이미징 세포 내 칼슘
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

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Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

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Abstract

Introduction

성상 세포는 뇌의 유비쿼터스와 풍부한 신경 교세포 있습니다. 그것은 잘 성상 세포가 중요한 지원 및 세포 외 공간에서의 K + 농도의 버퍼링, 흡수 신경 전달 물질의를 제공 할뿐만 아니라 영양소를 포함 항상성 역할을 역할을한다는 설정됩니다. 그러나, 최근의 연구들은 또한 자연적으로 발생하여 신경 세포의 활동을 1 증가 [칼슘] 내가 신호를 표시하는 것을 알 수있다. 성상 세포의 존재는 [칼슘 2+] I 시그널링 점점 뉴런과의 통신을 유발하는 것으로 생각되고 있으며, 이와 같이 성상 내의 "칼슘 흥분성"의 형태로 해석되었다. 지난 20 년 동안 사용할 수있는 데이터는 성상 세포와 신경 세포는 아마도 양방향 방식으로 통신 할 수있는 두 가지 설정을 제안한다. 첫째, 성상 세포는 종종 내가 신경 전달 물질에 의해 활성화 [칼슘]의 증가로 응답신경이 해제 신경 조절. 둘째, [칼슘 2 +] 성상 세포 내에서 내가 증가는 다시 신경과 혈관에 영향을 미칠 수있는 성상 세포에서 신호 전달 분자의 방출을 야기한다. 증거는 성상 세포에서 방출 분자가 성상 세포 간 신경 신호를 통해 ​​시냅스 회로와 궁극적으로 행동 3-5의 기능의 변화로 이어질 것이 좋습니다. 그러나이 급속히 발전 연구 분야 남아 있고, 이는 성상 세포의 더 상세한 이해는 [칼슘 2+] I는 현재의 불확실성 (6)의 일부를 해결하기 위해 필요하다고 주장하고있다.

과거의 연구에서,이 성상 세포에 유기 칼슘 지표 염료의 대량로드가 확실하게 감지하지 못하는 것을 증명했다 [칼슘 2 +] 문화 및 현장 7-10에서 전체 성상 세포 내에서 내가 신호. 이러한 연구 결과는 우리와 다른 사람 6,11,12에 의해 논의되었다. emerginG 사진은 [칼슘 2 +] 나는 신경과 혈관과의 상호 작용에 대한 기본 사이트입니다 성상 세포 프로세스 (예를 들면, 지점 및 branchlets) 내에서 신호를 거의 자세히 살펴되어 있지 않은 것입니다. 최근에는 세포질 GCaMP3, GCaMP5G 및 GCaMP6 및 세포막과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 사용이 닿는 버전 (예를 들어, Lck에-GCaMP3)는 성상 세포 등의 작은 구획에 [칼슘] 내가 신호의 연구를 허용하고있다 얇은 프로세스, 세포막 근처 전체 지역 7,8 내. 그러나 GECIs 유기 칼슘 2 + 지표 염료를 통해 한 가지 단점을 가지고 GECIs 적절하게 할 표현하는 유전 적 방법은 주 단위로 생체 내에서 성상 세포에 선택적으로 인코딩 유전자를 전달하기 위해 그 요구 사항입니다. 생체 내에서 발현은 일반적으로 노크에 쥐 또는 바이러스를 기반으로 배달 응용 프로그램과 함께, 형질 전환 마우스를 사용하여 달성된다바퀴벌레. 본 조브 기사에서 우리는 아데노 - 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상 세포에 GECIs을 제공하기 위해 사용되는 방법과 절차를보고합니다. 우리는 예를 들어 사이토-GCaMP3에 초점을 동일한 기본 절차는 다른 GECI 또는 형광 단백질 기반 기자 모든 작동합니다.

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Protocol

모든 동물 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 미국 국립 연구소에 따라이었고, UCLA에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1.1) 마이크로 피펫 및 AAV2 / 5 바이러스로드 준비

  1. 바이러스의 주입을위한 좋은 붕규산 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 수직 풀러와 두 단계 당기는 프로그램을 사용하여 마이크로 피펫을 당깁니다. 베벨 피펫 분쇄기를 이용하여 40 °의 각도로 피펫. 40 μm의 6 생크 길이 - - 7 MM 사용하기에 이상적이다 피펫 (20)의 팁 직경을 가질 것이다. 피펫 및 수술 도구를 압력솥. 드릴을 70 % 에탄올로 닦아 소독한다.
  2. 10 μL 씩에 -80 ° C에서 바이러스 AAV2 / 5 GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 × 10 13 GC / ㎖)을 저장합니다. 그냥 수술 전, 냉동실에서 분주을 꺼내 번째를 채우기 사용까지 얼음에 저장전자 마이크로 피펫.
  3. 바이러스가 시린지 펌프를 이용하여 함께 마이크로 피펫을 채운다. 단단히 강화 플런저 유리 주사기, 피팅 적절한 크기의 튜브 압축을 통해 튜브, 조각의 한쪽 끝을 연결합니다. 맞는 적절한 크기의 이동식 바늘 압축을 통해 튜브의 조각의 다른 쪽 끝으로 멸균 마이크로 피펫을 연결합니다.
  4. 바이러스 벡터를 넣기 전에, 바늘 1ml의 주사기 수단 적색 IV (~ 1 ㎎ / 50ml)로 컬러 미네랄 오일 시스템 (27 G를 충전함으로써 튜브, 주사기 및 마이크로 피펫을 포함한 배기계로부터 공기 방울을 제거 ).
  5. 유리 마이크로 피펫에서 파라 필름의 깨끗한 부분을 놓고 5 분배 - 파라 필름에 바이러스 벡터의 10 μl를.
  6. 역방향 0.5 μL / 분으로 주사기의 플런저를 이동시킴으로써 바이러스 벡터를 빨아 및 유리 피펫에 벡터 및 오일 사이의 경계를 표시한다.

1.2) 마취, 머리 자르기, H개두술에 대한 EAD 고정 및 준비

  1. N 2 O 및 O 2, 5 % 이소 플루 란 채워진 챔버 내로 마우스 (P49-63, C57BL / 6)을 넣어. 목적이있는 운동의 손실 둔화 호흡 (- 90 / 분 ~ 60)에 의해 마취의 깊이를 평가한다. 마우스를 마취 할 때 머리에 머리를 잘라.
  2. 머리가 마취 및 환기 시스템에 배치 무딘 귀 바, 코에 의해 확보와 함께, 정위 프레임에 마우스를 맞 춥니 다. 2-3%에서 연속 이소 플루 란을 유지한다. 마우스가 마취하에 자신의 깜빡임을 잃게하기 때문에 두 눈에 인공 눈물 연고를 적용합니다.
  3. 통증 완화를위한 피하 주사에 의해 프레 놀핀 (0.1 ㎎ / ㎖)의 0.05 mL로 관리 할 수​​ 있습니다.
  4. 10 % 포비돈 요오드 및 70 % 알코올로 3 회 면도 외과 영역, 두 용액 사이에서 교호 포비돈 요오드로 시작. 전면에서 시작하고 이미 잘라 머리카락을 제거하기 위해 뒤쪽으로 닦습니다.
  5. 상단 O에 피부 절개를눈 사이에 시작하고 귀 사이에 끝나는 머리 F.

1.3) 개두술 Microinjections

  1. 면봉으로 쓸어 넘겨 골막을 분리 한 다음 치과 면봉과 두개골의 표면을 건조. 주사 부위 주위에 마크를 만들고, 고속 드릴에 의해 구동 소형 강철 버어를 사용하여 마크의 에지 주위 드릴.
  2. 뼈를 제거하고 식염수로 표면을 청소합니다.
  3. 전후방 0.8, 내측 - 외측 : 다음 좌표 (mm)과 선조체 (striatum) 측면 왼쪽 지느러미에 피펫을 놓고 +2.0, 지느러미 - 복부를 pial 표면 : -2.4 (13). 이 좌표는 미세 주사 바늘의 끝이 약간이 핵 내에 침투 즉, 단지 배 외측 선조체 (그림 1A, B) 위에 앉아 있다는 것을 의미합니다. 손상 혈관을 피하십시오. 피펫은 혈관에 바로 될 일이있는 경우, 버스를 조정0.2 mm - 0.1 ~에 의해 조정합니다.
  4. 0.2 μL / 분으로 설정 주입 속도로 주입을 시작하고 일반적으로 바이러스의 1-1.5 μl를 주입.
  5. 10 분 동안 주입 한 후 장소에 피펫을두고 천천히 피펫을 철회.
  6. 연속 봉합 외부 나일론 봉합 수술 상처를 닫아 마칩니다.

