Imaging Intracellulær Ca

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, R., Haustein, M. D., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (93), e51972, doi:10.3791/51972 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Astrocytter er allestedsnærværende og rikelig glialceller i hjernen. Det er godt etablert at astrocytter tjener avgjørende støtte og homeostatiske roller, inkludert bufring av K + konsentrasjon i det ekstracellulære rom, opptak av nevrotransmittere, så vel som å gi næringsstoffer. Men nyere studier viser at de også vise [Ca 2+] Jeg signaler, som oppstår spontant og er økt med nerveaktiviten en. Eksistensen av astrocyte [Ca 2+] i signalering har blitt stadig tenkt å utløse sin kommunikasjon med nerveceller, og som sådan har blitt tolket som en form for "Ca 2+ oppstemthet" innenfor astrocytter. De tilgjengelige data over de siste to tiårene foreslår to innstillinger der astrocytter og nevroner kan kommunisere, kanskje i en toveis måte. Først, astrocytter ofte reagere med en økning i [Ca2 +] når den aktiveres av nevrotransmittere ognevromodulatorer løslatt fra nevroner to. For det andre, [Ca 2+] Jeg øker i astrocytter føre til utslipp av signalmolekyler fra astrocytter som i sin tur kan påvirke nerveceller og blodårer. Tyder på at molekyler løslatt fra astrocytter føre til endringer i funksjonene til synapser, kretser og til slutt adferd 3-5 via astrocyte-til-nevron signalering. Men, dette er fortsatt en rask utvikling forskningsområde, og det har blitt hevdet at en bedre og detaljert forståelse av astrocyte [Ca 2+] Jeg er nødvendig for å løse noen av dagens usikkerhet 6.

I tidligere arbeid, ble det vist at ilegging av organiske Ca 2+ indikatorfarger i astrocytter unnlater å pålitelig oppdage [Ca 2+] Jeg signaler i hele astrocytter i kultur og in situ 7-10. Disse funnene har vært diskutert av oss og andre 6,11,12. Den lønnsommg bildet er at [Ca 2+] Jeg signaler innenfor astrocyttkulturer prosesser (f.eks, greiner og branchlets), som er de primære områder for samhandling med nevroner og blodårer, har sjelden blitt utforsket i detalj. Nylig har anvendelsen av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) som cytosolisk GCaMP3, GCaMP5G og GCaMP6 og plasmamembran forankrede versjoner (f.eks, Lck-GCaMP3) har tillatt studiet av [Ca2 +] signaler i små avdelinger av astrocytter slike som tynne prosesser, nær plasmamembranen, og i løpet av hele områder 7,8. Imidlertid GECIs har en ulempe i løpet av organiske Ca 2 + indikatorfargestoffer, og som er kravet til genetiske metoder for å levere de kodende genene selektivt til astrocytter in vivo i perioder på uker for GECIs å være hensiktsmessig uttrykt. Expression in vivo er vanligvis oppnås ved hjelp av transgene mus, knock-in mus eller med virus basert levering appKakerlakker. I den foreliggende Jove artikkelen rapporterer vi metoder og prosedyrer som brukes til å levere GECIs til striatale astrocytter hjelp adenoassosiert virus. Vi fokuserer på cytomegalovirus-GCaMP3 som et eksempel, men den samme grunnleggende prosedyren fungerer for hvilken som helst annen GECI eller fluorescerende protein basert reporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyre protokoller var i samsvar med det amerikanske National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved UCLA.

1.1) Forbered Mikropipette og AAV2 / 5 Virus Loading

  1. Bruk tynne borsilikatglass mikropipetter for injeksjon av viruset. Trekk mikropipette ved hjelp av en to-trinns trekking program med en vertikal avtrekker. Fas pipetten i en vinkel på 40 ° ved hjelp av en pipette kvern. Pipetten som er ideell for bruk, vil ha en spiss diameter på 20 - 40 um og en skaftlengde på 6 - 7 mm. Autoklav pipetten og kirurgiske instrumenter. Boret er sterilisert ved å tørke med 70% etanol.
  2. Oppbevar virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), ved -80 ° C i 10 pl aliquoter. Like før operasjonen, ta ut porsjoner ut av fryseren og lagre på is inntil brukt til å fylle the mikropipette.
  3. Fyll mikropipette med virus ved anvendelse av en sprøytepumpe. Tett koble en ende av et stykke slange, gjennom en passende dimensjonert rør kompresjonstilpasning, til en glassprøyte med en forsterket stempelet. Fest autoklavert mikropipette til den andre enden av den del av slangen gjennom en passende dimensjonert fjernbar nål kompresjonstilpasning.
  4. Før lasting av viral vektor, fjerne luftbobler fra pumpesystemet, inkludert rør, sprøyte og mikropipette ved å fylle systemet med mineralolje farget med Sudan IV rød (~ 1 mg / 50 ml) i en 1 ml sprøyte med en nål (27 G ).
  5. Plassere et rent stykke parafilm under glasset mikropipette, og dispenser 5 - 10 ul av den virale vektor på parafilm.
  6. Suck viral vektor ved å bevege stempelet bakover av sprøyten, ved 0,5 mL / min, og markere grensen mellom vektoren og oljen på glass pipette.

1.2) Anestesi, Hair Cutting, HEAD Fiksering og klargjøring for kraniotomi

  1. Sett en mus (P49-63, C57BL / 6) inn i kammeret fylt med N2 O og O 2, og 5% isofluran. Vurdere dybden av anestesi ved tap av målrettet bevegelse og en bremset respirasjonsfrekvens (~ 60-90 / min). Klippe håret på hodet når musen er bedøvet.
  2. Monter mus i stereotaxic ramme, med hodet sikret med sløv øre barer og snuten plassert inn en anestesi og ventilasjonsanlegg. Opprettholde kontinuerlig isofluran ved 2 - 3%. Påfør kunstige tårer salve til begge øynene siden mus mister sin blunkerefleksen under narkose.
  3. Administrer 0,05 ml Buprenorfin (0,1 mg / ml) ved subkutan injeksjon for smertelindring.
  4. Ren kirurgiske område med 10% povidon-jod og 70% alkohol tre ganger, vekslende mellom de to oppløsninger og starter med povidon-jod. Begynn forfra og tørk mot baksiden for å fjerne eventuelle allerede kuttet hår.
  5. Gjør et snitt i huden på toppen of hodet som starter mellom øynene og ender mellom ørene.

1.3) kraniotomi og Microinjections

  1. Fjern periosteum ved å sveipe med en bomullsdott og tørk overflaten av skallen med tann bomull baller. Lag et merke rundt injeksjonsstedet, og bore rundt kanten av merket ved hjelp av en liten stål Burr drevet av en høyhastighetsdrill.
  2. Fjern bein og rengjør overflaten med saltvann.
  3. Sett pipetten inn i venstre dorsal lateral striatum med følgende koordinater (mm): anterior-posterior 0,8, medial-lateral: 2,0, dorsal-ventral fra pial overflaten: -2,4 13. Legg merke til at disse koordinatene bety at tuppen av nålen mikroinjeksjon sitter like over dorsolateral striatum (figur 1A, B), noe som betyr at den bare trenger noe inn i denne kjerne. Unngå å skade blodkar. Hvis pipetten skjer for å være rett på en blodåre, litt justerekoordinater ved ~ 0,1 til 0,2 mm.
  4. Begynn injeksjon med injeksjonshastighet satt til 0,2 mL / min, og vanligvis injisere 1 til 1,5 mL av virus.
  5. La pipetten på plass etter injeksjon i 10 minutter, og deretter trekke pipetten langsomt.
  6. Avslutt ved å lukke operasjonssåret med kontinuerlig sutur ekstern nylon sutur.

1.4) Recovery

  1. Sett musen i et rent bur på en varmepute i 24 timer. Ikke returnere en mus som har gjennomgått kirurgi for å selskap med andre dyr før fullt restituert. Ikke la musen ubetjent før den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
  2. Legg Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml per 500 ml vann, inneholdende 40 mg trimetoprim og 200 mg sulfamethoxiazole) i vann i en uke. Administrer Buprenorfin to ganger per dag for inntil 3 dager etter operasjonen.
  3. Oppretthold musen på en 12 timers lys-mørke-syklusen, fôres og vannes daglig, ennd er vektet gang per dag opp til 3 dager etter operasjonen. I disse tre dager, blir en hvilken som helst mus med et tap på mer enn 10% kroppsvekt betraktes som kompromittert, og vil bli avlivet i stedet for å bli utsatt for eksperimentering.
  4. Separat, endrer museburet to ganger per uke, og overvåke for generell helse minst en gang per dag. Typisk blir musen brukes innen 2-3 uker etter at de stereotaksiske microinjections.

2. Akutt Brain Slice Forberedelse til Confocal Ca 2+ Imaging

2.1) Fremstilling av Cutting og Recording Solutions.

  1. Forbered skjære oppløsning bestående av (mM): 194 sukrose, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 D-glukose, 1 MgCl2, 1,2 NaH 2PO 4, og 26 NaHCO3, mettet med 95% O2 og 5% CO2.
  2. Forbered opptak løsning omfattende (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glukose, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2PO 4 NaHCO3; pH 7,3 til 7,4, 290-295 mOsm, mettet med 95% O 2 og 5% CO2. Fyll hjernen skive holder beger med opptaksløsning, og holde det ved 34 ° C.

2.2) Slicing

  1. To til tre uker etter stereotaksiske microinjections, dypt og terminalt bedøve musen, og deretter halshogge det.
  2. Pakk hjernen, og bruke en kniv for å fjerne uninjected høyre hjernehalvdelen, og monter den venstre på vibratome skuffen ved hjelp av superlim. Fyll vibratome brett med iskald cutting buffer, og holde mette det med 95% O 2 og 5% CO 2.
  3. Skjær koronale eller sagittal striatale hjernen skiver på 300 mikrometer tykkelse. Vanligvis 4-5 koronale, eller 6 - kan 7 sagittal striatale skiver samles.
  4. Overfør skivene til stykket holder begeret varmet ved 34 ° C, og holde dem der i 30 min før du lagrer dem i romtemperatur for påfølgende recording.
  5. Inkuber hjerneskiver i oksygenopptaksbuffer ved romtemperatur i minst 30 min før [Ca2 +] avbildning.

3. Immunhistokjemi (IHC)

  1. To uker etter virusinjeksjon, perfuse musen tran med PBS etterfulgt av 10% formalin i PBS.
  2. Fjern, post-fikse over natten, og cryoprotect hjernen i bufret 30% sukrose i minst to dager.
  3. Forbered 40 mikrometer seksjoner ved hjelp av en kryostat mikrotom.
  4. Skyll seksjoner 3 ganger med PBS ved 10 min intervaller.
  5. Inkuber seksjoner i 1 time i PBS med 10% normalt geiteserum og med 0,5% Triton X-100.
  6. Inkuber seksjoner over natten ved 4 ° C i primære antistoff fremstilt i PBS med 0,5% Triton X-100. De primære antistoffer ble brukt var som følger: Kylling anti-GFP 1: 1000, mus anti-S100β 1: 400, mus-anti-Neun 1: 600, mus-anti-glutamin-syntetase 1: 300.
  7. Skyll seksjoner 3 ganger med PBS på 10 mi intervaller.
  8. Inkuber seksjoner med de sekundære antistoffer fremstilt i PBS med 10% normalt geiteserum i 2 timer ved romtemperatur. De andre antistoffene var som følger: geit-anti-mus Alexa546 1: 500, geite-anti-kylling Alexa488 1: 500.
  9. Monter delene på glassplater, tørre og bruke flere dråper av antifade montering medium, deretter sakte dekke seksjoner med et glass dekkglass. Oppbevar lysbilder ved 4 ° C.
  10. Ta bilder på en konfokal mikroskop med en 40X oljeneddyppingsobjektivet objektiv med en numerisk apertur på 1,3.

4. Confocal [Ca 2+] i Imaging

MERK: [Ca 2+] i bildebehandling ble gjort ved hjelp av en konfokal mikroskop med en 40X nedsenking i vann objektiv med en numerisk blenderåpning på 0,8.

  1. Mellom 1 og 5 timer etter kutting, sted skive i opptakskammeret og superfuse med oksygenopptaksbuffer ved romtemperatur med strømningshastighet på 1-2 ml permin. Deretter plasserer en platina harpe med nylon strenger på toppen av stykket for å minimere bevegelse under forsøket.
  2. Visualisere og lokalisere rygg striatum med lyse feltet luminescens under en 10X vann nedsenking målsetting.
  3. Bytte til 40X vann nedsenking objektiv, og slå på 488 nm linjen i Argon laser. Ved å endre fokusplanet, finne celler lokalisert ca 20 mikrometer under skive overflaten, viser basal fluorescens i Soma, grener og branchlets. Av notatet, kompromittert celler vanligvis vise fluorescens nivå over gjennomsnittet, noe som bør unngås.
  4. Bruk "ramme scan" -modus for å starte skanningen. Vanligvis laserintensiteten justert til 0.5 - er tilstrekkelig til å bilde [Ca2 +] med cytomegalovirus-GCaMP3 5% av den maksimale effekt. For å overvåke [Ca 2+] Jeg dynamikken i hele territoriet til astrocytter, den "ramme scan" med en skanning hastighet på 1 sek per ramme eller raskere er å anbefalnded, men dette må avgjøres avhengig av eksperimentet i spørsmålet.
  5. Hvis det er nødvendig, til bilde [Ca 2+] i i prosesser, bruker digital forstørrelse av 2 - 3 ganger for å overvåke 1-2 astrocytter i hele synsfeltet.
  6. For å unngå mettet piksler under opptak, bruke "HiLo 'lookup-modus for å pseudocolor cellene. Start alltid med en "pilot-opptak" i ca 5 min, for å teste om rød farge vises som indikasjon på metning. Hvis ja, senk laser utgangseffekt, eller senke PMT / Gain / offset verdier og utføre en annen pilot opptak for å teste pikselverdier er i den ikke mettet rekkevidde. Vanligvis de kombinerte parametrene som brukes for avbildning astrocyte [Ca 2+] i i striatum er som følger: laser utgangseffekt 0,5 til 5% (av 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gain 2.0 - 3,5X, og offset 0 - 5%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For astrocytt spesifikk ekspresjon av cytomegalovirus-GCaMP3 i striatum, brukte vi adenoassosiert virus (AAV) av serotype 5, og GFAP GfaABC 1 D-promoteren (figur 1A), som tidligere er blitt vist til å drive robust GCaMP3 og reportergen uttrykk i hippocampus og kortikale astrocytter 8,14. To uker etter virusmikroinjeksjon i mus-striatum, ble musen (~ 10 uker gamle) og perfundert IHC ble utført på tynne hjerneseksjoner for å evaluere cytomegalovirus-GCaMP3 ekspresjon i striatum (figur 1B). Vi oppdaget CYTO-GCaMP3 hjelp GFP antistoffer og også farget skivene med kjent astrocyte markør, S100β. Cyto-GCaMP3 uttrykket ble bare funnet i S100β positive celler. Ingen ekspresjon ble funnet i nerveceller visualisert med Neun (figur 2A og 2B), noe som tyder astrocytt spesifikk ekspresjon. Viktigere, ble CYTO-GCaMP3 uttrykk oppdaget i ~ 60% av S100β positive celler (Figur 2C).

Astrocytter svare på hjerne fornærmelser som skade, ischemi og infeksjon ved å vise endringer som har blitt kjent som astrocyte reaktivitet, som representerer et spekter av mulige endringer fra mild til alvorlig 15. Vi søkte å vurdere om virus mikroinjeksjon forårsaket utilslørt astrocyte reaktivitet. Det ble tidligere vist at reduserte uttrykk nivåer av glutaminsyntetase (GS) ble assosiert med de reaktive astrocytter 16,17. Derfor ble GS-ekspresjon i striatum av WT og virus injiseres mus sammenlignet. Vi fant ingen signifikante endringer i GS uttrykk i striatale astrocytter følgende virus injeksjon (figur 3A - C), som indikerer ingen utilslørt astrocyte reaktivitet bruker GS nivåer som en beregning. Denne generelle tilnærmingen kan utvides i det videre arbeidet for å evaluere astrocyte reaktivitet bruker andre markører for reaktivitet. Vær imidlertid oppmerksom på at GFAP nivåer ikke kan være en egnet måte å måle reaktivitet i striatal astrocytter, fordi GFAP ikke uttrykkes ved detekterbare nivåer i de fleste striatale astrocytter etter basale forhold 18. I sammendraget, ved hjelp av IHC konkluderer vi CYTO-GCaMP3 uttrykk var robust og spesifikke for astrocytter i striatum, og at virus injeksjon forårsake ikke astrocyte reaktivitet som vurderes av GS uttrykk nivåendringer.

Vi neste forberedt akutte hjerneskiver fra virus injisert mus til bilde [Ca 2+] i i striatale astrocytter. Akutte 300 um tykke sagittale eller koronale snitt ble fremstilt, og etter en periode med utvinning skivene ble plassert i en opptakskammeret på et konfokalt mikroskop for [Ca2 +] avbildning ved bruk av 488 nm linjen i en Argon-laser. Striatale astrocytter uttrykker CYTO-GCaMP3 lett kunne identifiseres i de fleste (vanligvis alle) av de striatale skiver (~ 6-7 skiver per mus), som de viste synlig grønn fluorescens i celler med tydelig buskete morfologi (Figur 4 figur 4A; minst 10 astrocytter viser CYTO-GCaMP3 kan avbildes og er plottet i figur 4A som Regions of Interest (ROI). Høyere forstørrelse bildebehandling med en ekstra digital zoom på 2,0 til 3,0 var nødvendig å identifisere enkelt astrocytter (Figur 4B). Under disse omstendigheter ble det hele astrocyttkulturer områder åpenbart av cytomegalovirus-GCaMP3 uttrykk, som vist i figur 4B. Spontane Ca 2 + signalene ble enkelt målt i somata så vel som i de grener og branchlets av astrocytter 6.

Figur 1
Figur 1: Viral levering av GECIs (f.eks CYTO-GCaMP3) ved AAV2 / 5 inn i voksen mus striatum. A. Skjematisk illustrerer protokollen for AAV2 / 5 microinjections inn dorsolateral striatum.B. Viser den omtrentlige posisjonen til nålen mikroinjeksjon i forhold til striatum og de ​​stereotaksiske koordinater benyttes for injeksjoner. Bildet av en Nissl-farget skive i panel B ble lastet ned fra ALLEN BRAIN ATLAS.

Figur 2
Figur 2: Cyto-GCaMP3 uttrykk var spesifikke for striatale astrocytter. A - B. Representative bilder som viser at CYTO-GCaMP3 uttrykk colocalizes med en markør for astrocytter (S100β) (B), men ikke med en markør for nevroner (Neun) (A) C. Oppsummering søylediagram for colocalization eksperimenter som de viste. i A og B.

Figur 3
Figur 3: Cyto-GCaMP3 uttrykk innen striatale astrocytter ikke føre til endringer i uttrykket av GS.A - B. Representative bilder av GCaMP3 og GS IHC fra mus som hadde fått AAV2 / 5 for GCaMP3. Bilder til kontroll ikke-injiserte mus er også vist. C. Søylediagrammets oppsummerer resultatene fra eksperimenter som de i A og B (ns indikerer ikke signifikant ved hjelp av en uparet Student 's t-test, p <0,05).

Figur 4
Figur 4: Representative eksempler på [Ca 2+] Jeg signaler spilt inn fra striatale astrocytter med cytomegalovirus-GCaMP3. A. En flatet z-stack bilde som viser 10 astrocytter (nummerert 1 - 10) .Den spor nedenfor viser [Ca 2+] Jeg signaler registrert over 5 min fra de 10 cellene vist i A B. En flat og zoomet inn z. -stack image for en enkelt astrocyte.The spor nedenfor viser [Ca 2+] isignaler registrert over 5 min for enkelt celle vist i B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som er beskrevet her har tillatt oss å uttrykke CYTO-GCaMP3 i striatale astrocytter in vivo for påfølgende [Ca 2+] i bildebehandling i situ. Denne metoden har fordeler fremfor å bruke transgene eller knock-in mus, inkludert robust uttrykk for målrettet protein, hurtighet og fleksibilitet av eksperimentell implementering og anatomisk spesifisitet. Ekspresjonen av GCaMP3 ved hjelp AAV2 / 5 ble funnet å være spesifikk og robust. Kombinasjonen av GFAP GfaABC 1 D-promoteren med AAV av serotype 5 er kritisk for å oppnå spesifisitet. En begrensning av den teknikk som er beskrevet her er at virus-infeksjon, og fremgangsmåten kirurgi kan føre astrocytt reaktivitet, spesielt med høy titer 19 virus. Viktigere, i denne studien, AAV2 / 5 microinjections med en relativ lav titer ikke forårsake nedgang i GS som har vært assosiert med astrocyte reaktivitet 19. Lignende kontroller har blitt rapportert for hippocampal astrocytter 8. Det er imidlertid viktig å understreke at det er nødvendig av disse kontrollene for hvert hjerneområde som skal undersøkes, ikke minst fordi astrocytter er heterogene 20, og fordi de sannsynligvis utføre forskjellige funksjoner på forskjellige regioner av hjernen.

En av de viktigste faktorene som kan påvirke robustheten av målrettet genuttrykk ved hjelp virus mikroinjeksjon er koordinatene i bruk, som varierer mellom ulike musestammer og endringer over utviklingen av dyrene. Bare C57BL / 6 mus av ~ 8 uker gammel ble brukt i denne studien. Det har også blitt vist at viral uttrykk for GFP i striatale nevroner og astrocytter hos rotter kunne påvises fire dager etter injeksjon, nådd et platå ved 2 - 4 uker etter injeksjonen, og deretter holdt seg stabilt i 9 måneder etter injeksjon 21. Tidsforløpet for CYTO-GCaMP3 uttrykk er ikke nøyaktig fastsatt her, men minst to uker for virus uttrykk eranbefales.

Tilnærmingen for å bruke AAV2 / 5 mediert ekspresjon av GECIs i striatale astrocytter kan nå brukes til å bedre forstå astrocytt [Ca2 +] signalering i striatum. Nærmere bestemt er cytomegalovirus-GCaMP3 ekspresjonsnivået tilstrekkelig høy til å muliggjøre avbildning av [Ca2 +] i små signaler populasjoner av astrocytter (~ 10 celler) og i løpet av hele områder av enkelt astrocytter. Detaljert analyse av [Ca 2+] Jeg signaler pågår fremdeles, men hittil [Ca 2+] Jeg signaler har blitt oppdaget fra distale prosesser så langt som ~ 50 mikrometer unna soma (figur 4). Detaljerte eksperimenter på astrocyte [Ca 2+] Jeg signaler og deres korrelative og årsaks funksjoner innenfor striatum er gjennomførbare. I fremtiden, raffinerte tilnærminger (dvs. arrangører) er nødvendig for å levere GECIs til genetisk definerte populasjoner av astrocytter, slik at man kanutforske kalsium signale innenfor ulike bestander av astrocytter 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgements

Flertallet av arbeidet og involvert personell ble støttet av NIH stipend NS060677 og dels ved NIH tilskudd MH099559 og MH104069 (til BSK). Noe av arbeidet ble også støttet av CHDI Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syringe Pump Harvard Apparatus 704506
Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Narishige PC-10
Micropipette grinder Narishige EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 Addgene 44331 a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe BD 309628
syringe needle BD 305109
AAV2/5 virus UPenn vector core NA
Sudan red IV Sigma-Aldrich 67386
Mineral oil CVS Pharmacy 152355
Cryostat Leica CM3050 S
Stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit FOREDOM K.1070
Paraformaldehyde Santa cruz biotechnology sc-281692
Super Glue Krazy®Glue KG925
Microslicer Ted Pella DTK-Zero 1
Confocal microscopes Olympus FV300 and FV1000
Normal goat serum Vector S-1000
chicken anti-GFP Abcam ab13970
mouse anti-s100β Sigma-Aldrich S2532
mouse anti-NeuN Millipore MAB377
mouse anti-glutamine synthetase Millipore MAB302
goat anti-mouse-Alexa546 Invitrogen A11003
goat anti-chicken-Alexa488 Invitrogen A11039
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5J
Mounting Medium Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  2. Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
  3. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  4. Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
  5. Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
  6. Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
  7. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
  8. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
  9. Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
  10. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
  11. Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
  12. Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. Waltham, MA. (2012).
  14. Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
  15. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
  16. Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
  17. Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
  18. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
  19. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
  20. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
  21. Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).

Comments

1 Comment

  1. What kind of drug you use to anesthetize the mouse before decapitation? Thank´s

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2016 - 6:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics