20 μl.
  2. למדוד ריכוז RNA ולהעריך איכות RNA עם RNA Integrity מספר (רין) באמצעות Bioanalyzer. דוגמאות שעומדות בקריטריוני בקרת איכות באיור 2 יכולות לשמש לסינתזת cDNA.

6. cDNA סינתזה

  1. לסנתז cDNA באמצעות ערכה מסחרית תקף (ראה טבלה של חומרים כימיים). בצע את צעד חישול על ידי שילוב של 0.1-1.0 ng של RNA (בהתאם לזמינות) ומים חינם RNase להיקף כולל של 8 μl לכל צינור. ואז להוסיף 1 μl של ד אוליגו (T) 20 פריימר ו1 μl של 10 מ"מ dNTP לערבב לכל צינור, להיקף כולל של 10 μl.
  2. בעדינות דגימות מערבולת ו צנטריפוגות ודגימות לחשל על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר התגובה הושלמה דגימות מייד מגניבים, על קרח.
  3. הכן פתרון תערובת הורים בהתאם למפרטים בטבלה 1. לאחר מכן להוסיף 9.5 μתמהיל l הורים ו -0.5 μl של transcriptase ההפוך מוכן מסחרי (RT) על צינור אחד. הוסף 0.5 מים RNase ללא μl לשלוט צינור במקום RT.
  4. הפעל תגובת RT עם הדגירה הראשונה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות, ולאחר מכן 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והמתנת 4 ºC סופיים, ללא רכיבה על אופניים.
  5. לדלל כל הדגימות על ידי 5x עם מים וaliquot. דגימות חנות ב -80 ºC.

7. Real Time PCR - אשר עצבי העשרה

  1. הכן את פתרון תערובת אמן על פי מפרט בטבלה 2. השתמש בבקרה פנימית כגון GAPDH. שקלו את ביטוי חוש הריח חלבון סמן (OMP) ברקמות microdissected עם ביטוי OMP ברקמת undissected כדי לקבוע העשרה עצבית.
    הערה: OMP הוא סמן לתאי עצב הרחה.
    OMP רצף: קדימה, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 "
    להפוך, '-3 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA
    רצף GAPDH: קדימה, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 "
    להפוך, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 ".
  2. הגדר את צלחת PCR על ידי הוספת 7 μl של תערובת אמן בכל μl היטב ו -3 של cDNA.
  3. צלחת צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 300 (1,300 סל"ד). תגובת הפעלה בזמן אמת באמצעות PCR תנאי הרכיבה התרמית של ברירת מחדל מצוין לSupermix המסחרי כגון SYBR הירוק יותר qPCR.
  4. לנתח נתונים (ראה איור 2 למפרט).

8. Real Time PCR - ביטוי של גנים של ריבית

  1. לבצע על דגימות שמראות העשרה עצבית של 2 קיפול או יותר.
  2. הכן תערובת אמן על קרח עבור כל בדיקה (בדיקה שכותרתו FAM של ריבית וGAPDH כותרת VIC) בצינורות נפרדים בהתאם למפרטים בטבלה 3.
  3. הגדר את צלחת PCR עם תערובת אמן 8 μl בכל μl היטב ו -2 של cDNA.
  4. צנטריפוגה את הצלחת במשך 5 דקות ב XG 300 (1,300 סל"ד). הפעל תגובת Time-PCR Real באמצעות defתנאים אולט תרמית רכיבה על אופניים כלפרוטוקול תערובת אמן ביטוי גנים הניתן על ידי היצרן. לנתח את תוצאות ביטוי (ראה איור 2 למפרט).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אסטרטגית הפרוטוקול ופתרון בעיות במחקר של חתימות מולקולריות מותאמת בהצלחה. איכות RNA וקריטריוני העשרה עצביות לדגימות לשימוש בניתוח נוסף במורד הזרם Real Time-PCR היה סטנדרטי. רין וריכוז RNA נבדקו כגורמים מבלבלים לרמות ביטוי מזוהות. בהתבסס על הניתוח של מספר דגימות עם RINs החל 1-10, נקבע כי רין מינימאלי של ~ 3.0 ומעלה מספיק לניתוח במורד הזרם במחקר זה. כתוצאה מכך, כמות RNA לcDNA הסינתזה הייתה טופל 1.0 ng. לפיכך, דגימות באיכות גבוהה עם רין מעל ~ 3.0 וRNA סכום של 1.0 ng הוסבו cDNA. דוגמאות עם 0.1-1.0 ng של RNA יכולות לשמש אם גודל מדגם נאות הנו קשה להשגה.