1.4) 복구

  1. 24 시간 동안 가열 패드에 깨끗한 케이지에 마우스를 넣습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 마우스를 반환하지 않습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
  2. 트리 메소 프림 Sulfamethoxiazole 추가 일주일 동안 물 (40 mg을 트리 메소 프림과 200 mg을 sulfamethoxiazole이 포함 된 500 ml의 물에 5 ml의). 수술 후 프레 놀핀에게 최대 3 일 동안 하루에 두 번 관리합니다.
  3. , 먹이 12 시간 명암주기에 마우스를 유지하고 매일 물을차 수술 후 3 일에 한 번 일까지 당 가중된다. 이 3 일 동안, 10 % 이상의 체중 감량과 함께 임의의 마우스는 손실, 대신 실험 실시되는 안락사 될 것으로 간주된다.
  4. 별도로, 일주일에 두 번 마우스 케이지를 변경하고, 적어도 하루에 한 번 건강을 모니터링. 정위 microinjections 후 3 주 - 일반적으로 마우스는 2 내에서 사용된다.

공 초점 칼슘 이미징 2. 급성 뇌 조각 준비

절단 및 녹화 솔루션 2.1) 준비.

  1. (MM)을 포함하는 용액을 절단 준비 : 194 크로즈, 30의 NaCl, 4.5 KCl을 10 D 글루코스, 하나의 MgCl 2, 1.2의 NaH 2 PO 4, 95 % O 2 및 5 % CO 2로 포화 된 26의 NaHCO3를.
  2. 포함하는 기록 용액 (mM)을 준비한다 (124)의 NaCl, 4.5 KCl을, 하나의 MgCl 2, D-10 글루코스,이 CaCl2를 1.2의 NaH 2 PO 4 NaHCO3; pH가 7.3-7.4을, 290 - 95 % O 2 및 5 % CO 2로 포화 295 mOsm. 레코딩 솔루션과 뇌 조각을 들고 비커를 입력하고 34 ℃에서 보관하십시오.

2.2) 슬라이스

  1. 2-3 주 정위 microinjections 후, 깊이와 끝으로 마우스를 마취 한 다음 목을 벨.
  2. 뇌를 추출하고, uninjected 우반구를 제거하는 블레이드를 사용하고, 강력 접착제를 사용하여 vibratome 트레이에 왼쪽을 탑재합니다. 차가운 얼음 절단 버퍼와 vibratome 트레이를 입력하고 95 % O 2 5 % CO 2로 포화 유지.
  3. 300 μm의 두께로 관상 또는 시상 선조체의 뇌 조각을 잘라. 일반적으로, 4-5 관상, 또는 6-7 시상 선조체 슬라이스는 수집 할 수 있습니다.
  4. 34 ° C에서 따뜻하게 슬라이스 잡고 비커에 조각을 이동하고, 이후 recordi 실온에서 그들을 저장하기 전에 30 분 동안 그들을 거기 유지NG.
  5. [칼슘] 난 촬상 전에 적어도 30 분 동안 실온에서 산화 된 기록 버퍼에서 뇌 조각 부화.

3. 면역 조직 화학 (IHC)

  1. 두 주 바이러스 주사 후, PBS로 transcardially 가진 마우스 PBS에서 10 % 포르말린 관류 하였다.
  2. 제거 하룻밤 후 수정, 적어도 2 일 동안 버퍼링 30 % 자당의 뇌를 cryoprotect.
  3. 그라 이오 스탯 마이크로톰을 사용하여 40 μm의 섹션을 준비합니다.
  4. 10 분 간격으로 섹션을 PBS로 3 회 헹군다.
  5. 10 % 정상 염소 혈청과 PBS에서 1 시간 동안 0.5 % 트리톤 X-100으로 섹션을 품어.
  6. 0.5 % 트리톤 X-100와 PBS에서 준비 차 항체로 4 ℃에서 하룻밤 섹션을 품어. 다음과 같이 사용되는 일차 항체이었다 : 닭 항 GFP 1 : 1,000, 마우스 항 S100β 1 : 400, 마우스 항 NeuN 1 : 600, 마우스 항 글루타민 신테 1 : 300.
  7. 10m에서 섹션을 PBS로 3 회 씻어간격.
  8. 실온에서 2 시간 동안 10 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 제조 된 이차 항체 섹션을 인큐베이션. 다음 두 번째 항체는 같았다 : 염소 항 - 마우스 Alexa546 1 : 500, 염소 항 - 닭 Alexa488 1 : 500.
  9. 천천히 유리 커버 슬립과 섹션을 포함, 건조 유리 슬라이드에 섹션을 마운트하고 antifade 설치 매체의 몇 방울을 적용합니다. 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
  10. 1.3의 개구와 40X 기름 침지 렌즈와 공 초점 현미경에서 이미지를 가져 가라.

