イメージング細胞内Ca
1Department of Physiology, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Neuroscience

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Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

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Abstract

Introduction

アストロサイトは、脳のユビキタスと豊富なグリア細胞である。これは、十分にアストロサイトが重要なサポートおよび細胞外空間におけるK +濃度のバッファリング、神経伝達物質の取り込みだけでなく、栄養素を提供することを含む恒常的な役割を果たしていることが確立されている。しかし、最近の研究では、それらはまた、自然に発生し、ニューロンの活動を1だけ増加された[Ca 2+] iの信号を表示することを示している。アストロサイトの存在は、の[Ca 2+] i シグナリングはますますニューロンとのコミュニケーションを誘発すると考えられてきた、そのようなものとして、アストロサイト内の「Ca 2+の興奮性」の形式として解釈されてきた。最後の20年間の利用可能なデータは、アストロサイトとニューロンは、おそらく、双方向の方法で、通信することが可能な2つの設定が示唆された。まず、アストロサイトは、多くの場合は[Ca 2+] iは神経伝達物質によって活性化されたときの増加に対応し、ニューロン2から放出された神経修飾物質。第二に、アストロサイト内の[Ca 2+] i 増加は、順番に、ニューロンおよび血管に影響を与える可能性アストロサイトからのシグナル伝達分子の放出を引き起こす。証拠は、神経膠星状細胞から放出された分子は、アストロサイトへの神経シグナリングを介してシナプス回路、最終的に行動3-5の機能に変化をもたらすことを示唆している。しかし、これは急速に発展して研究領域のままであり、それがより良いとアストロサイトの詳細な理解がの[Ca 2+] iは 、現在の不確定要素6のいくつかを解決するために必要であると主張されています。

過去の研究では、アストロサイトへの有機物のCa 2+指示色素のバルク·ロードを確実に、培養中および in situ 7-10 全体の星状細胞内の[Ca 2+] i 信号の検出に失敗したことが示された。これらの知見は、米国および他の6,11,12によって議論されてきた。 emergingの画像は、ニューロンおよび血管との相互作用のための主要な部位であるアストロサイトのプロセス内の[Ca 2+] iの信号( 例えば、枝や小枝)、ということで、めったに詳細に検討されていない。近年、細胞質ゾルGCaMP3などの遺伝的にコードされたカルシウム指示薬(GECIs)の使用は、GCaMP5GとGCaMP6とプラズマ膜テザーのバージョン( 例えば 、Lckは-GCaMP3)は、そのようなアストロサイトの小区画内の[Ca 2+] iの信号の研究が可能になった薄いプロセスなどの、原形質膜に近いと7,8全体の領土内である。しかし、GECIs有機のCa 2+指示色素上の1つの欠点があり、GECIsが適切であることに発現する遺伝的方法は、数週間の期間にわたって、インビボでの星状細胞に選択的にコード化遺伝子を送達することが要件である。 in vivoでの発現は、典型的にノックインマウスまたはウイルスベースの送達アプリで、トランスジェニックマウスを使用して達成されるゴキブリ。現在のJoveの記事では、アデノ随伴ウイルスを使用して、線条体アスト​​ロサイトにGECIsを配信するために用いられる方法と手順を報告します。ここでは、例として、CYTO-GCaMP3に焦点を当てるが、同じ基本的な手順は、他のGECIまたは蛍光タンパク質ベースのレポーターのために働く。

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Protocol

全ての動物プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの米国国立研究所に従ったとUCLAの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1.1)マイクロピペットおよびAAV2 / 5ウイルスの読み込みを準備

  1. ウイルスの注射のために細かいホウケイ酸ガラスマイクロピペットを使用してください。垂直プラーで二段階引っ張っプログラムを使用してマイクロピペットを引き出します。ベベルピペットグラインダーを用いて40°の角度でピペット。が40μmおよび6のシャンクの長さ - - 7mmでの使用に最適ですピペット20の先端径を持つことになります。ピペットや手術器具をオートクレーブ。ドリルは、70%エタノールで拭くことによって滅菌される。
  2. 10μlアリコートで-80℃でウイルスAAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40(1.5×10 13 GC / ml)を、保管してください。ちょうど手術の前に、冷凍庫から一定分量を取り出し、目に充填するために使用するまで氷上で保存する電子マイクロピペット。
  3. ウイルスは、シリンジポンプの使用にマイクロピペットを埋める。しっかりと補強されたプランジャーを有するガラスシリンジに、フィッティング、適切なサイズのチューブ圧縮により、チューブの一片の一端を接続します。フィッティング適切なサイズの取り外し可能なニードル圧縮によりチューブの一片の他端にオートクレーブ処理マイクロピペットを取り付けます。
  4. ウイルスベクターをロードする前に、針を用いて1mlシリンジでスダン赤IV(約1ミリグラム/ 50ml)で着色されたミネラルオイルシステム(27 Gを充填することにより、チューブ、注射器およびマイクロピペットを含むポンプシステムから気泡を除去する)。
  5. ガラスマイクロピペットの下にパラフィルムのきれいな作品を置き、5分注 - パラフィルム上にウイルスベクターを10μl。
  6. 後方を0.5μl/分でシリンジのプランジャを移動させることにより、ウイルスベクターを吸引し、ガラスピペット上のベクトルと油との間の境界をマークする。

1.2)麻酔、ヘアーカット、H開頭のためのEAD固定と準備

  1. N 2 OとO 2および5%イソフルランで満たされたチャンバー内にマウス(P49-63、C57BL / 6)を置く。意図的な運動の喪失と鈍化呼吸数( - 90 /分〜60)によって麻酔の深さを評価する。マウスを麻酔されたときに頭の上に髪を切った。
  2. その頭には麻酔および換気システムに置か鈍い耳バーおよびその鼻で固定して、定位フレームにマウスを合わせます。 2から3パーセントで連続イソフルランを維持する。マウスは麻酔下で彼らのまばたき反射を失うので、両眼に人工涙液軟膏を適用します。
  3. 疼痛緩和のための皮下注射によりブプレノルフィン(0.1 mg / mlで)を0.05mlを投与する。
  4. 二つの溶液間で交互にポビドンヨードを皮切りに、10%ポビドンヨードおよび70%アルコールで手術領域を清掃して三回。正面から起動し、すでにカット毛を除去するために戻って向かって拭いてください。
  5. トップO上の皮膚切開を作る耳の間の目と端部の間に開始され頭F。

1.3)開頭およびマイクロインジェクション

  1. 綿棒でスワイプして骨膜を削除してから歯科綿球で頭蓋骨の表面を乾燥させます。注射部位の周りにマークを作成し、高速ドリルを搭載し、小さなスチールバリを使用して、マークのエッジの周りにドリル。
  2. 骨を削除し、生理食塩水で表面を洗浄する。
  3. 前後0.8、内側-外側:2.0、背腹軟膜表面から:-2.4 13以下の座標(mm)の左背側線条体に横方向のピペットを置きます。これらの座標は、マイクロインジェクション針の先端は、それが少しだけ、この核内で浸透していることを意味し、ちょうど背外側線条体( 図1A、B)の上に座っていることを意味していることに注意してください。損傷血管を避けてください。ピペットが血管の上で右であることを起こる場合は、若干の調整0.2mmの - 〜0.1によって調整します。
  4. 0.2μL/分に設定注入速度で注入を開始し、一般的に、ウイルスの1〜1.5μlのを注入する。
  5. 10分間注入後に所定の位置にピペットを残し、その後、ゆっくりとピペットを撤回。
  6. 連続縫合外部ナイロン縫合糸で手術創を閉じて終了します。

1.4)回復

  1. 24時間加熱パッド上に清潔なケージにマウスを置く。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けたマウスを返さないでください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでマウス無人のまま放置しないでください。
  2. 週間水(40mgのトリメトプリムと200mgのsulfamethoxiazoleを含む水500mlあたり5ミリリットル、)トリメトプリムSulfamethoxiazoleを追加します。手術後最大3日間ブプレノルフィンを1日2回投与する。
  3. 供給され、毎日の水やり、12時間の明暗サイクルの上でマウスを維持、AND手術後3日目まで一日一回重み付けされる。これらの3日間で、10%以上の体重損失を持つマウスが侵害とみなされ、そして安楽死させる代わりに、実験に供される。
  4. これとは別に、1週間に2回、マウスのケージを変更し、1日あたり少なくとも1回、一般的な健康状態を監視する。定位微量注入後3週間 - 典型的には、マウスを2内で使用されている。

共焦点のCa 2+イメージング用2.急性脳スライスの準備

2.1)切削や録音溶液の調製を。

  1. (ミリモル)を含む溶液を切断する準備:194ショ糖、30のNaCl、4.5のKCl、10 D-グルコース、1のMgCl 2、1.2のNaH 2 PO 4、および95%O 2および5%CO 2で飽和し26のNaHCO 3、。
  2. (mm)を含む記録液を調製:124のNaCl、4.5のKCl、1のMgCl 2、10 D-グルコース、2のCaCl 2、1.2のNaH 2 PO 4 3; pHは7.3から7.4、290 - 95%O 2および5%CO 2で飽和さ295ミリオスモル。記録液の入ったビーカーを保持する脳スライスを記入し、34℃で保管してください。

2.2)スライス

  1. 深く末端定位微量注入後2〜3週間、マウスを麻酔し、それを首を切る。
  2. 脳を抽出して、非注射右半球を削除するには、ブレードを使用し、スーパー接着剤を使用してビブラトームトレイ左折1をマウントします。氷冷間切断緩衝液でビブラトームトレイを充填し、95%O 2および5%CO 2でそれを飽和保つ。
  3. 300μmの厚さで冠状または矢状線条体の脳切片をカット。通常、4から5の冠状、または6から7矢状の線条体切片を収集することができる。
  4. その後のrecordi室温でそれらを格納する前に34℃で温めスライス保持ビーカーにスライスを移し、30分間そこにそれらを保つNG。
  5. の[Ca 2+] i 画像化の前に少なくとも30分間室温で酸素記録バッファ内の脳切片をインキュベートする。

3.免疫組織化学(IHC)

  1. 二週間、ウイルス注射後、PBSをPBS中の10%ホルマリンで経続いマウスを灌流する。
  2. 、取り外し一晩後固定し、そして少なくとも2日間、バッファリングされた30%スクロース中の脳をcryoprotect。
  3. クリオミクロトームを用いて40μmのセクションを準備します。
  4. 10分間隔でセクションをPBSで3回すすいでください。
  5. 10%正常ヤギ血清を含むPBS中で1時間インキュベートし、0.5%トリトンX-100で切片をインキュベートする。
  6. 0.5%トリトンX-100を含むPBS中で調製した一次抗体で4℃で一晩切片をインキュベートする。以下のように用いた一次抗体であった:ニワトリ抗GFP 1:1000マウス抗S100β1:400、マウス抗NeuNの1:600、マウス抗グルタミンシンテ1:300。
  7. 10メートルでセクションをPBSで3回すすぎ間隔で。
  8. 室温で2時間、10%正常ヤギ血清を含むPBS中で調製した二次抗体とともに切片をインキュベートする。次のように二次抗体は以下の通りであった:ヤギ抗マウスAlexa546、1:500、ヤギ抗ニワトリAlexa488で1:500。
  9. 、スライドガラス上のセクションをマウントし、乾燥し、退色防止封入剤を数滴を適用し、その後ゆっくりとガラスカバースリップでセクションをカバーしています。 4℃でスライドを保存してください。
  10. 1.3の開口数を40倍油浸レンズを共焦点顕微鏡で画像を撮影する。

4.共焦点の[Ca 2+] iのイメージング

NOTE:[Ca 2+] iの 0.8の開口数40X水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて行った撮像する。

  1. スライス後の1および5時間の間、所定の位置のスライス1の流速で室温で酸素記録バッファと記録チャンバーとsuperfuse中 - あたり2mlの分。その後、実験中に動きを最小限に抑えるために、スライスの上にナイロン弦の白金ハープを置く。
  2. 10X水浸対物レンズの下に明視野発光と背側線条体を視覚化し、検索します。
  3. 40X水浸対物レンズに切り替え、アルゴンレーザーの488nmのラインをオンにします。焦点面を変化させることで、細胞体、枝や小枝で基底蛍光を表示し、約20μmのスライス面の下に位置するセルを見つける。注目すべきは、損なわれた細胞は、通常は避けるべきで平均以上の蛍光レベルを表示する。
  4. スキャンを開始するには、 'フレームスキャン」モードを使用してください。通常、0.5に調整し、レーザ強度-最大出力の5%の[Ca 2+] iの CYTO-GCaMP3の画像のに十分である。アストロサイトの全領土での[Ca 2+] iの動態を監視するために、フレームあたり1秒のスキャン速度を持つ「フレームスキャン」または高速でrecommeですndedが、これは、問題の実験に応じて決定する必要がある。
  5. 視野全体で2アストロサイト- 1を監視するために3倍に-必要に応じて、画像には[Ca 2+]のプロセスでは、私は 、2のデジタル倍率を使用しています。
  6. 録音中に飽和画素を回避するために、細胞を疑似カラーには、 'ヒロ「ルックアップ·モードを使用します。常に赤い色は彩度の指標として表示されているかどうかをテストするために、約5分間、「パイロット録画」で始まります。その場合、レーザ出力パワーを下げるか、または下げるPMT /ゲイン/オフセット値を画素値をテストするために、別のパイロット記録を行う非飽和の範囲である。次のように一般的には、の[Ca 2+] iの線条体における撮像アストロサイトのために使用される組み合わせパラメータは次のとおりです。レーザ出力パワー0.5 - (10ミリワットの)5%、PMT 550から650ボルト、ゲイン2.0 - 3.5X、およびオフセット0 - 5%。

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Representative Results

線条体におけるCYTO-GCaMP3の星状細胞特異的発現のために、我々は以前に、堅牢GCaMP3およびレポーター遺伝子を駆動することが示されているアデノ随伴ウイルス(AAV)5血清型、およびGFAP GfaABC 1 Dプロモーター( 図1A)が 、使用海馬と皮質アストロサイト8,14で表現。二週間のマウスの線条体へのウイルスのマイクロインジェクション後、マウス(約10週齢)を灌流し、IHCは、線条体( 図1B)でCYTO-GCaMP3発現を評価するために、薄い脳切片上で実施した。我々は、GFP抗体を用いたCYTO-GCaMP3を検出しても知られて星状細胞マーカー、S100βでスライスを染色した。 CYTO-GCaMP3発現のみS100β陽性細胞が認められた。発現はアストロサイトに特異的な発現を示唆し、のNeuN( 図2Aおよび2B)で可視化ニューロンにおいて認められなかった。重要なことに、CYTO-GCaMP3発現は、S100β陽性細胞(Fiは~60%で検出されたグレ2C)。

アストロサイトは、軽度から重度15への潜在的な変化のスペクトルを表し、アストロサイトの反応性、として知られるようになった変更を表示することによって、そのような損傷、虚血や感染などの脳損傷に応答します。我々は、ウイルスのマイクロインジェクションは、明白なアストロサイトの反応を引き起こしたかどうかを評価しようとした。これは、以前にグルタミンシンテターゼ(GS)の減少した発現レベルは、反応性星状細胞16,17に関連していることが示された。したがって、GS WTの線条体における発現およびウイルスを注射したマウスを比較した。メトリックとしてGSレベルを使用する明白なアストロサイトの反応性がないことを示し、 -私たちは、ウイルス注射(C図3A)は、次の線条体アストロサイトにおけるGS発現における有意な変化は認められなかった。この一般的なアプローチは、反応性の他のマーカーを使用したアストロサイトの反応性を評価するために、将来の仕事に拡張することができる。しかし、GFAPレベルはstriatにおける反応性を測定するための適切な方法ではないことに注意してくださいアルアストロサイト、GFAPは基底条件の下で18最も線条体アストロサイトで検出可能なレベルで発現されていないため。要約すると、IHCを用いて、我々は、インサイト·GCaMP3発現は堅牢で線条体における神経膠星状細胞に特異的であり、GS発現レベルの変化によって評価されるように、そのウイルス注射は、アストロサイトの反応を引き起こさなかったと結論する。

私たちは、次の線条体アストロサイトでの[Ca 2+] iの画像にウイルスを注射したマウスから急性脳スライスを用意しました。急性厚さ300μmの矢状または冠状切片を調製し、回復期間後にスライスの[Ca 2+] iのアルゴンレーザーの488nmのラインを使用して画像化するための共焦点顕微鏡で記録チャンバーに入れた。彼らは明らかにふさふさした形態を有する細胞中で目に見える緑色の蛍光を示したように( 図4、 - (マウス当たり7スライス〜6)CYTO-GCaMP3を表現する線条体アストロサイトを簡単に線条体スライス(通常はすべての)ほとんどに特定することができた図4Aに示されている。 CYTO-GCaMP3を表示する少なくとも10個の星状細胞を画像化することができ、関心領域(ROI)として図4Aにプロットされている。 2.0の追加のデジタルズーム付き高倍率イメージング- 3.0は、単一のアストロサイト( 図4B)を識別することが必要であった。 図4Bに示すように、このような状況では、全体のアストロサイトの地域は、CYTO-GCaMP3発現によって明らかにした自発的Ca 2+のシグナルは容易に細胞体ならびにアストロサイト6の分枝及び小枝で測定した。

図1
図1:成体マウスの線条体へのAAV2 / 5によるGECIsのウイルス送達( 例えば CYTO-GCaMP3)。 A.回路図は、背外側線条体にAAV2 / 5マイクロインジェクションのためのプロトコルを示す。B.は、線条体との関係でマイクロインジェクション針と定位注射剤に用いられる座標のおおよその位置を表示します。パネルBにおけるニッスル染色したスライスの画像はALLEN BRAIN ATLASからダウンロードした。

図2
図2:CYTO-GCaMP3式は、線条体アストロサイトに特異的であった。 -そのCYTO-GCaMP3発現を示すB.代表的な画像は、アストロサイトのマーカー(S100β)、(B)と共局在はなく、ニューロンのマーカー(のNeuN)(A)と示されるもののような共局在化実験のためのC.要約棒グラフ。 ABである。

図3
図3:線条体アストロサイト内のCYTO-GCaMP3式は、GSの発現の変化を引き起こさなかった。- GCaMP3ためのAAV2 / 5を受けたマウスからGCaMP3およびGS IHCのB.代表画像。対照の非注射したマウスのための画像も示されている。C.棒グラフは、AとBのものとした実験からの結果をまとめたもので(ナノ秒、対応のないスチューデントのt検定、p <0.05を使用して有意ではないことを示す)。

図4
図4:CYTO-GCaMP3と線条体アストロサイトから記録された[Ca 2+] iの信号の代表的な例。 。.theのはショーの下にトレースした[Ca 2+] iの Aに示す10個のセルから5分間にわたって記録された信号Bと Aが平坦化し、ズームアップのz - A. Aは(10番号1)10アストロサイトを示すzスタック画像を平坦化ショー下記シングルastrocyte.Theトレース用-stack画像の[Ca 2+] iのシグナルは、Bに示した単セルを5分間にわたって記録した。

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Discussion

本明細書に記載の方法は、私たちは、その場で 、後続の[Ca 2+] iのイメージングのためのin vivoでの線条体アストロサイトにおけるCYTO-GCaMP3を表現することができました。この方法は、遺伝子組換えを使用して、またはノックイン実験的な実装および解剖学的特異性の標的タンパク質、迅速性と柔軟性の強固な発現を含むマウスに比べて利点を有する。 AAV2 / 5を使用してGCaMP3の発現を特異的かつ堅牢であることが見出された。血清型5のAAVとGFAP GfaABC 1 Dプロモーターの組み合わせは、特異性を達成することが重要です。ここに記載された技術の1つの制限は、ウイルス感染、および手術手順は、特に高力価ウイルス19、アストロサイトの反応を引き起こす可能性があることである。重要なことは、現在の研究では、相対的な低力価とのAAV2 / 5微量注入は、アストロサイトの反応性が19に関連しているGSの減少を引き起こさなかった。同じようなコントロールは、ヒップのために報告されているocampalアストロサイト8。しかしながら、アストロサイトが異種20であるため、それらはおそらく、脳の異なる領域において異なる機能を実行するため、少なからず、研究されるべき各脳領域のこれらのコントロールの必要性を強調することが重要である。

ウイルスのマイクロインジェクションを用いて標的遺伝子発現のロバスト性に影響を及ぼし得る重要な要因の1つは、異なるマウス系統および動物の発達的変化の間で変化する使用中の座標である。古い〜8週間のみC57BL / 6マウスを、この試験を通して使用した。 4週間注射後、その後9ヶ月間安定なままであった注射21ポスト -それはまた、ラットにおける線条体ニューロンおよびアストロサイトにおけるGFPのウイルス発現は、4日後に注射を検出2でプラトーに達することができたことが示されている。 CYTO-GCaMP3の発現の時間経過を正確にここで決定されていないが、ウイルス発現のための、少なくとも2週間である推奨される。

線条体アストロサイトにGECIsのAAV2 / 5媒介発現を使用するアプローチは、今より良いの[Ca 2+] i 線条体シグナリングアストロサイトを理解するために使用することができる。具体的には、CYTO-GCaMP3発現レベルは、星状細胞の小集団(約10細胞)における単一のアストロサイトの全地域内の[Ca 2+] i 信号のイメージングを可能にするために十分に高い。の[Ca 2+] iの信号の詳細な解析はまだ進行中ですが、今日までの[Ca 2+] iの信号は、遠くソーマ( 図4)から〜50μmの遠位のプロセスから検出されている。アストロサイトの[Ca 2+] iの信号および線条内でのそれらの相関及び原因の機能に関する詳細な実験が実現可能である。将来的には、洗練されたアプローチ( すなわち、プロモーター)は1ができるように、アストロサイトの遺伝的に定義された集団にGECIsを提供するために必要とされているアストロサイト20の多様な集団内カルシウムシグナル伝達を探る。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgements

仕事の大半は、関係職員は、NIH助成金NS060677によって、一部はNIHがMH099559と(BSKへ)MH10406​​9の補助金によってサポートされていました。作品の一部は、CHDI財団によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

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