העשרה עצבית אושרה באמצעות ניתוח Time-PCR Real. רמות ביטוי גני OMP בדגימות microdissected הושוו לאלה במדגם undissectedים על מנת לקבוע אם השכבה העצבית הועשרה. דגימות microdissected עם שני ביטוי OMP פי או יותר בהשוואה לרקמות גזורים שאינם נמצאות בשימוש.

לכן, על ידי יישום קריטריונים אלה, את הכדאיות של גישה המוצעת ללימוד שינויים מולקולריים בתאי עצב OE קבל תוקף. איור 3 ממחיש כי רמות ביטוי של GSK-3β מושפעות ליתיום ולא על ידי גורמים חיצוניים שאינם ספציפיים, המצביעים על כך במתודולוגיה זו די בכך כדי לזהות שינויים מולקולריים ספציפיים לפני ואחרי טיפול ליתיום. באופן ספציפי יותר, שינויים של חתימות מולקולריות הקשורים לתגובה לטיפול בליתיום BD ניתן לטפל על ידי שילוב של נתונים מולקולריים זה עם נתונים קליניים.

איור 1
איור 1. הפקת RNA וDNase איון פרוטוקול. Flowchart ממחיש את ההליך להפקת RNA מדגימות לאחר LCM. RNA הכולל eluted שתי פעמים כדי להניב מקסימום RNA היקף של כ 20 μl. דגימות eluted אז לעבור DNase אני טיפול לאיון DNase. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סיכום פרוטוקול. נתון זה מסכם את כל הפרוטוקול לניסויי מחקר. רקמת אף ביופסיה ראשונה וקפוא כcryoblocks. לאחר חתך של הרקמות, השכבות עצביות הם גזורים באמצעות LCM. הפקת RNA ואיון DNase מבוצעים באמצעות ההנחיות של היצרן (ראה איור 1). דוגמאות שעומדות בקריטריוני בקרת איכות (רין וכמות RNA) המשמשות לסינתזת cDNA וed לניתוח העשרה עצבי. דגימות מועשרים המשמשות בניתוח Time-PCR אמיתי עם המטרות הרצויות. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
ביטוי 3. GSK-3β איור בדוגמאות BD והבקרה. נתון זה ממחיש את השינויים ברמות ביטוי GSK-3β בדגימות BD לפני ואחרי טיפול ליתיום ועקביות ברמות ביטוי GSK-3β בדגימות שליטה בין הביופסיה הראשונה ושנייה. יחדיו, נתונים אלו מראים כי ביטוי GSK-3β מושפע ליתיום ולא בגורמים חיצוניים שאינם ספציפיים.

ריאגנטים נפח
10 x RT מאגר 2 μl
25 מ"מ MgCl 4 μl
0.1 M DDT 2 μl
RNase מתוך 0.5 μl
עילי III 0.5 μl
מים חופשיים RNase 1 μl

טבלת 1. cDNA סינתזה מיקס מאסטר פתרון.

ריאגנטים x1 x (# של דגימות)
תבנית ה- DNA 3 μl -
SYBR ירוק 5 μl
Mix פריימר 0.8 μl
מים 1.2 μl
סה"כ 10 μl -

ss = "jove_content"> טבלת 2. עצבי ההעשרה PCR מיקס מאסטר פתרון.

ריאגנטים x1 x (# של דגימות / פריימר)
dWater 2 μl
מיקס מאסטר 5 μl
תווית בדיקה FAM 0.1 μl
תווית בדיקה VIC 0.5 μl
cDNA 2 μl -

טבלה 3. יעד PCR מיקס מאסטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פלטפורמה חדשה לקבלת שכבות עצביות חוש הריח מועשרות על ידי שילוב של הביופסיה וLCM האף מוצגת וקבלה תוקף במחקר זה. טכניקה זו יכולה להיות השלכות נרחבות. זה יכול להיות מיושם ללימודי סמן ביולוגי, כוללים אלה של תגובה לטיפול, ומאמצים לגילוי תרופות לתנאי נוירו-פסיכיאטריים אחרים, מה שהופך את השפעה רחבה יותר בתחום.

כדי להשיג תאי עצב באיכות גבוהות נוחים ליישומים במורד הזרם, כמה צעדים קריטיים ופתרון בעיות יש לציין. ראשית, לקבל 4-6 חתיכות של רקמת הרחה לחולה שיש גודל מדגם נאות. שנית, מאז דגימות רגישים השפלה RNA, לשמור על רקמה בטמפרטורות מתאימות, לעבוד עם ציוד RNase חופשי ומשטחים, כפפות שימוש, ולהימנע מלנשום ישירות על דגימות. אם איכות RNA היא עדיין נמוכה, שקלו השלים microdissection בתוך 50 דקות ולבצע הפקת RNA מייד לאחר נתיחה או וארטדגימות לשעבר באופן מיידי ולשמור על קרח יבש עד אחסון ב -80 מעלות צלזיוס. כדי להגדיל את התשואה של RNA, להגדיל את מספר הקטעים גזורים במהלך LCM.

אתגר של לימוד שינויים מולקולריים הקשורים בהפרעות נוירו-פסיכיאטריות מוח קיים בשל חוסר הנגישות ללימודי המוח האנושי. גישות חלופיות כוללות מחקר של תאי דם היקפיים, מוח נתח, ותאי גזע pluripotent מושרה (iPS). תאי דם לא יכולים לייצג שינויים עצביים הקשורים למחלות. מוח נתח לא יכול להיות המשאב ללמוד שינויים דינמיים ומדינה הקשורים להתקדמות המחלה ותגובה לטיפול תרופתי. תאי iPS עשויים שלא לשקף את השינויים ישירות מדינה, כי עקבות כאלה עשויות להימחק מבמהלך תכנות מחדש ותחזוקה של תאים. לכן, היתרונות של שימוש ברקמות OE הם היכולת ללמוד המדינה והן דינמי שינויים בהקשר העצבי. בפרט, iPS נגזר גזע עצביתאים עשויים שלא משקפים באופן נאות את ההשפעה של 6 שבועות של טיפול ליתיום, בשל צעדי culturing ותכנות מחדש. המתודולוגיה שהוצגה במאמר זה מאפשרת לנו ללמוד את השינויים מולקולריים הקשורים לטיפול ולקשר אותם לשינויים בסימפטומים קליניים. יש לציין כי, לפחות בשלב זה, את כמות תאי העצב המתקבלת מרקמות OE מספיקה ללימודים ברמה המולקולרית, אבל לא יכולה להיות מוגבלת לאפיון של חלבונים באמצעות יישומי אימונוהיסטוכימיה. לפיכך, שיפורים טכניים נוספים צפויים גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מדווחים אין יחסים פיננסיים עם אינטרסים מסחריים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds Sakura Finetek 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D) Carl Zeiss Microscopy 415190-9041-000
Rnase Zap Ambion AM9780
DEPC Treated Water Quality Biological 351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System Carl Zeiss Microscopy Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No. 5 Dumont Microdissction Forceps Roboz RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit Ambion AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit Invitrogen 18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix Invitrogen 11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes Applied Biosystems Various
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. Oxford University Press. (1990).
  2. Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59, (12), 1160-1171 (2006).
  3. Severino, G., et al. Pharmacogenomics of bipolar disorder. Pharmacogenomics. 14, (6), 655-674 (2013).
  4. Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14, (2), 182-191 (2013).
  5. Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77, (4), 247-250 (2013).
  6. Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190, (6), 563-572 (1994).
  7. Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483, (2), 154-163 (2005).
  8. Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102, (3), 587-594 (2007).
  9. Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166, (2), 137-139 (2009).
  10. Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
  11. Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18, (7), 740-742 (2013).
  12. Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17552-17557 (2013).
  13. Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21, (5), 217-228 (2011).
  14. Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74, (6), 418-426 (2013).
  15. Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
  16. Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232, (2), 203-211 (2011).
  17. Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
  18. Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15, (3), 231-232 (2010).
  19. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, (5342), 1481-1483 (1997).
  20. Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4, (11), 1329-1333 (1998).
  21. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, (5289), 998-1001 (1996).
  22. Nurnberger, J. I. Jr, et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51, (11), 849-859 (1994).
  23. Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
  24. Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics