Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu çalışmada, yeni bir platformu geliştirdi ve valide edilmiş bipolar bozukluk (BD) tedavi yanıtının intranöronal moleküler imzaları araştırmak. BD hastaların Koku epitel burun biyopsi ile elde edildi. Sonra lazer yakalama mikrodiseksiyon BD lityum yanıt moleküler imza araştırmak için Gerçek Zamanlı RT PCR ile kombine edilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Narayan, S., McLean, C., Sawa, A., Lin, S. Y., Rai, N., Hipolito, M. S., Cascella, N., Nurnberger, Jr., J. J., Ishizuka, K., Nwulia, E. A. Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders. J. Vis. Exp. (94), e51853, doi:10.3791/51853 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bipolar bozukluk (BD) az anlaşılan patofizyolojisi ile ciddi bir nöropsikiyatrik bozukluk olduğunu ve genellikle duygudurum dengeleyici, lityum karbonat ile muamele. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar ayrıca insan genetik çalışmalar lityum nöronal büyüme, hayatta kalma ve olgunlaşması ve Wnt sinyal katılan özellikle moleküller yer alan moleküler hedefleri etkilediğini göstermektedir. Merkezi sinir sistemi (MSS) lityum-yanıt ile ilişkili dinamik moleküler değişiklikler araştırmak için beyin biyopsileri elde etik sorun göz önüne alındığında, kimse bu goal.The koku epiteli koku reseptör nöronları içeren ulaşmak için koku dokulardan elde edilen nöronların kullanımını düşünebilirsiniz geliştirilmesi ve glial benzeri hücreleri desteklemek farklı aşamalarında. Bu güvenle burun biyopsi elde edilen koku doku kullanarak, nöropsikiyatrik hastalıklarda MSS dinamik değişiklikleri incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Subst oluşturduğu güçlüğün üstesinden gelmek içinnöronal olmayan hücreler biyopsi yapılan koku doku antial kirlenme, zenginleştirilmiş nöronal hücre popülasyonu elde etmek için yeni bir yaklaşım, lazer yakalama mikro-kesim ile burun biyopsi birleştirerek geliştirilmiştir. Bu çalışmada, nöronal dokuda tedavi ile ilişkili dinamik moleküler değişiklikler araştırmak için bir sistem lityum tedaviye yanıt moleküler mekanizmaların çalışması için işe BD hastalarının küçük bir pilot örneği kullanılarak, geliştirilmiş ve onaylanmıştır.

Introduction

Bipolar bozukluk (BD) ruh patolojik değişiklikler ile karakterize ciddi nöropsikiyatrik bozukluk olduğunu, sürücü ve biliş 1. BD tedavisi için kullanılan lityum hayvan çalışmalarında 2 gen çok sayıda sabit durum mRNA seviyeleri değiştirdiği gösterilmiştir, fakat bu moleküllerin herhangi insanlarda 2, klinik yanıt ile ilişkili olup olmadığını da bilinmemektedir. Lityum yanıt mekanizmasını anlamak nöronal dokularda lityum-kaynaklı moleküler değişikliklerin araştırıldığı gerektirecektir. Ne yazık ki, BD hastalarının beyin biyopsileri öncesi ve sonrası lityum tedavisi lityum yanıt moleküler imzalarını tespit elde etmek pratik değildir. Otopsi beyin dokuları BD biyomarkerları incelemek için kullanılır olmuştur, ancak, duygular, biliş ve sürücü dinamik değişiklikleri ile ilişkili moleküler belirteçler değerlendirmek için kullanılamaz; ve geriye dönük tespit lityum tedaviye yanıt geçerliliği sorunlu olabilir 4. Lenfositler ve diğer kan hücreleri yararlı olabilir, ancak kan hücrelerinde moleküler değişiklikler nöronal değişiklikleri 3-5 yansıtmayabilir. Beyin omurilik sıvısı hastalığıyla ilişkili ve ilaç-geri dönüşümlü içsel değişiklikleri yansıtıyor olabilir hücre içi moleküller hakkında bilgi edinmek için yetersiz olabilir.

koku epiteli (OE) merkezi sinir sistemi (MSS) eşsiz bir parçasıdır, limbik yapılara 6 embriyolojik ilgili; ve burun biyopsi ile kolayca erişilebilir. Bu oluşur glial benzeri gelişme 7-9 farklı aşamalarında (yani, sustentacular) hücreleri, bazal çoğalan hücreleri ve koku reseptör nöronlar destekler. Bu nedenle, OE accessibly nöropsikiyatrik hastalıklara 7 olan hastaların MSS dinamik değişiklikleri incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Çalışmalar bu occ yansıtan hastalıkla ilişkili olayları araştırmak için bir vekil doku olarak OE programı gösteriyorlarbeyin nöronlarının 8,9 urring. Örneğin, çalışmalar psikiyatrik koşullar 10-14 ile ilişkili moleküler profilleri araştırmak için OE kullanmıştır. Koku sistem aynı zamanda şizofreni 15 negatif belirtiler ile ilişkili koku açıkları gibi klinik endophenoytpes tanımlamak için hizmet vermektedir. Ayrıca, nörogelişimsel süreçleri psikiyatrik durumlar 8,9 patofizyolojisinin modellemek için yararlı bir yol sağlayan, hayat boyu OE devam ediyor.

Bununla birlikte, bu doku kullanımı için bir sakınca nöronal olmayan hücrelerin 16 koku biyopsilerin önemli konu, kirliliktir. Örneğin, önceki OE çalışmalarında, gen ifade çalışmaları için kullanılmıştır toplam RNA, nöronal olmayan hücrelerin 17 RNA dahil olmak üzere tüm burun biyopsi dokusundan ekstre RNA içeriyordu. Bu nedenle, önceki yaklaşımlar hücre kalitesi ile sınırlı kalmıştır. Bu sorunu aşmak için, yeni bir yaklaşım elde etmek Lazer-yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ile burun biyopsi birleştirerek zenginleştirilmiş nöronal hücre popülasyonları 18 geliştirilmiştir.

LCM enfraruj lazer 19-21 ile birlikte, UV lazer kesim kullanılarak hücrelerin seçici izolasyonu sağlayan bir tekniktir. OE yaklaşımı ile birleştirilmesi lcm böylece nöronal hücrelerin 18 zenginleştirilmesini artırılması, nöronal olmayan hücreler tarafından OE önemli kirlenmesini en aza indirir. Ayrıca, nöronal tabaka bu şekilde boyama için ihtiyacı ortadan kaldırarak, bir mikroskop altında alt mukoza tabakası ayırt edilebilir. Nöronal hücre tipleri daha fazla ilgi 7 hücre tipi ile ifade edilir, birincil antikorlar kullanılarak diğer hücre popülasyonlarından ayırt edilebilir. Bu nedenle, bu prosedür, gen ekspresyon çalışmaları, immünohistokimya ve diğer morfolojik araştırmalar için kullanılabilir hemen hemen tamamen nöronal hücre popülasyonunun zenginleştirilmesi için daha kolay bir yöntem ortaya koymaktadır.

ve_content "> Bu çalışma hastalık durumlarında ve tedavi yanıtı ile ilişkili koku nöronlar moleküler değişiklikleri araştırmak için deneysel bir platform oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu adres için, BD için DSM-IV tanı ölçütlerine göre sigara içilmeyen hastaların küçük bir set dayalı Genetik Çalışmaları Tanı Görüşmesi (DIG) 22 iki burun biyopsi geçmesi işe edildi: lityum ve ikinci biyopsi ile bir biyopsi ön arıtma, günlük oral lityum tedavisinin 6 hafta sonra Ayrıca, uygun BD hastalar olmalıdır:. depresyonun için semptomatik Montgomery-Asberg Değerlendirme Ölçeği (MADRS) 23 uygulanan klinisyen içinde 60 ≥10 puanlama dayalı (YMÖ'nin) hipomani veya mani için semptomatik, Young-Mani Derecelendirme Ölçeği klinisyen üzerinde 56 arasında bir skor ≥10 dayalı . 24;. MADDÖ ve iki ölçek için klinisyenler arasındaki anlaşmanın YMRS Değerlendirici-Inter-Değerlendirici katsayısı hem veya ≥10 biyopsi sonra, nöronlar Enri 0.96 idi> olanLCM tarafından OE dür. Doku ve nöronal zenginleştirme yüksek kaliteli RNA'nın çıkarılmasını sağlamak için, ek kalite kontrol önlemleri ardından, Real Time RT-PCR ilgi genlerin öncesi ve tedavi sonrası ifade düzeylerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. takip eden bölümlerde bir bu yaklaşımın geçerliliğinin açıklamasını, protokol optimizasyonu vurgulayarak ve sorun-çekim protokolü uygulanmıştır stratejileri içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışmada tüm araştırma gönüllüleri Howard Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmış bilgilendirilmiş onam belgeleri verildi. Bilgilendirilmiş onam belgeleri imzalayarak razı Sadece katılımcılar çalışmaya alındı. Bu analiz için çalışma baz oluşuyordu: 20 denek (12 BD ve 10 kontroller;% 30 erkek) ve 38.2 (14.1) yaşını (sd) anlamına gelir.
NOT: cam ve plastik yüzeyler RNaz kontaminasyonu kaldırmak için RNaz Zap ile tüm yüzeyleri püskürtün.

1. Biyopsi Prosedürü

  1. Çalışma katılımcının burun boşluğunda topikal lidokain (xylocaine) sıvı% 4 ve oksimetazolin HCI 0.05% Sprey ve zaman uyuşturma 15 dakika bekleyin.
  2. Lidokain ve oksimetazolin oluşan bir karışım içinde yarım x 3 inç cerrahi cottonoids daldırın ve burun bölmesinin üst kısmı boyunca, burun boşluğunda yerleştirin ve 15 dakika bekletin.
  3. 30 ° sert kullanmanazal endoskop, nazal kavite üst bölümünü bulun birkaç küçük örnekleri alarak, burun septum üstün kısmından yukarı-ısırma burun forseps kullanarak burun mukozasının kaldırmak için.

Doku Blokları 2. Hazırlık

  1. Hemen önce biyopsi, doku ortamı dondurma standart boy cryomolds doldurun.
  2. Otoklava cımbız kullanarak, dondurma ortamda taze doku monte ve kuru buz üzerinde dondurma. , Dondurma ortamı ile cryoblock kalanını doldurun kuru buz cryoblock dondurma ve -80ºC de mağaza blokları.

3. Cryosectioning

  1. Cryosectioning hemen önce polietilen (PEN) membran cam slaytlar hazırlayın. 5 dakika boyunca RNaz Zap çözelti ile slaytlar püskürtün. Sonra dietilpirokarbonat (DEPC) su içinde slaytlar durulayın ve 30 dakika kurumasını sağlar. 30 dakika UV ışık altında kurutulmuş slaytlar etkinleştirin.
  2. Cryosection her 30 um tamamen bloke eder. Kuru i slaytlar tutunCE ve bölümler mümkün olduğu kadar donduruldu. Tamamlanmasıyla -80 ºC Mağaza slaytlar.

4. Lazer-Yakalama Mikrodisseksiyon

  1. Hemen önce Mikrodiseksiyon slaytları suyunun başlayın. % 60 (2 mi, 15 saniye) ile,% 80 (2 mi, 15 saniye) ile,% 95 (3 mi, 25 sn), 100: Her bir slayt aşağıdaki etanol serisi uygulanır, sonra donmuş slaytlar Let 10 sn için çözülme ve % (7 mi, 60 saniye).
  2. Üzerine fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) mikroskop çevirin ve set aşağıdaki koşullara: 82 enerji set 10X büyütme için, 74'e odaklanmak ve hız 25 - 30. 20X büyütme için, 63 enerji ayarlamak, 67 odak, ve hız 5 - 6 optimum kesim sonuçları elde etmek için gerekli ayarlayın.
  3. Görme 20X veya 10X büyütme kullanarak nöronlar tespit. Boyama işlemi kullanılmadan bir mikroskop altında yatan alt mukoza ince yüzey koku nöron tabakası ayırt eder. Yoğun sütunlu görünüm 18 olarak nöronlar gözlemleyin.
  4. Aşama 4.2 Yukarıda bahsedilen mikroskop Kalem fonksiyonunu kullanarak, nöronal tabaka etrafına iz. Lazerden nöronların yanmasını önlemek için biraz uzakta nöronlardan Trace. Bu yüksek kalitede RNA elde etmek için gereklidir. Sonra lazer güdümlü kesim başlatmak.
  5. Ince uçlu mikrodiseksiyon forseps kullanılarak disseke bölümleri Pick up ve buz üzerinde 100 ul lizis tamponu içeren bir mikro doku koymak. Tek bir örnekten elde edilen tüm nöronal bölümler için tekrarlayın. 50 dakika geçmemelidir numune başına toplam diseksiyon zamanı.
  6. Diseksiyon tamamlandıktan hemen vorteks örnek lizatları ve kuru buz üzerinde tutmak kez. Toplam RNA izolasyonu için -80ºC Mağaza örnekleri.

Toplam RNA ve Kalite Kontrol Analizi 5. izolasyonu

  1. Buz üzerinde çözülme örnek lizatları. (Bkz hiçbir değişiklik ile üreticinin protokolünü takip ederek DNaz-ı inaktivasyonu ile RNAqueous Mikro Kit ile toplam RNA izolasyonu yürütmek <strong> Şekil 1). Toplam elüsyon hacmi yaklaşık 20 ul.
  2. RNA konsantrasyonu ölçmek ve Bioanalyzer kullanarak RNA Bütünlük sayısı (RIN) ile RNA kalitesini değerlendirmek. Şekil 2 'de kalite kontrol kriterleri yerine getiren örnekler, cDNA sentezi için de kullanılabilir.

6. cDNA Sentezi

  1. Bir valide ticari kit kullanılarak cDNA sentez (Reaktifler bkz: İçindekiler). Tüp başına 8 ul toplam hacmine RNA (durumuna bağlı olarak) ve RNazsız su içinde 1.0 ng 0.1 - birleştirerek tavlama aşamasını gerçekleştirir. Daha sonra 10 ul toplam hacim için, tüp başına karışımı oligo d (T) 20 primeri 1 ul 10 mM dNTP ve 1 ul ekle.
  2. 5 dakika boyunca 65 ° C 'de yavaşça girdap ve santrifüj örnekleri ve tavlama örnekleri. Buz üzerinde, reaksiyon tamamlandıktan sonra, derhal soğuk örnekler.
  3. Tablo 1'de özelliklerine göre ana karışımı çözeltisi hazırlayın. Sonra 9.5 μ eklemekHer tüpe l ana karışımı ve ticari olarak hazırlanmış ters transkriptaz (RT), 0.5 ul. Yerine RT tüp kontrol etmek için 0.5 ul RNaz içermeyen su ilave edilir.
  4. Hiçbir bisiklet ile 50 dakika, 5 dakika ve son 4 ºC tutuş için daha sonra 85 ºC 50 ºC ilk inkübasyon ile RT reaksiyonu çalıştırın.
  5. Su ve bölümüyle 5x bütün örnekleri sulandırmak. -80 ° C'de saklayın örnekleri.

7. Real Time PCR - Nöronal Zenginleştirme Onayla

  1. . Tablo 2'de özelliklerine göre ana karışımı çözüm hazırlayın gibi GAPDH gibi bir iç kontrol kullanın. Nöronal zenginleştirme belirlemek için undissected dokuda OMP ifade ile microdissected dokuda koku markör proteini (OMP) ifade Karşılaştırması.
    NOT: OMP koku nöronlar için bir belirteç olduğunu.
    OMP dizisi: İleri, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
    , geri 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
    GAPDH dizisi: İleri, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
    ters 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '.
  2. CDNA her bir kuyu ve 3 ul ana karışımı 7 ul ekleyerek PCR plakasını ayarlayın.
  3. 300 xg (1.300 rpm) 5 dakika santrifüj plakası. Böyle SYBR Greener qPCR gibi ticari Supermix için belirtilen varsayılan termal döngü koşulları kullanılarak Çalışma Real Time PCR reaksiyonu.
  4. Veri (özellikler için bakınız Şekil 2) analiz edin.

8. Gerçek Zamanlı PCR, - söz konusu genler sentezlenmesi

  1. 2 kat veya daha fazla nöron zenginleşme göstermektedir numuneler üzerinde gerçekleştirin.
  2. Her prob Tablo 3'te özelliklerine göre ayrı tüplere (faiz ve VIC-etiketli GAPDH FAM-etiketli prob) için buz üzerinde ana karışımı hazırlayın.
  3. CDNA her bir kuyu ve 2 ul 8 ul ana karışımı ile bir PCR plakasını ayarlayın.
  4. 300 xg (1300 rpm) 5 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Def kullanarak Real Time PCR reaksiyonu çalıştırınüretici tarafından sağlanan gen ifadesi usta karışımı protokolü uyarınca ault termal döngü koşulları. Ifade sonuçlarını (özellikler için bakınız Şekil 2) analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Moleküler imza çalışmada protokol ve sorun giderme stratejisi başarıyla optimize edildi. Numuneler için, RNA kalitesi ve nöronal zenginleştirme kriterleri daha sonraki alt akış Anlık-PCR analizi kullanılmak üzere standardize edildi. RIN ve RNA konsantrasyonu tespit ifade düzeyleri karıştırıcı faktörler olarak incelendi. 1 arasında değişen rin birkaç numune analize dayalı olarak - 10, yukarıda ~ 3.0 ve en az RIN Bu çalışmada alt analizi için yeterli olduğu tespit edilmiştir. Bunun bir sonucu olarak, cDNA sentezi için bir RNA miktarı 1.0 ng standardize edilmiştir. Bu nedenle, yukarıda belirtilen bir RIN kaliteli numuneleri ~ 1.0 ng 3.0 ve RNA miktarı cDNA'ya dönüştürülmüştür. 0.1 Örnekler - yeterli bir numune boyutu elde etmek zor ise RNA 1.0 ng kullanılabilir.

Nöronal zenginleştirme Anlık-PCR analizi kullanılarak teyit edilmiştir. Microdissected örneklerde OMP gen ekspresyon düzeyleri kullanılan undissected örnekteki ile karşılaştırılmıştırnöronal tabaka zenginleştirilmiş olup olmadığını belirlemek için s. Olmayan kesilmiş doku ile karşılaştırıldığında iki kat ya da daha büyük bir OMP ifadesi ile microdissected örnekler kullanılır.

Bu nedenle, bu kriterleri uygulayarak, valide edilmiş OE nöronlarda moleküler değişikliklerin eğitim için önerilen bu yaklaşımın uygulanabilirliği. 3 Bu metodoloji belirten GSK-3β ifade seviyeleri lityum ziyade spesifik olmayan dışsal faktörler tarafından etkilendiğini göstermektedir Şekil önce ve lityum tedavi sonrası spesifik moleküler değişiklikleri tespit etmek için yeterlidir. Daha spesifik olarak, BD lityum tedaviye yanıt ile ilişkili moleküler imza değişiklikler klinik verilerle bu moleküler verileri birleştirerek ele alınabilir.

Şekil 1,
Şekil 1. RNA Ekstraksiyon ve DNaz İnaktivasyonu Protokolü. FlowcharT LCM sonra örneklerin RNA çıkarmak için prosedürü gösterir. Total RNA, yaklaşık 20 ul arasında maksimum RNA hacmi elde etmek için iki kez yıkanır. Aynştıncı numuneler daha sonra DNaz inaktivasyonu için DNaz I tedavi altına. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Protokol Özeti. Bu rakam çalışma deneyleri için tüm protokol özetlemektedir. Burun doku ilk biyopsi ve cryoblocks olarak dondurulur. Doku kesit sonra, nöronal katmanlar LCM kullanılarak disseke edilir. RNA ekstraksiyonu ve DNaz inaktivasyon üreticinin kullanım kılavuzu (Şekil 1 e bakınız) kullanılarak gerçekleştirilir. Kalite kontrol kriterleri yerine getiren örnekler (RIN ve RNA miktarı) cDNA ve bize sentezlenmesi için kullanılannöronal zenginleştirme analizi için ed. Zenginleştirilmiş numuneler istenen hedeflerle Real Time PCR analizi kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
BD ve Kontrol Örnekleri Şekil 3. GSK-3β İfade. Bu rakam, birinci ve ikinci biyopsi arasındaki kontrol örneklerinde GSK-3β ifade düzeylerinde BD örneklerinde GSK-3β ifade düzeylerinde değişiklik öncesi ve sonrası lityum tedavisi ve tutarlılık göstermektedir. Birlikte ele alındığında, bu veriler GSK-3β ifade lityum ziyade spesifik olmayan dışsal faktörlerden etkilendiğini göstermektedir.

Reaktifler Hacim
10 x RT Tampon 2 ul
25 mM MgC 4 ul
0.1 M DDT 2 ul
RNaz Out 0.5 ul
Üst Simge III 0.5 ul
Rnase ücretsiz su 1 ul

Tablo 1. cDNA Sentezi Master Mix Çözüm.

Reaktifler x1 X (örnekleri arasında)
Şablon DNA, 3 ul -
SYBR Green 5 ul
Primer karışımı 0.8 ul
Su 1.2 ul
Toplam 10 ul -

Tablo 2. Nöronal Zenginleştirme PCR Master Mix Çözüm.

Reaktifler x1 X (örnek / astar içinde)
dWater 2 ul
Master Mix 5 ul
FAM etiketli sistemi 0.1 ul
VIC Etiketli sistemi 0.5 ul
cDNA 2 ul -

Tablo 3. Hedef PCR Master Mix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burun biyopsi ve LCM birleştirerek zenginleştirilmiş koku nöronal katmanları elde etmek için bir yeni bir platform sunulmuştur ve bu çalışmada onaylanmıştır. Bu teknik yaygın etkileri olabilir. Bu alanda daha geniş bir etki yaparak, tedaviye yanıt için olanlar da dahil olmak üzere biyomarkır çalışmaları, ve diğer nöropsikiyatrik durumlar için ilaç keşfi çabalarına uygulanabilir.

Mansap uygulamalara yatkın, yüksek kaliteli nöronlar elde etmek için, bir kaç kritik ve sorun giderme adımları dikkat edilmelidir. Yeterli örneklem büyüklüğü için hasta başına koku doku 6 adet - Öncelikle, 4 edinin. Numuneler RNA bozulmaya yatkın olduğundan İkincisi, uygun sıcaklıklarda doku tutmak RNazsız ekipman ve yüzeyler, kullanım eldiven ile çalışmak, ve numuneler üzerinde doğrudan nefes kaçının. RNA kalitesi hala düşükse, 50 dakika içinde mikrodiseksiyon tamamladıktan düşünün ve hemen diseksiyon veya Vort sonra RNA ekstraksiyon gerçekleştirmeky numuneleri hemen -80 ° C 'de depolama kadar kuru buz üzerinde tutun. RNA verimi artırmak için, LCM sırasında kesilmiş bölümlerin sayısını artırmak.

Nöropsikiyatrik bozukluklarda beyin-ilişkili moleküler değişiklikler okuyan bir meydan okuma nedeniyle insan beynini incelemek için erişilebilirlik eksikliği var. Alternatif yaklaşımlar, çevresel kan hücreleri, otopsi beyin çalışma ve uyarılmış pluripotent kök (IPS) hücreler yer alır. Kan hücreleri hastalığı ile ilişkili nöronal değişiklikleri temsil olmayabilir. Otopsiye beyinler hastalığın ilerlemesine ve tedaviye yanıt ile ilişkili dinamik ve durum değişikliklerini incelemek için kaynak olamaz. Bu tür izleri yeniden programlama ve hücrelerin bakımı sırasında dışarı silinecek muhtemeldir çünkü iPS hücreleri doğrudan devlet değişiklikleri yansıtmıyor olabilir. Bu nedenle, OE dokuları kullanmanın avantajları nöronal bağlamında hem devlet hem de dinamik değişiklikleri incelemek için yeteneği vardır. Özellikle iPS nöronal kök türetilmişHücreler yeterli kültür ve yeniden programlama adımları nedeniyle lityum tedavisi 6 hafta etkisini yansıtmıyor olabilir. Bu yazıda sunulan metodoloji bize tedavi ile ilişkili moleküler değişiklikleri incelemek ve onları klinik semptomlar değişikliklere ilişki sağlar. Bu, en azından şu anda OE dokularından elde edilen nöronların miktarı moleküler düzeyde çalışmalar için yeterli olmakla birlikte, immünohistokimya uygulamaları ile proteinlerin karakterizasyonu ile sınırlı değildir, yani dikkat edilmelidir. Böylece, daha fazla teknik gelişmeler de beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ticari çıkarları ile finansal ilişkileri rapor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Tissue-Tek Cryomold Molds Sakura Finetek 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583
Cryosectioning
Membrane Slide 1.0 PEN (D) Carl Zeiss Microscopy 415190-9041-000
Rnase Zap Ambion AM9780
DEPC Treated Water Quality Biological 351-068-131
Microdissection
Microscope: PALM Series MicroLaser System Carl Zeiss Microscopy Model: Axiovert 200M
Software: Robo v3.2
No. 5 Dumont Microdissction Forceps Roboz RS-49085
RNA Extraction
RNAqueous Micro Kit Ambion AM1931
cDNA Synthesis
SuperScript III First Strand Synthesis Kit Invitrogen 18080-051
OMP qPCR
SYBR GreenER qPCR SuperMix Invitrogen 11760-500
Taqman qPCR
TaqMan Expression Assay Probes Applied Biosystems Various
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. Oxford University Press. (1990).
  2. Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59, (12), 1160-1171 (2006).
  3. Severino, G., et al. Pharmacogenomics of bipolar disorder. Pharmacogenomics. 14, (6), 655-674 (2013).
  4. Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14, (2), 182-191 (2013).
  5. Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77, (4), 247-250 (2013).
  6. Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190, (6), 563-572 (1994).
  7. Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483, (2), 154-163 (2005).
  8. Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102, (3), 587-594 (2007).
  9. Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166, (2), 137-139 (2009).
  10. Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
  11. Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18, (7), 740-742 (2013).
  12. Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17552-17557 (2013).
  13. Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21, (5), 217-228 (2011).
  14. Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74, (6), 418-426 (2013).
  15. Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
  16. Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232, (2), 203-211 (2011).
  17. Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
  18. Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15, (3), 231-232 (2010).
  19. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, (5342), 1481-1483 (1997).
  20. Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4, (11), 1329-1333 (1998).
  21. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, (5289), 998-1001 (1996).
  22. Nurnberger, J. I. Jr, et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51, (11), 849-859 (1994).
  23. Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
  24. Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics