쥐의 눈물샘을 조작

Biology

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Summary

눈물샘 (LG)는 비전과 눈 건강을 유지하기 위해 필요한 눈물의 수성 부품을 생산하는 분기 기관이다. 여기에서 우리는 LG 개발에 참여 경로 신호 해독 쥐 LG 절제술 및 체외 배양 기술에 대해 설명합니다.

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Finley, J. K., Farmer, D., Emmerson, E., Cruz Pacheco, N., Knox, S. M. Manipulating the Murine Lacrimal Gland. J. Vis. Exp. (93), e51970, doi:10.3791/51970 (2014).

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Abstract

누선 (LG)는 각막의 구조 및 기능, 시력에 필수적인 투명한 조직을 유지시키기 위하여 필요한 수성 눈물 분비. 5 관 - 인간의 단일 LG는 3를 통해 안구 표면에 눈물을 전달하는 각각의 눈의 좌우 끝 위의 궤도에 있습니다. 마우스가 주요 안구 땀샘이 세 켤레를 가지고,이 대부분의 연구는 귀에 exorbital 눈물샘 (LG)에 위치한 전방 및 복부입니다. 다른 선의 기관과 마찬가지로, LG는 압축 된 중간 엽 내의 단일 상피 싹이 분비 샘 꽈리와 덕트의 복잡한 상호 연결된 네트워크를 형성 꽃 봉 오리와 덕트 형성의 여러 라운드를 거쳐하는 상피 분기 형태 형성의 과정을 통해 개발하고 있습니다. 이 정교한 과정이 아니라 췌장과 침샘 다른 많은 상피 기관에 설명하고있다. 그러나 LG는 훨씬 더 탐구하고있다 및 형태 형성을 제어하는​​ 메커니즘은 제대로 아래에 있습니다서 있었다. 우리는 모델 시스템으로이 과소 표현이 찾는 해부와 LG 배양과 관련된 어려움의 결과라고 생각한다. 따라서, 우리가 해부 수확 배아 및 산후 LG에 대한 기술과 조직의 체외 배양 방법을 설명합니다.

Introduction

누선 (LG)는 시력과 건강 유지 및 안구 표면의 세포의 보호에 중요한 수성 눈물 분비를 담당한다. 안구 자극, 빛 감도 특징과 비전 (1)를 감소 수성 결핍 안구 건조 질환 : 가장 일반적이고 쇠약 안구 질환 중 하나 LG 부전 결과. 인간에서 LG는 눈의 측면 끝 위의 궤도에 상주하는 3 - 안구 표면에 5 배설 덕트 예금 눈물. 마우스가 주요 안구 땀샘이 세 켤레를 가지고,이 대부분의 연구는 하나의 배설 덕트를 통해 눈에 여행 눈물 귀 (exorbital)에 눈물샘 (LG)에 위치한 전방 및 복부입니다. 다른 선의 기관과 마찬가지로, LG는 압축 된 중간 엽 내의 단일 상피 꽃 봉오리가 여러 새싹의 라운드와 용 덕트 형성을 겪게되는 상피 분기 형태 형성의 과정을 통해 개발(그림 1) 분비 샘 꽈리와 덕트의 복잡한 상호 연결된 네트워크를 평방 미터. 개발 과정에서 상피 세포는 혈관된다뿐만 아니라 크게와 우수한 경추 신경절 3에서 교감 신경에 의해 pterygopalatine 신경절의 부교감 신경에 의해 낮은 정도에 분포하는. 유형은 신경 상피, 내피 세포 및 간엽 이들 세포 간의 상호 작용은 각각, 함수 및 성인 조직의 유지에 필수적이다. 그러나, 인터 ​​- 셀 타입의 통신이 이러한 프로세스를 안내하는 방법뿐만 아니라 LG 발달 및 재생을 조정 기본 분자 메커니즘은 확실하지 않다.

배아 체외 배양 기술의 출현은 다수의 분기 장기 4의 발달 및 재생 경로의 식별을 허용했다. 생체 외에서 배양하면 연구자에게 (나 기관을 조작하는 기능을 제공기계적인, 유전 물질 또는 화학 물질) 정의 된 조건에서뿐만 아니라 실시간으로 장기 개발 및 세포 - 세포 상호 작용의 특성을. 마우스의 exorbital LG 전자는이 기술에 매우 의무가 최근 연구 개발 2.5을 조절하는 신호 시스템 정의했습니다. 그러나, LG 개발 및 재생을 뒷받침 분자 단서를 이해 할 필요에도 불구하고 현재 가능성 때문에 장기를 단리에 기술적 인 문제로 남아 파악 하였다. 이 논문에서, 우리는 분리와 개발 프로그램을 정의하기 위해 배아 쥐 LG의 체외 배양을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

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Protocol

모든 동물의 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하에 수행되었다. 이 프로토콜은 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 샌프란시스코에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 배아 눈물샘 (LG) : 수확 및 이외에 Microdissection

  1. , 과학 연구 윤리위원회의 기관 동물의 승인 절차를 수행하면 해당 배아 일에 수확 배아 자궁 전위에 의해 확인 다음, 상승 CO 2 흡입 임신 CD-1 (또는 유전자 변형) 여성을 초과 안락사. 질 플러그 검색 E0의 날을 지정합니다.
    참고 : 눈물샘 (LGS)은 이후 E14 하나의 꽃 봉오리 단계에서 수확 할 수있다. 그러나, E16 (5-10 싹) 배아는 체외 문화에 대한 가장 일관된 결과를 제공합니다.
  2. V를 소독70 % 에탄올을 사용하여 마우스의 측면 entral. 피부를 조이고 무균 수술 가위로 중간 선에서 절개를; 피부의 실수로 복강을 노출 복막. 100 U / ㎖ 페니실린과 100 μg의가 / ㎖ 스트렙토 마이신이 보충 된 각각의 자궁 뿔과 장소 차가운 PBS에서 (인산염 완충 식염수) 또는 DMEM의 F12 미디어의 상단에있는 mesometrium을 따라 절단하여 2 자궁 뿔을 제거합니다.
  3. 집게를 사용하면 (# 5), 양막 낭에서 배아를 제거하고 차가운 PBS를 포함하는 두 번째 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 눈이나 머리 부분을 만지지 않도록주의하십시오.
  4. transillumination 기지와 해부 현미경에 배아를 놓습니다. 1.7 - 배아 <E17 경우, 단계 1.5을 수행합니다. 배아 경우> E17는 다음과 같이 따라서 1.8 단계로 진행, 도움이 될하지 않고 반드시 할 수있다.
  5. 바로 아랫 부리 아래의 몸통 (단계 1, 그림 2) 날기에서 머리를 절단GA 멸균 메스 (# 10 블레이드). 하악이 해부 접시에 지금이되도록 머리를 돌립니다. 머리와 약 ¼ 뇌 (2 단계, 1컷, 그림 2)의 등 쪽을 제거하는 메스를 안정시키기 위해 집게를 사용하여 -이 연골 E15 주위에 경직되면 특히 중요합니다.
  6. 메스는 눈 사이의 코를 관통 할 수 있도록 머리의 방향을. 눈은 별도의 절반 (2 단계 2 차 컷, 그림 2)에 지금 그래서, 헤드의 중심을 잘라주십시오.
  7. 두 # 5 집게 사용하여 머리의 절반을 과잉 조직 (그림 2 단계 3 참조)를 제거합니다. (눈의 낮은 후방 모서리에 위치) LG는이 제거 과정에서 손실되지 않도록 머리를 됐는지 확인하십시오. 초과 뇌, 연골, 비강 조직 주변과 눈 아래를 제거합니다. 선이 시점에서 거의 보이지 때문에, 적절히 과량 조직 수거 t 후에 배향 눈을 보장O LG의 위치를​​ 잃지 마십시오.
  8. 조심스럽게 뒤, 두 집게로 눈의 하단으로부터 피부를 잡아. 조심스럽게 LG를 노출 할 수있는 집게로 열린 당겨 피부를 제거합니다. LG를 시각화하기 위해 조직 위와 아래에 추가 조명을 사용합니다.
    주 : LG 전자, 어두운, 압축 된 중간 엽 내 덕트에 꽃 봉오리 같은 모양으로 구별이 시점에서 볼 수 있어야합니다.
  9. 조심스럽게 LG 및 관련 중간 엽를 LG 또는 관련 덕트를 잡아 않도록주의하면서, 집게를 사용하여 거리 주변 조직에서 (다이어그램 및 이미지 참조) 해부하기 시작합니다. 글 랜드는 주변 조직에서 무료로되면, 부드럽게 LG 덕트의 바닥에있는 눈을 둘러싸고있는 상피 세포를 양손으로 전체 선을 제거합니다. 압축 된 중간 엽에 상피 invaginates으로 관찰 할 수있는 상피 세포를 둘러싸고있는 중간 엽을 유지하기 위해주의하십시오.
    참고 : tissu의 일부 추가 제거즉 (임의의 작은 뼈 조각, 근육, 및 결합 조직) 조직 이웃으로부터 / 성장 인자 시그널링을 피하기 위해 필요하다.
  10. 문화, 수확 4 - 5 땀샘과 판 당 관련 중간 엽 (LGS 즉시 해부에 도금) RT-PCR 6 RNA 용해 버퍼 100 ㎕ 당 14 땀샘의 최소를 수집합니다.

2. 생체 내 문화 플레이트를 준비

이 절차는 현상 침샘 7,8에 대해 사용 된 것과에 기초한다.

  1. 바닥이 유리로 된 50mm 직경의 마이크로 웰 요리 (7) 50 ㎍ / ml의 아스코르브 산 50 ㎍ / ㎖의 홀로 트랜스페린과 문화 미디어 (100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신으로 보충) DMEM의 F12 200 μl를 추가합니다.
    참고 : 우리가 이전에 배아 타액선의 ​​형태 형성을 극대화하기 위해 그것을 발견 DMEM의 F12가 선택되었다.
  2. 13mm의 POLYCARB 플로트미디어의 상단에 0.1 μm의 기공 네이트 멤브레인 필터.
  3. 선택적 단계가 : 3 mg / ml의 최종 농도를 만들어 DMEM / F12와 1 (부드럽게 섞어 200 μL 피펫을 사용하여, 원심 분리를 1 분 동안 기포가 나타나는 경우) : 3-D 라미닌 1 희석. 추가이 15 μL 필터하기 위해 3-D의 라미닌을 희석.
    주 :이 희석 상피 브랜칭을 손상시키지 않고 3D 상태 LG를 유지하는데 최적 인 것으로 밝혀졌다. 그러나, LG의 배양을위한 필수적인 것은 아니다.
  4. 필터에 또는 라미닌에 5 LG - 4 놓습니다. 문화 LGS 생체 24 - 48 시간 (그림 3) 또는 (20) qPCR에 의한 추가 분석을 위해 분 또는 면역 염색 (그림 4) 4 % PFA로 고정한다. 배아 유선 조직의 qPCR의 분석을 위해, Rebustini 등의 알을 참조하시기 바랍니다. 2011 년. 배아 선의 조직의 면역 형광 분석을 위해 다음의 인용을 참조하십시오 : 호프만 외, (2002)과 스타인버그 전자.t 알., (2005).

3. 마우스 출생과 성인 눈물샘 (LG) : 해부

  1. 적절한 동물 윤리위원회의 기준에 따라 출생 후 마우스를 안락사. 출생 후의 새끼 하루 8 세 이하의 경우, 멸균 가위로 머리를 절단에 의해 안락사. 출생 후 8 일 또는 그 이상을 위해, 70 % 에탄올 모피 스프레이.
  2. LG를 찾으려면, 마우스 위에서 조명과 해부 현미경 아래에 좌우 측면 누워. 참고 : 산후 성인 LG는 경동맥, 턱 근육과 진피 (그림 5 참조)과 마주하고 있습니다.
  3. 작은 해부 가위를 사용하여, 옆으로 LG를 배치 할 위치에서 표피에 작은 절개를합니다.
  4. 집게를 사용하여 LG를 노출 귀쪽으로 표피를 당겨 엽니 다.
  5. 부드럽게 주변 조직에서 LG를 풀고 집게를 사용합니다.
  6. LG가 주변 조직에서 분리되면, 조심스럽게, 덕트가 LG를 제거덕트와 눈을 둘러싸는 상피 (도 1)를 연결하는 지점에 의해 파지.
  7. RT-PCR을위한 RNA 용해 버퍼에 LGS를 배치, 또는 면역 염색에 20 분 동안 4 % PFA로 고정한다.

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Representative Results

LG는 상피 분기 형태 형성의 과정을 통해 개발하고 있습니다. E14, E15, E16, E17, 및 P2에서 해부 배아 LGS의 시야 이미지는이 이벤트를 보여줍니다.

그림 1
그림 1. LG는 형태 형성 분기 상피의 과정을 통해 개발하고 있습니다. 갓 E14, E15, E16, E17 및 P2에서 해부 배아 LGS의 명 시야 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

크기가 증가함에 따라 상피, 중간 엽의 양이 감소한다는 것을주의. 배아 LGS의 미세 절제의 실험 단계는 그림 2에 나타내었다.


마우스 배아에서 LG의 미세 절제하는 몇 가지 단계 그림 2. 회로도. 해부 및 배아 마우스에서 LG의 제거의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

LG 문화를 위해 우리는 정기적으로 체외 성장의 일관성으로 인해 E16 배아를 사용합니다. 도 3에 도시 된 바와 같이 배양 조건은 생체 동맥 유사한 방식으로 개발 생체, LG의 예는 (도 1을 비교).

그림 3
그림 3. E16 LGS의 생체 내 문화는 생체 형태 형성에 되풀이. E16의 LGS는 GFP가 상피 세포에 의해 표현된다 PAX6-Cre 호텔, GFP의 배아에서 유래되었다. 연속 형광 이미지에서이 하나의 선으로 촬영 한 0, 3, 6, 12, 24, 및 48 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기에서 우리는 우리가 48 시간 배양 기간 동안 분기 상피의 연속 형광 이미지를 취할 수 있도록 상피 세포를 강조하기 위해 (또한 르-Cre 호텔 5라는) PAX6-Cre 호텔, GFP 배아를 고용했다. PAX6-Cre 호텔, GFP의 유전자를 품고 마우스는 JAX에서 얻을 수 있습니다 : Tg는 (PAX6-Cre 호텔, GFP) 1Pgr하지만 글 랜드 해부와 문화에 대한 필요하지 않습니다.

문화 또는 갓 LG는 면역 분석에 고정 할 수 있습니다 해부. 4의 그림야생형 (CD1) 배아에서 E16 LG에서 4 세포 구획, 중간 엽, 상피 (는 EpCAM), 신경 (Tubb3)과 혈관 (PECAM)의 시각화 괜찮나.

그림 4
그림 4. LG는 상피 세포, 신경 세포와 내피 세포를 포함한 여러 종류의 세포로 구성되어있다. E16 LG는 상피 세포 (는 EpCAM, 녹색), 뉴런 (Tubb3, 빨간색)과 내피 세포 (PECAM, 시안)에 대한 면역 염색 하였다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

갓 해부 조직의 경우는 고정 및 후속 처리를 위해 선을 고정하기 위해, 문화에 대해 수행 첫째, 라미닌에서 LG를 포함하는 것이 더 쉽습니다. 5 개략적를 보여줍니다출생 / 성인 LG의 해부합니다.

그림 5
산후 성인 마우스에서 LG의 미세 절제하는 몇 가지 단계 그림 5. 회로도. 중 산후 또는 성인 마우스의 해부와 LG의 제거의 개략도. PAX6-Cre 호텔, GFP의 출생 후 하루 (30) 마우스는 LG 및 관련 덕트의 위치를 시각화하는 데 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

산후 / 성인 LG의 위치는 PAX6-Cre 호텔, GFP 마우스를 사용하여 시각화하고있다.

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Discussion

문화 다양성과는 LG 전 생체 내 개발 연구를위한 중요한 이점을 제공 조작 할 수 있습니다. 이는 연구자가 가설과, 신경, 및 mesencyhmal 내피 세포 기관을 형성하기 위해 상호 작용하는 방법 상피 평가하기 위해 수행 될 수있는 다수의 섭동을 테스트 할 수있는 속도를 포함한다. 이 모델을 이용할 때 그러나,주의의 수가 존재한다. 첫째, 격리 덕분에 선이 더 이상은 신경이나 혈관 (9, 10)에 의해 전달 신호와 함께 작업하는 경우 신호 전달 경로가 테스트되고 영향을 미칠 수있는 주변 혈관이나 신경 계통에 연결되지 않습니다. 둘째, 주변의 비 - LG LG 조직 개발 4 조절 인자를 제공 할 수있다. 이 아닌 다른 중간 엽 조직 구성 요소가 문화 이전에 제거해야합니다 방지하려면. 셋째, 현재 우리는 완전한 cytodifferent에 필요한 조건을 제공 할 수 없다완전한 기능의 조직으로 iation. 이는 생체 내 모든 장기 배양의 경우와 인해 기능적 혈관 및 신경 및 / 또는 주변 조직으로부터 기계적 힘의 부재를 포함한 여러 이유로 보인다. 이러한주의 사항에도 불구하고, 체외 문화에서 발견 메커니즘은 새로운 가설 8, 11을 테스트하기 위해이에게 강력한 시스템을 만들고, 생체 내 실험에서 다음에 효과적으로 요약 할 수 보여 주었다.

이것은 생체 외 배양 시스템은 또한 장기 재생 (12)을 연구하기 위해 이용 될 수 있음을 나타내는, 발달 및 재생 경로가 크게 중첩 것으로 밝혀졌다. 우리, 다른 사람들이, 이전에 도시 한 여기 양태를 증명되지 않았지만 배아 침샘는 장기 손상 및 재생 (13)에 방사선 치료 효과를 모델링하는데 사용될 수있다. 향후 연구로 LG 생체 시스템의 사용을 탐구하는 데 필요한조직 재생을위한 모델.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 UCSF 자원 할당 프로그램이 제공하는 자금을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 without HEPES SH3027101 Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin P0781 Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum A9576 Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution 15710 Electron Microscopy Sciences Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x BP665-1 Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine T1283 Sigma-Aldrich 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C) A4544 Sigma-Aldrich 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes 130182 Thermo Scientific Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator Stemi 2000 Carl Zeiss Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope TLB 4000 Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes 353001 Corning Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes P50G-1.5-14-F MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope Axio Observer Z1 Carl Zeiss Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) 17-305X Integra LifeSciences Corporation Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) 91150-20 Fine Science Tools (USA), Inc. Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. 4-30 Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 4-310 Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit AM1931 Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I 3446-005-01 Trevigen 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice Charles River Labs Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm 110405 Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr The Jackson Laboratory Optional mice for learning how to locate the LG.

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References

  1. Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
  2. Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
  3. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
  4. Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
  5. Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
  6. Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
  7. Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
  8. Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
  9. Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
  10. Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
  11. Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
  12. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
  13. Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).

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