4. 공 초점 [칼슘 2 +] 나는 영상

참고 : [칼슘 2 +] 나는 0.8의 개구와 40 배 침수 대물 렌즈와 공 초점 현미경을 사용하여 수행되었다 이미징.

  1. 1 ㎖ 당 2 - 시간 1 ~ 5의 기록 챔버 내에서, 도시 슬라이스 및 슬라이스 (1)의 유량을 갖는 실온에서 산소 기록 버퍼와 superfuse 후분. 그 후 실험 기간 동안 움직임을 최소화하기 위해 슬라이스 위에 나일론 문자열 백금 하프 배치.
  2. 시각화 및 10 배 침수 목적에서 밝은 필드 발광과 등쪽 선조체 (striatum)를 찾습니다.
  3. 40 배 침수 대물 렌즈로 전환 한 아르곤 레이저의 488 nm의 라인을 켭니다. 초점면을 변경, 소마, 지점과 branchlets의 기초 형광 표시, 약 20 μm의 슬라이스 표면 아래에있는 세포를 찾을 수 있습니다. 참고로, 손상된 세포는 일반적으로 피해야한다 평균 이상 형광 수준을 표시합니다.
  4. 스캔을 시작하는 '프레임 스캔'모드를 사용합니다. 통상적으로, 0.5로 조정 한 레이저 강도 - 최대 출력의 5 % [칼슘] 사이토-GCaMP3 가진 이미지에 충분하다. 성상 세포의 전체 영역에 [칼슘 2 +] 나는 역학을 모니터링하기위한 프레임 이상의 속도 당 1 초의 스캔 속도와 '프레임 스캔'추천!입니다nded하지만,이 문제의 실험에 따라 결정해야합니다.
  5. 보기의 전체 필드 2 성상 세포 - 1을 모니터 3 배 - 필요한 경우, 이미지에 [칼슘 2 +] 나는 과정에서, 2의 디지털 배율을 사용합니다.
  6. 녹화 중에 포화 픽셀을 방지하기 위해, 세포를 사색하는 '히로'조회 모드를 사용합니다. 항상 붉은 색은 채도의 표시로 나타나는 경우 테스트하기 위해, 약 5 분 동안 "파일럿 녹화"로 시작합니다. 이 경우, 레이저 출력을 낮추거나 PMT를 낮추고 / 이득 / 오프셋 값과 화소 값은 비 포화 영역에있는 테스트하는 다른 파일럿 기록을 수행한다. - 5 % (10 메가 와트), PMT 550-650 볼트, 게인 2.0 - 레이저 출력 전력 0.5 3.5 배, 0 오프셋 : 일반적으로 결합 된 매개 변수 영상 성상 세포에 사용 [칼슘] 선조체에서 나는 다음과 같습니다 - 5 %.

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Representative Results

줄무늬 체에서 사이토-GCaMP3의 성상 세포 특이 적 발현을 위해, 우리는 이전에 견고 GCaMP3 및 리포터 유전자를 구동하는 도시 된 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 5 혈청 형 및 GFAP GfaABC D 촉진제 (도 1A)를 사용 해마와 대뇌 피질의 성상 세포 8, 14의 식입니다. 2 주 마우스 선조체에 바이러스 미세 주입 한 후, 마우스 (~ 10 주)을 관류하고 IHC는 선조체 (그림 1B)의 사이토-GCaMP3 식을 평가하기 위해 얇은 뇌의 부분에서 수행되었다. 우리는 GFP 항체를 사용하여 사이토-GCaMP3을 감지도 알려진 성상 세포 마커, S100β와 조각 스테인드. 사이토-GCaMP3 표현은 S100β 양성 세포에서 발견되었다. 어떤 표현은 성상 세포 특이 적 발현을 제안, NeuN (그림 2A와 2B)와 시각 신경 세포에서 발견되지 않았다. 중요한 것은, 사이토 - GCaMP3 식 ~ S100β 양성 세포의 60 % (FI 검출되었다gure 2C).

성상 세포는 경증에서 중증 (15)에 대한 잠재적 인 변화의 스펙트럼을 나타내는 성상 세포 반응성으로 알려져 변경 사항을 표시하여 등 부상, 국소 빈혈과 감염으로 뇌 모욕에 응답합니다. 우리는 바이러스 미세 주입이 명백한 성상 세포의 반응성을 발생하는 경우 평가하기 위해 노력했다. 그것은 이전에 글루타민 합성 효소 (GS)의 감소 된 발현 수준이 반응성 성상 세포 16, 17과 관련이 것으로 나타났다. 따라서, WT 및 바이러스 주입 된 쥐들의 줄무늬 체에서 GS 발현을 비교 하​​였다. 의 기준으로 GS 수준을 사용하여 더 명백한 성상 세포의 반응성을 나타내는 없다 - 우리는 바이러스 주입 (C 그림 3A) 다음 선조체 성상 세포에서 GS 발현에 큰 변화를 찾을 수 없습니다. 이 일반적인 접근 방식은 반응성의 다른 마커를 사용하여 성상 세포의 반응성을 평가하기 위해 미래의 일을 확장 할 수 있습니다. 그러나, GFAP 수준이 striat의 반응성을 측정하는 적절한 방법이라고는 할 수없는 것에 유의알 성상 세포, GFAP는 기저 상태 (18)에서 대부분의 선조체의 성상 세포에서 검출 수준으로 발현되지 않기 때문에. 요약하면, IHC를 사용하여 우리는 사이토-GCaMP3 표현은 선조체 (striatum)에서 성상 세포에 강력하고 특이 결론 및 GS 발현 수준의 변화에​​ 의해 평가로 그 바이러스 주입은 성상 세포 반응을 유발하지 않았다.

우리는 다음 선조체의 성상에 [칼슘] 내가 이미지에 바이러스를 주입 쥐에서 급성 뇌 조각을 준비했다. 급성 300 μm 두께 시상 또는 관상 슬라이스 제조하고, 회복 기간 후에 슬라이스 [칼슘 2+] 내가 아르곤 레이저의 488nm의 라인을 이용하여 이미징하는 공 초점 현미경에 기록 챔버에 넣었다. (그들은 분명히 덤불 형태와 세포에서 보이는 녹색 형광을 보여 주었다으로 그림 4 - 사이토 - GCaMP3을 표현 선조체의 성상 세포는 쉽게 선조체 조각 (마우스 당 7 조각 6 ~)의 (일반적으로 모든) 대부분에서 확인 할 수있다 그림 4a에 도시된다 사이토-GCaMP3를 표시 적어도 10 성상 세포는 이미지를 만들 수 있으며, 관심 (ROI)의 지역으로도 4a에 그려집니다. 2.0의 추가 디지털 줌의 고배율 영상 - 3.0은 하나의 성상 세포 (그림 4B)를 식별 할 필요가 있었다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 이러한 상황에서는, 전체 성상 세포 영토가 사이토-GCaMP3 식에 의해 밝혀졌다. 자발적인 칼슘 신호 용이 세포체뿐만 아니라 분기 및 성상 세포 (6)의 branchlets 측정 하였다.

그림 1
그림 1 : 성인 마우스 선조체에 AAV2 / 5 GECIs의 바이러스 성 전달 (예 : 사이토 - GCaMP3). A. 회로도는 배 외측 선조체 (striatum)에 AAV2 / 5 microinjections에 대한 프로토콜을 보여줍니다.B.는 선조체 관련 마이크로 인젝션 니들 정위 주사에 사용되는 좌표의 대략적인 위치를 표시. 패널 B에서 Nissl 염색 조각의 이미지는 ALLEN 뇌 ATLAS에서 다운로드.

그림 2
그림 2 : 사이토 - GCaMP3 표현은 선조체의 성상 세포에 특정했다. . - 사이토 - GCaMP3식이 아닌 도시 된 것과 같은 colocalization을 실험을위한 신경 세포에 대한 마커 (NeuN) (A) C. 요약 막대 그래프와, 성상 세포 마커 (S100β) (B)와 colocalizes 보여주는 B. 대표 이미지 A와 B에.

그림 3
그림 3 : 선조체 성상 세포 내 사이토-GCaMP3식이 GS의 발현의 변화가 발생하지 않았다.- GCaMP3에 대한 AAV2 / 5를받은 쥐에서 GCaMP3과 GS IHC의 B. 대표 이미지. 제어 비 주입 쥐에 대한 이미지도 표시됩니다. C. 막대 그래프는 A와 B에있는 것과 같은 실험 결과를 요약 (NS가 짝이 학생의 T 테스트, P <0.05를 사용하여 상당한를 나타냅니다).

그림 4
그림 4 : 사이토 - GCaMP3와 선조체의 성상 세포에서 기록 [칼슘 2 +] 나는 신호의 대표적인 예. A. (1 번호 - 10) (10) 성상 세포를 보여주는 Z 스택 이미지 평평 국지적가 표시 아래에 추적을 [칼슘 2 +] 내가 신호가 평평 B.에 표시된 10 세포에서 5 ​​분 이상 기록되고 확대 된 Z. 단일 astrocyte.The에 대한 -stack 이미지가 표시 아래에 추적 [칼슘 2 +] I신호 B에 도시 한 셀에 대해 5 분 동안 기록 하였다.

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Discussion

여기에 설명 된 방법은 우리가 현장에서 후속 [칼슘 2 +] 나는 영상을 위해 생체 내에서 선조체의 성상 세포에서 사이토-GCaMP3을 표현 할 수있다. 이 방법은 형질 전환 또는 강력한 대상 단백질, 신속성의 표현과 실험적인 구현 및 해부학 적 특이성의 유연성을 포함 노크에서 마우스를 사용하여보다 이점이있다. AAV2 / 5 사용 GCaMP3의 발현은 구체적이고 강력한 것으로 밝혀졌다. AAV 혈청 형 5와 GFAP GfaABC D 촉진제 결합 특이성을 달성하기 위해 중요하다. 여기에 설명 된 기술의 한 가지 제한은 바이러스 감염 및 수술 절차가 특히 고역가 바이러스 19, 성상 세포 반응성을 초래할 수 있다는 것이다. 중요한 것은, 현재의 연구에서, 상대적으로 낮은 역가와 AAV2 / 5 microinjections은 성상 세포 반응성 (19)에 관련 지을 수 있던 GS의 감소가 발생하지 않았다. 유사 컨트롤은 HIPP보고되었다ocampal 성상 세포 (8). 그러나, 성상 세포가 이종 (20)이기 때문에, 이들은 가능성 뇌의 특정 영역에서 서로 다른 기능을 수행하기 때문에하지 적어도 공부 각 뇌 영역에 대한 이들 제어의 필요성을 강조하는 것이 중요하다.

바이러스 마이크로 인젝션을 사용하여 표적 유전자 발현의 안정성에 영향을 미칠 수있는 중요한 요소 중 하나는 상이한 마우스 균주 동물의 개발에 따른 변화 중에서 변한다 사용 좌표이다. 오래된 ~ 팔주 만 C57BL / 6 마​​우스는 본 연구에서 사용되었다. 4 주 주사를 게시하고 9개월에 대한 안정적으로 유지 주입 (21)를 게시 - 또한 쥐의 선조체 신경 세포와 성상 세포에서 GFP의 바이러스 성 표현, 4 일 후 주입을 감지 2 고원에 도달 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 사이토-GCaMP3 발현의 시간 경과에 정확하게 여기서 결정되지 않았지만, 바이러스 발현을위한 적어도 2 주 아르좋습니다.

선조체 성상 세포에서 GECIs의 AAV2 / 5 매개 발현을 이용하는 방식은 이제 더 [칼슘 2+] i는 선조체 시그널링 성상을 이해하는데 사용될 수있다. 특히, 사이토-GCaMP3 발현 수준은 성상 세포의 작은 개체군 [칼슘] 신호 (~ 10 세포)의 단일 성상 세포의 전체 지역 내의 촬상을 허용하기에 충분히 높다. [칼슘 2 +] 나는 신호의 상세한 분석은 여전히 진행되고 있지만, 현재까지 [칼슘 2 +] 나는 신호는 멀리 소마에서 50 μm의 (그림 4) ~과 같은 말초 프로세스에서 감지되고있다. 성상 세포 [칼슘 2 +] I 신호와 선조체 내에서의 상관 관계와 원인이 기능에 대한 자세한 실험이 가능하다. 향후, 세련된 접근 방법 (발기인은 IE) 성상 세포의 유전자 정의 인구에 GECIs을 제공하는 데 필요한 하나 할 수 있도록성상 세포 (20)의 다양한 인구 내에서 칼슘 신호를 탐구한다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

대부분의 작업과 관련된 인력은 NIH 보조금 NS060677에 의해 부분적으로 NIH가 MH099559과 (BSK에) MH10406​​9 부여에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 CHDI 재단에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

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