Het manipuleren van de muizen traanklier

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De traanklier (LG) is een vertakking orgaan dat de waterige componenten van tranen nodig produceert voor het behoud van de visie en de gezondheid van het oog. Hier beschrijven we muizen LG dissectie en ex vivo cultuur technieken te ontcijferen signaalwegen betrokken bij LG ontwikkeling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Finley, J. K., Farmer, D., Emmerson, E., Cruz Pacheco, N., Knox, S. M. Manipulating the Murine Lacrimal Gland. J. Vis. Exp. (93), e51970, doi:10.3791/51970 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De traanklier (LG) scheidt waterige tranen noodzakelijk voor het behoud van de structuur en functie van het hoornvlies, een transparante weefsel essentieel zicht. In de menselijke bevindt één LG in de baan boven het laterale uiteinde van elk oog leveren tranen aan het oogoppervlak via 3-5 kanalen. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de exorbital traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor. Vergelijkbaar met andere glandulaire organen, LG ontstaat door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin één epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van knop en kanaal vorming een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en kanalen vormen. Dit ingewikkelde proces is goed gedocumenteerd in vele andere epitheliale organen zoals de pancreas en speekselklieren. Echter, heeft de LG veel minder bestudeerde geweest en de mechanismen die de morfogenese slecht onderstond. We vermoeden dat deze ondervertegenwoordiging als modelsysteem is een gevolg van de moeilijkheden die gepaard gaan met het vinden, ontleden en het kweken van de LG. Zo beschrijven we hier dissectie technieken voor het oogsten embryonale en postnatale LG en werkwijzen voor het ex vivo kweken van het weefsel.

Introduction

De traanklier (LG) is verantwoordelijk voor waterige traan secretie van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en de gezondheid, het onderhoud en de bescherming van de cellen van het oogoppervlak. LG disfunctie leidt tot een van de meest voorkomende en invaliderende oogaandoeningen: waterige deficiënte droge ogen ziekte, die wordt gekenmerkt door oculaire, lichtgevoeligheid en verminderd zicht 1. In de mens woont de LG in de baan boven de laterale einde van het oog, waar 3-5 afvoergangen aanbetaling tranen op het oogoppervlak. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor (exorbital) met scheuren die naar het oog via één kanaal excretie. Net als bij andere glandulaire organen, de LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin een enkel epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van bud en duct formatie voorm een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en leidingen (figuur 1) 2. Tijdens de ontwikkeling epitheel wordt gevasculariseerd en zwaar geïnnerveerd door parasympathische zenuwen van de pterygopalatine ganglion en in mindere mate van sympathische zenuwen van de superieure cervicale ganglion 3. Interacties tussen deze celtypen namelijk neuronale, epitheliale, endotheliale en mesenchymale cellen zijn essentieel voor de werking en het onderhoud van de volwassen weefsel. De onderliggende moleculaire mechanismen coördinatie LG ontwikkeling en regeneratie en hoe soort inter-cel leidt deze processen blijft onduidelijk.

De komst van embryonale ex vivo cultuur technieken heeft het mogelijk gemaakt de identificatie van de ontwikkeling en regeneratie van trajecten in meerdere vertakkingen organen 4. Kweken ex vivo geeft de onderzoeker de mogelijkheid om het orgaan te manipuleren (menische, genetische of chemische) onder gedefinieerde condities alsmede orgaanontwikkeling en cel-cel interacties te karakteriseren in real time. De exorbital LG van de muis is zeer vatbaar voor deze techniek en recente studies hebben gedefinieerd signaleringssystemen dat zijn ontwikkeling 2,5 reguleren. Ondanks de noodzaak van moleculaire signalen onderbouwing LG ontwikkeling en regeneratie begrijpen is nog steeds weinig bestudeerd waarschijnlijk door de technische problemen bij het isoleren van het orgaan. In dit artikel beschrijven we hoe te isoleren en uit te voeren ex vivo cultuur van de embryonale muizen LG om ontwikkelingsprogramma's te definiëren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd onder strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Californië, San Francisco.

1. muis embryonale traanklieren (LG): Oogsten en Microdissection

  1. Volgende procedures door de Institutional Dieren voor Wetenschappelijk Onderzoek ethische commissie goedgekeurd, euthanaseren getimed zwanger CD-1 (of transgene) vrouwen met de stijgende CO 2 inademing, gevolgd door bevestiging door cervicale dislocatie te oogsten embryo's op de juiste embryonale dag. Wijzen de dag van vaginale plug ontdekking e0.
    Opmerking: traanklieren (LGS) kunnen worden geoogst uit de e14 enkele knopstadium vanaf. Echter, E16 (5-10 knoppen) embryo's geven de meest consistente resultaten voor ex vivo cultuur.
  2. Steriliseer de ventral zijkant van de muis met behulp van 70% ethanol. Knijp de huid en maken een incisie op de middenlijn met steriele chirurgische schaar; snijden door de huid en het buikvlies de buikholte bloot. Verwijder de 2 baarmoederhoorns door snijden langs de mesometrium bovenaan elke baarmoeder hoorn en plaats in koude PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) of DMEM F12 medium aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
  3. Met behulp van een tang (# 5), verwijder embryo's uit het vruchtwater zakken en plaats in een tweede steriele petrischaal met koude PBS. Wees voorzichtig om de ogen of het hoofd niet aanraken.
  4. Plaats embryo op een dissectie microscoop met een transillumination basis. 1.7 - Als het embryo is <e17, stappen 1.5 uit te voeren. Als embryo's> e17, deze stappen kan nuttig zijn, maar zijn niet essentieel, dus ga verder met stap 1.8.
  5. Scheidt de kop van de romp net onder de onderkaak (stap 1, figuur 2) usinga steriel scalpel (# 10 blade). Draai het hoofd zodat de onderkaak is nu op het ontleden plaat. Tang om de kop en een scalpel ongeveer ¼ van de dorsale zijde van de hersenen (stap 2, 1 st gesneden, figuur 2) verwijderen stabiliseren - dit is vooral belangrijk wanneer kraakbeen verstijft rond e15.
  6. Richt het hoofd zodat de scalpel kan doorboren de neus tussen de ogen. Voeg een snede door het midden van de kop, zodat de ogen nu afzonderlijke helften (stap 2, 2e gesneden, figuur 2).
  7. Met behulp van twee # 5 tang, neem de ene helft van de kop en verwijder de overtollige weefsel (zie stap 3, figuur 2). Zorg ervoor dat u het hoofd te oriënteren, zodat de LG (in de onderste achterste hoek van het oog) niet verloren gaat in deze verwijdering proces. Verwijder overtollig cerebrale, kraakbeen, en nasale weefsel rondom en onder het oog. Omdat de klier is nauwelijks zichtbaar op dit moment zorgen oog goed georiënteerd na overtollige weefsel verwijdering to voorkomen dat de locatie van de LG.
  8. Pak de huid tegen de achterste, onderste hoek van het oog met beide pincet voorzichtig. Verwijder de huid door het voorzichtig geopend te trekken met de tang om de LG bloot. Gebruik extra verlichting boven en onder het weefsel te visualiseren LG.
    Opmerking: De LG, onderscheiden door zijn uiterlijk als een knop op een kanaal in een donkere, gecondenseerde mesenchym, zichtbaar zijn op dit punt.
  9. Beginnen zorgvuldig te ontleden de LG en bijbehorende mesenchym (zie diagram en afbeeldingen) uit de buurt van het omringende weefsel met behulp van een tang, zorg dat u de LG of daarmee samenhangende duct niet te grijpen. Zodra de klier vrij is van het omringende weefsel, verwijder voorzichtig de gehele klier door grijpen de epithelia rondom het oog bij de basis van de LG kanaal. Zorg ervoor dat de omringende mesenchym het epitheel, die kan worden waargenomen als een gecondenseerd mesenchym waarin het epitheel invaginates behouden.
    OPMERKING: Sommige extra verwijdering van tissue (elke kleine botfragmenten, spieren en bindweefsel), kan het nodig zijn om te voorkomen dat de signalering / groeifactoren uit omliggende weefsel.
  10. Voor cultuur, oogst 4-5 klieren en bijbehorende mesenchym per plaat (LGS zijn bedekt direct na dissectie); verzamelen minimaal 14 klieren per 100 pl RNA lysisbuffer voor RT-PCR 6.

2. Bereid Platen voor Ex vivo Cultuur

Deze procedure is gebaseerd op die gebruikt voor de ontwikkeling speekselklier 7,8.

  1. Voeg 200 ul DMEM F12 (gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) kweekmedium met 50 ug / ml ascorbinezuur en 50 ug / ml holo-transferrine een glazen bodem 50 mm diameter microwell schotel 7.
    Opmerking: DMEM F12 werd gekozen als we eerder vond het morfogenese in de embryonale speekselklier te maximaliseren.
  2. Float a 13 mm polycarbonate membraan filter met 0,1 urn poriën bovenop media.
  3. Optionele stap: Verdun 3-D laminine 1: 1 met DMEM / F12 tot een uiteindelijke concentratie van 3 mg / ml te maken (gebruik 200 ul pipet zachtjes mengen, centrifugeer gedurende 1 minuut als belletjes). Voeg 15 ul van de verdunde 3-D laminine te filteren.
    Opmerking: Deze verdunning werd gevonden optimaal voor het handhaven van LG in de 3D toestand zonder dat epitheliale vertakking te zijn. Het is echter niet essentieel voor de kweek van LG.
  4. Plaats 4-5 LG op filter of in laminin. Cultuur LGS ex vivo voor 24 - 48 uur (figuur 3) of fixeren met 4% PFA gedurende 20 min voor verdere analyse door qPCR of immunokleuring (figuur 4). Voor qPCR analyse van embryonale klierweefsel, verwijzen wij u naar Rebustini et al., 2011. Voor immunofluorescent analyse van embryonale klierweefsels verwijzen wij u naar de volgende citaten: Hoffman et al, (2002) en Steinberg e.t al., (2005).

3. Mouse Postnatale en Adult traanklieren (LG): Dissection

  1. Euthanaseren de postnatale muis volgens de normen geschikte dier ethische commissie. Voor postnatale pups dag 8 of jonger, euthanaseren door doorsnijden van het hoofd met een steriele schaar. Voor postnatale dag 8 of ouder, spuit bont met 70% ethanol.
  2. Om de LG lokaliseren, leg de muis zijkant onder een dissectie microscoop met verlichting van boven. Opmerking: De postnatale en volwassen LG worden begrensd door de halsslagader, de kauwspieren en de dermis (zie figuur 5).
  3. Met behulp van kleine dissectie schaar, maak kleine incisie in de epidermis zijdelings waar de LG moet worden geplaatst.
  4. Met behulp van een tang, trek open de epidermis in de richting van het oor naar de LG bloot.
  5. Gebruik een tang om voorzichtig los LG van het omringende weefsel.
  6. Zodra de LG is vrijgelaten uit het omringende weefsel, verwijder voorzichtig de LG door het kanaal,door grijpen wanneer het kanaal en de epithelia rond het oog aansluiten (figuur 1).
  7. Plaats LGS in RNA lysebuffer voor RT-PCR, of fix met 4% PFA gedurende 20 min voor immunostaining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese. Helderveld beelden van embryonale LGs ontleed bij e14, e15, e16, e17, en P2 illustreren dit evenement.

Figuur 1
Figuur 1. De LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese. Helderveld beelden van embryonale LGs vers ontleed bij e14, e15, e16, e17 en P2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Merk op dat als het epitheel groter wordt, de hoeveelheid mesenchym afneemt. De experimentele stappen voor microdissectie van de embryonale LGS zijn weergegeven in figuur 2.


Figuur 2. Schematische voorstelling van de stappen die betrokken zijn bij LG microdissection van muis embryo's. Schematische weergave van de dissectie en verwijdering van de LG uit de embryonale muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Voor LG cultuur die we eerder gebruik maken van E16 embryo's te wijten aan de consistentie in ex vivo groei. Zoals getoond in figuur 3, LG in ex vivo kweekcondities te ontwikkelen op een soortgelijke wijze als de in vivo klier (vergelijk figuur 1).

Figuur 3
Figuur 3. Exvivo kweken van e16 LGS recapituleert in vivo morfogenese. e16 LGS werden afgeleid van Pax6-Cre, GFP embryo, waar GFP wordt uitgedrukt door het epitheel. Opeenvolgende fluorescerende beelden werden genomen van deze single klier op 0, 3, 6, 12, 24, en 48 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Hier tewerkgesteld we Pax6-Cre, GFP (ook wel Le-Cre 5) embryo's tot epitheelcellen markeren, waardoor we opeenvolgende fluorescerende beelden van de vertakking epitheel te nemen over de 48 uur oude kweek periode. Muizen die het Pax6-Cre, GFP transgen te verkrijgen bij JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr maar zijn niet noodzakelijk klier dissectie en cultuur.

Culturen of vers ontleed LG kan dan worden voor immunofluorescent analyse bevestigd. Figuur 4 shows de visualisatie van 4 cellulaire compartimenten, mesenchym, epitheel (EpCAM), zenuwen (Tubb3) en bloedvaten (PECAM), in een e16 LG een wildtype (CD1) embryo.

Figuur 4
Figuur 4. De LG bestaat uit meerdere celtypen waaronder epitheelcellen, neuronale en endotheelcellen. E16 LG werd immunostained voor epitheelcellen (EpCAM, groen), neuronen (Tubb3, rood) en endotheelcellen (PECAM, cyaan). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Voor vers ontleed weefsel is het makkelijker om eerst te bedden in de LG laminine, zoals voor cultuur, zodat de wartel voor fixatie en daaropvolgende behandeling immobiliseren. Figuur 5 toont een schematischevoor dissectie van de postnatale / volwassene LG.

Figuur 5
Figuur 5. Schematische van stappen van LG microdissectie van postnatale en volwassen muis. Schematische weergave van de ontleding en verwijdering van LG van ofwel postnatale of volwassen muis. Een Pax6-Cre, GFP postnatale dag 30 muis werd gebruikt om de positie van de LG en bijbehorende kanaal te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De positie van de postnatale / volwassene LG is gevisualiseerd met behulp van de Pax6-Cre, GFP muis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De veelzijdigheid aan cultuur en manipuleren van de LG ex vivo biedt aanzienlijke voordelen voor het bestuderen van de ontwikkeling ervan. Dit omvat de snelheid waarmee de onderzoeker kan hypothesen en de veelheid van storingen die kunnen worden uitgevoerd om te beoordelen hoe epitheliale, neuronale, endotheliale cellen en mesencyhmal samenwerken om het orgaan te vormen testen. Er zijn echter een aantal restricties bij gebruik van dit model. Eerst op grond van de isolatie de klier is niet langer verbonden met de perifere vasculatuur of het zenuwstelsel, die van invloed kunnen de signaalwegen te testen of ze werken samen met signalen van de zenuwen of bloedvaten 9,10 afgeleverd. Ten tweede kan het omringende niet-LG weefsels factoren LG ontwikkeling 4 reguleren verschaffen. Om te voorkomen dat dit andere niet-mesenchymale weefsel componenten moeten voorafgaand aan cultuur worden verwijderd. Ten derde, op dit moment zijn we niet in staat om de voorwaarden te scheppen die nodig zijn voor de volledige cytodifferentiation in een volledig functioneel weefsel. Dit geldt voor alle organen gekweekt ex vivo en is waarschijnlijk te wijten aan verschillende redenen, waaronder de afwezigheid van functionele bloedvaten en zenuwen en / of mechanische krachten van de omringende weefsels. Ondanks deze kanttekeningen, hebben mechanismen ontdekt in ex vivo cultuur getoond worden samengevat in de volgende in vivo experimenten, waardoor dit een robuust systeem voor het testen van nieuwe hypotheses 8,11.

Het is aangetoond dat ontwikkeling en regeneratie paden aanzienlijk overlappen, wat aangeeft dat de ex vivo kweeksysteem kan ook worden gebruikt om orgaanregeneratie 12 bestuderen. Hoewel er is aangetoond dit aspect hier wij en anderen hebben eerder aangetoond embryonale speekselklier kan worden gebruikt om de effecten van therapeutische straling op orgaanschade en regeneratie 13 te modelleren. Toekomstige studies zijn nodig om het gebruik van de LG ex vivo systeem verkenneneen model voor weefselregeneratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag verstrekt door de UCSF Resource Allocation Program financiering erkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 without HEPES SH3027101 Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin P0781 Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum A9576 Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution 15710 Electron Microscopy Sciences Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x BP665-1 Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine T1283 Sigma-Aldrich 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C) A4544 Sigma-Aldrich 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes 130182 Thermo Scientific Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator Stemi 2000 Carl Zeiss Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope TLB 4000 Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes 353001 Corning Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes P50G-1.5-14-F MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope Axio Observer Z1 Carl Zeiss Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope TCS SP5 Leica Microsystems Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) 17-305X Integra LifeSciences Corporation Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) 91150-20 Fine Science Tools (USA), Inc. Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. 4-30 Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 4-310 Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit AM1931 Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I 3446-005-01 Trevigen 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice Charles River Labs Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm 110405 Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr The Jackson Laboratory Optional mice for learning how to locate the LG.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
  2. Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
  3. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
  4. Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
  5. Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
  6. Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
  7. Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
  8. Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
  9. Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
  10. Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
  11. Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
  12. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
  13. Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics